?
Extracto
nicotina ejerce sus efectos oncogénicos a través de la unión a los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) y la activación de las vías aguas abajo que bloquean la apoptosis y promueven la neo-angiogénesis. Los nAChR del subtipo α7 están presentes en una amplia variedad de células cancerosas y su inhibición por neurotoxinas veneno de cobra se ha propuesto en varios artículos y críticas como una potencial terapia innovadora cáncer de pulmón. Sin embargo, debido a que parte de los resultados publicados recientemente fue retirado, creemos que la actividad antitumoral de las neurotoxinas del veneno de cobra necesita ser re-evaluado de forma independiente.
Se determinó la actividad de a-neurotoxinas de
Naja atra gratis (neurotoxina de cadena corta, α-cobrotoxin) y
Naja kaouthia gratis (de cadena larga neurotoxina, α-cobratoxin)
in vitro fotos: por mediciones de citotoxicidad en líneas celulares de cáncer de pulmón 5, mediante el ensayo de formación de colonias con α7nAChRs expresar y no líneas celulares que expresan y
in vivo
evaluando el crecimiento del tumor en un diabético no obeso /inmunodeficiencia combinada severa ortotópico (
NOD SCID
/) modelo de ratón sistema que utiliza diferentes esquemas de tratamiento y dosis.
No se observó una reducción estadísticamente significativa en el crecimiento tumoral en los grupos de tratamiento en comparación con el control para ambas toxinas. Paradójicamente α-cobrotoxin de
Naja atra
mostraron la tendencia a mejorar el crecimiento del tumor aunque, incluso en este caso, no se alcanzó la significación estadística.
En conclusión nuestros resultados muestran que, en contraste con otros informes, el nAChR inhibidores de la α-cobratoxin de
N. kaouthia Opiniones y α-cobrotoxin de
N. atra ni
suprimió el crecimiento tumoral ni prolongó la supervivencia de los animales tratados
Visto:. Alama A, C Bruzzo, Cavalieri Z, Forlani A, Utkin Y, Casciano I, et al. (2011) La inhibición de la acetilcolina nicotínico Receptores por veneno de la cobra α-neurotoxinas: ¿Existe una perspectiva en el tratamiento del cáncer de pulmón? PLoS ONE 6 (6): e20695. doi: 10.1371 /journal.pone.0020695
Editor: William C. S. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: Diciembre 10, 2010; Aceptado: May 7, 2011; Publicado: 13 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Alama et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación proporcionada por el Ministerio de Sanidad italiano (www.salute.gov.it/) y la Fundación Compañía de San Pablo, Torino (www.compagniadisanpaolo.it/). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
las evidencias experimentales que sugieren que la neurotransmisión estimulador o inhibidor está implicado en el desarrollo del cáncer, la progresión y en la respuesta a la terapia se han acumulado de forma constante [1]. De hecho, los componentes de tabaco regulan funciones celulares relacionadas con la transformación celular y están involucrados con la adicción al tabaco y la predisposición al cáncer de pulmón y el desarrollo mediante la interacción directa con receptores de acetilcolina nicotínicos neuronales y no neuronales (nAChR) [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. La nicotina se ha limitado el cáncer de pulmón iniciar capacidades, pero puede sostener el crecimiento del tumor y promover la diseminación metastásica a través de sus propiedades anti-apoptóticas y neoangiogenic [2], [7], [12].
La expresión de nAChR en células no neuronales del pulmón, y en particular en el epitelio de las vías respiratorias, refleja las múltiples funciones esenciales ejercidas por el sistema colinérgico en el desarrollo pulmonar normal y la función [13], [14]. A este respecto, se ha propuesto que la función de nAChR en el cáncer de pulmón puede ser similar a la de los receptores de estrógeno en cáncer de mama ya que en ambos casos la estimulación inapropiada de los receptores contribuye al desarrollo del cáncer [15]. En vista del alto nivel de expresión de ciertos subtipos de nAChR en células de cáncer de pulmón en comparación con el tejido no afectado circundante [16], [17] y de apoyo evidencias experimentales [18], [19], [20], [21] , se planteó la hipótesis de que los antagonistas del nAChR, y, en particular cobra a-neurotoxinas, podrían ser explotados como potenciales agentes terapéuticos [22], [23], [24]. Sin embargo, el conocimiento limitado de la funcionalidad y de los efectos a largo plazo de la estimulación de estos receptores en las células del cáncer [2], [25], [26] y, sobre todo, la reciente retracción de un informe de sustentación, los efectos antitumorales Cobra de α-neurotoxinas
in vitro
y
in vivo
[27] renders cuestionable la focalización de los R-nic con estas toxinas para el tratamiento del cáncer de pulmón.
el veneno de cobra está constituido por muchos polipéptidos con múltiples actividades tóxicas. Entre estos, las toxinas tres dedos-(TFT) son los componentes principales y están representados por alfa-neurotoxinas y citotoxinas. Las a-neurotoxinas se unen a nAChR con diferente especificidad y afinidad: toxinas de cadena corta (60 a 62 residuos de ácido amino, puentes disulfuro) 4 nAChR bloque de tipo muscular, mientras que las toxinas de cadena larga (66 a 75 residuos de ácido amino, enlaces disulfuro 5 , estando presente en el bucle central polipéptido) además de nAChRs de tipo muscular el quinto enlace bloque también los receptores neuronales [28], [29]. Como ejemplo de las toxinas de cadena corta, α-α-neurotoxina llamada COBR * o * toxina del
Naja atra
veneno de cobra puede mencionarse. El director de la α-neurotoxina de
Naja kaouthia
veneno de cobra llamada α-COBR * a * toxina es un ejemplo de las toxinas de cadena larga. Las toxinas de cadena corta son estructuralmente relacionado con las citotoxinas que matan de forma no selectiva las células [30].
Durante la revisión de la literatura sobre los efectos antitumorales de α-cobratoxin [18], [19], [20], [21], [22], [27] nos dimos cuenta de que los distintos informes presentados encontraron diferencias importantes en la dosis de la toxina utilizada para los
in vivo
experimentos, en el número de células inyectadas y sobre la supervivencia de ratones. También la presencia de la α7 nAChR en la línea celular utilizada para los estudios in vivo era incierta, ya que resultados contradictorios están presentes en la literatura [22], [31]. Además, puesto que parte de los datos se retrae con ninguna motivación específica [27], nos pareció necesario volver a evaluar las propiedades anticancerígenas de neurotoxinas cobra
in vitro
y
in vivo en
un modelo animal clínicamente relevante de cáncer de pulmón [18] para aclarar si estas toxinas podrían considerarse el prototipo de una nueva clase de productos naturales con propiedades antitumorales como se propone [15], [22], [24].
resultados y Discusión
Expresión de α7 nAChR en las células A549 y A549-luc
la interacción entre α-cobratoxin y el receptor nicotínico α7 [32] fue una de las evidencias experimentales detrás de la lógica de la utilización de toxinas de veneno de cobra como agentes contra el cáncer [22]. Aunque este receptor se expresa en una amplia gama de tejidos y líneas celulares, una encuesta reciente de la literatura [22], [31] informó de datos contradictorios sobre la expresión de este receptor en la A549, la línea celular utilizada para la
In
vivo y la mayor parte de la
in vitro
ensayos contra el cáncer en α-cobratoxin. Por lo tanto, como un paso inicial para verificar la actividad de α-cobratoxin en el CPNM, se realizó un estudio semicuantitativo RT-PCR y qPCR para demostrar la expresión de la α7 nAChR en líneas celulares de cáncer de pulmón 5. Tres de las líneas celulares utilizadas en el presente estudio (A549, H1650 y SK-MES 1) eran los mismos de la serie original de los experimentos [18], [19], [20], [27]. Como se muestra en la Figura 1, Panel A, el receptor nicotínico α7 era fácilmente detectable en A549, H1650 y SK-MES 1 pero no en H1975 y análisis CALU 1. El qPCR confirmaron la presencia de diferentes cantidades de la nAChR mRNA α7 en A549, H1650 y SK-MES 1 (Figura 1, panel B). De acuerdo con los resultados de RT-PCR, en H1975 y CALU 1 la α7 nAChR transcripción, utilizando la misma cantidad de ADNc usado para todas las líneas celulares, aparecido después del ciclo 40, un resultado que podría atribuirse o bien a un nivel extremadamente bajo de expresión o al ruido de fondo
a) semicuantitativo análisis alfa7 RT-PCR en el adenocarcinoma e líneas de células de carcinoma de células escamosas de NSCLC humano. expresión de GAPDH se utilizó como control interno para la integridad del mRNA y la cuantificación de ADNc. NCI-H1975 y Calu1 son negativos. C: No hay control de plantilla. B) qPCR alpha 7 expresión en las mismas líneas celulares. En eje y logaritmo natural (ln) del factor de cambio. NCI-H1650 se utilizó como calibrador, GAPDH como gen de referencia. Una ugr de ARN total fue retrotrascibed y se utilizó la misma cantidad de ADNc por muestra (2 ul) (Ct GAPDH comprendido entre 15,65 y 17,65). NCI-H1975 y Calu1 resultado negativo o con muy baja expresión debido a Ct & gt; 40. C) Análisis de transferencia Western para la alfa 7. PC12 se cargó como control positivo. la expresión de actina se utilizó como control interno.
La expresión de la α7 nAChR a nivel de proteínas fue confirmada por Western blot en células A549 y A549-luc (Figura 1, panel C).
se ha informado de que la estimulación de α7 nAChR en células de cáncer de pulmón resultados humanos en la regulación de este receptor [33]. Hemos probado la influencia de las alfa-neurotoxinas de
N. atra
y
N.kaouthia
en el nivel de α7 nAChR centrándose en A549 y A549-luc.
El análisis qPCR mostraron que el tratamiento con α-α-cobrotoxin o cobratoxin a una concentración de 0,003 M, la informaron IC
50 para α-cobratoxin en A549 [20], junto con concentraciones tres veces más baja (0,001 M) y tres veces más alto (0,009 M), no cambió sustancialmente el nivel de la expresión del receptor en estas líneas celulares (cambio de menos de dos veces, la figura S1).
efectos in vitro de cadena corta y larga alfa-neurotoxinas en las líneas celulares de cáncer
temprana
in vitro
experimentos sugieren que el efecto de α-cobratoxin depende de la dosis y que la alta selectividad y especificidad de esta molécula depende de la densidad de α7 nAChR [20], [21]. A este respecto, las células pulmonares no tumorales, así como otras células no afectadas primarias que expresan bajos niveles de receptores a7 fueron notablemente resistentes a la alfa-cobratoxin tratamiento [20].
Para evaluar la actividad citotóxica de α-cobratoxin, que se une de manera eficiente a la α7 nAChR (ver Materiales y Métodos) y la especificidad y selectividad de su acción, se realizaron ensayos de MTT con los de cadena corta y larga alfa-neurotoxinas en presumiblemente sensibles α7 nAChR-positivas y presumiblemente resistentes α7 nAChR-negativas líneas celulares. Las curvas de dosis-respuesta se elaboraron para evaluar la concentración de fármaco disminuye la supervivencia. Los experimentos iniciales de citotoxicidad se llevaron a cabo utilizando concentraciones de toxinas que en otras publicaciones se informaron para ser eficaz en líneas celulares de NSCLC de nAChR-positivo a7 pero no tóxico en las células normales (IC50: 0,003 M durante A549, 0,04 M de SK-MES 1 y 1 M durante H1650) [18], [20], [21], [22]. Sin embargo, a estas concentraciones no pudimos detectar actividad citotóxica apreciable y el IC50 No fue posible contactar con cualquiera de las dos toxinas (datos no presentados).
A concentraciones más altas (hasta 30 mM) de la α-cobrotoxin mostró una toxicidad dependiente de la dosis no limitada que se mantuvo esencialmente constante en un amplio intervalo de concentraciones en todas las líneas 5 celulares (Figura 2, Panel a) guía.
El NSCLC líneas de células A549, NCI-H1975, H1650, CALU 1 y SK-MES 1 se incubaron durante 72 horas con α-cobrotoxin (0,6 a 30 mM), panel superior, o α-cobratoxin (0,75 a 50 mM), panel inferior, y la toxicidad se midió con el ensayo de MTT colorimétrico. La IC50 se alcanza solamente con α-cobratoxin.
A altas concentraciones de la α-cobratoxin mostraron una toxicidad dependiente de la dosis clara (Figura 2, panel B). Sin embargo la concentración IC50 observado en nuestro estudio para el A549 y SK-MES 1 era de 2466 y 105 veces más alta que la reportada en una publicación anterior [20]. La diferencia fue mucho menor para H1650 (2,9 veces) resultado compatible con la utilización de una preparación de toxina diferente.
El efecto tóxico limitada de la cadena corta α-cobrotoxin podría explicarse por su incapacidad de unirse al receptor α7. Sorprendentemente sin embargo, la α-cobratoxin fue eficaz también en las células de nAChR a7-negativas que sugieren que la actividad tóxica no está mediada por la unión de la toxina al receptor α7
.
Para confirmar y ampliar esta observación hemos llevado a cabo un ensayo de formación de colonias con la α7 nAChR + A549 y con las líneas celulares nAChR-NCI-H1975 a7. Dado que no se alcanzó la IC50 con α-cobrotoxin, hemos utilizado las dos concentraciones más altas probadas por MTT (15 y 30 mM). Para α-cobratoxin hemos utilizado las concentraciones correspondientes a la IC50 para A549 y NCI-H1975 (7. 5 y 3 mM, respectivamente) y las concentraciones correspondientes a media y dos veces la IC50. Como se muestra en la Figura 3, la actividad clonogénico de las dos líneas celulares no se vio afectada por el tratamiento y por la presencia del receptor nach α7.
Las líneas de células A549 (α7 AChR +) y NCI-H1975 ( α7 AChR -) se chapada en 35 mm placas de Petri o en 24 pozos de placas a densidades de 150 (A549) y 300 (NCI-H1975) células /placa y se expone a cualquiera de cadena larga α-neurotoxina de
Naja kaouthia
, en concentraciones de 15 mM, 7,5 M, 3,8 M (A549) y 6 M, 3 M, 1,5 M (NCI-H1975), o de cadena corta de
Naja Atra
, a concentraciones de 30 M y 15 M (ambas líneas celulares). Las células tratadas se incubaron durante 7-10 días, hasta que las colonias visibles formadas.
La activación de la cascada de la apoptosis se consideró el efecto fundamental de la unión de la α-cobratoxin a la α7 nAChR [18 ], [20], [21], [22]. En vista de las grandes diferencias entre nuestros resultados y los publicados anteriormente con respecto a la dosis a la que se podría obtener la IC50 y la ausencia de una acción selectiva de α-cobratoxin en las células de nAChR positivo a7, tratamos de entender si la activación de la apoptosis se produce de hecho tras el tratamiento con α-cobratoxin por Anexina V-PI tinción de citometría de flujo. Se informó de que la inducción máxima de la apoptosis en las células A549 se podría obtener mediante el tratamiento con toxina 1 M durante 24 horas [18]. Hemos repetido el mismo experimento utilizando la misma metodología pero con concentraciones de toxina (1, 10 y 50 mM) que indujeron inibition crecimiento va de 5 a 87% en ensayos de MTT.
Como se muestra en la Figura 4, incluso a la concentración más alta muy pocas células (1-3%) presentó evidencias de apoptosis con células necróticas siendo prevalente.
las células se incubaron durante 24 horas con 1, 10 y 50 mM α-cobratoxin y la apoptosis se evaluó por Anexina tinción V-PI y la separación FACS. La apoptosis en las células no tratadas fue de 0,63% y en las células tratadas fue en el rango de 0,98 a 2,32%.
En general estos resultados sugieren que la muerte celular observada in vitro probablemente es el resultado de la necrosis en lugar de la activación de la vía apoptótica después de la unión de α-cobratoxin a su ligando específico.
In vivo
toxicidad de alfa-neurotoxinas
la toxicidad aguda de dosis crecientes de toxinas después de iv administración (como en M & amp; M) se evaluó en ratones CD1 sobre la base de los signos clínicos y de comportamiento. Los síntomas agudos desarrollaron dentro de los 15 minutos después de la inyección y se caracterizan sobre todo por el malestar general y dificultad respiratoria que restauró a las condiciones normales dentro de 60-180 minutos. Basado en el número de ratones CD1 muertas, después de la administración de cualquiera de α-cobrotoxin o α-cobratoxin y más de un período de observación de 14 días, se determinaron los valores de LD y el MTD identificados como 0,1 mg /kg para la α-cobrotoxin y 0,2 mg /kg para el α-cobratoxin como se muestra en la Tabla 1.
Es importante destacar que la DL50 para la α-cobrotoxin determinado en nuestro estudio (0,128 mg /kg) estaba en muy buen acuerdo con datos de la literatura (0,1 mg /kg: http://www.uniprot.org/uniprot/P60770). La LD50 observado para α-cobratoxin era 0,35 mg /kg, un valor en el mismo orden de magnitud de los datos de la literatura (0,1 mg /kg; http://www.uniprot.org/uniprot/P01391).
los informes sobre la toxicidad in vivo de α-cobratoxin son confusas y en la literatura reciente se ha observado que la concentración LD50 reportado en tres publicaciones diferentes de un mismo grupo se diferencia de 1.000 veces (0,15 mg /kg o 0,15 g /kg ) [18], [21], [22]. Los resultados obtenidos en el presente estudio son esencialmente de acuerdo con las de dos de los informes anteriores [18], [21] y, sobre todo, demostrar la actividad biológica
in vivo Red de nuestras preparaciones de la toxina.
la mitad de la MTD para cada toxina (0,05 y 0,1 mg /kg, respectivamente) a continuación, se utilizaron en uno de los dos protocolos de tratamiento diseñado para evaluar la actividad antitumoral in vivo de estas toxinas.
actividad antitumoral de a-neurotoxinas
Para evaluar la actividad antitumoral de ambas toxinas,
NOD /SCID
ratones fueron trasplantados de forma ortotópica con 0,5 × 10
6 células A549-luc humanos /en un volumen de 10 l de PBS en el pulmón derecho. Como marcador indirecto del crecimiento del tumor se midió la emisión de luz de las células A549 luciferasa-etiquetados; este sistema nos permitió seguir longitudinalmente cada animal y para controlar el efecto del tratamiento
.
Tras la evaluación de los implantes tumorales, mediante la detección de IVIS, los ratones fueron asignados aleatoriamente a uno de los grupos de estudio y el tratamiento iniciado hace 7 días después del trasplante ortotópico de acuerdo con los dos protocolos diferentes descritos en la Figura 5.
los ratones fueron inyectados con 0,5 × 10 6 células A549-luc humanos
. Al día 7, después de la determinación IVIS, los animales fueron asignados al azar y sometidos a tratamiento. Para el horario 1 los ratones fueron tratados con 1/1000 de la LD10 como se indica en [20] tres veces /semana durante tres semanas. Para el horario de los 2 ratones fueron tratados una vez a la semana con una dosis correspondiente a ½ MTD (determinado en el presente estudio) guía empresas
Protocolo 1:. 8 animales fueron asignados a recibir por vía i.v. 0,12 g /kg de toxina (1/1000 de la LD
10 se indica en [20]), tres veces a la semana durante tres semanas acuerdo con un programa previamente informado [20] y 8 animales recibieron el vehículo solo.
Protocolo 2: 8 animales se trataron iv una vez a la semana durante tres semanas con de 0,05 mg /kg de α-cobrotoxin o 0,1 mg /kg de α-cobratoxin (correspondiente a medio-MTD). Para α-cobratoxin la media MTD corresponde a 12,8 M, una concentración que
in vitro qué debería matar a entre el 50 y el 63% de las células A549. Ocho animales de control recibieron el vehículo solo.
En otra publicación [18], donde se utilizó el cronograma del protocolo 1, la dosis α-cobratoxin reportado fue de 0,12 mg /kg. Sobre la base de nuestra
in vivo
determinación de la toxicidad en que consideramos esta dosis demasiado alta para ser administrada durante tres días consecutivos a ratones con función respiratoria comprometida
.
Después de una evaluación inicial de crecimiento del tumor en el día 7, la actividad antitumoral inducida por las toxinas se evaluó en ratones tratados y no tratados, en días 14, 21 y 28 después de la administración en ambos protocolos. Hemos observado que en las etapas iniciales de crecimiento, la bioluminiscencia de los animales representado estrechamente el grado de crecimiento del tumor. Por el contrario, en etapas posteriores, necrosis tumoral y reducción de la perfusión, probablemente disminuido la emisión de luz en ratones incluso cuando el tumor había invadido por completo la cavidad torácica y, en la mayoría de los casos, se había extendido fuera del tórax.
El pre evaluación del tratamiento IVIS de los 56 ratones incluidos en el estudio en el día 7 mostraron el crecimiento del tumor con éxito en todos los animales a pesar de un 300 veces la variabilidad individual (promedio de emisión de fotones: 5,5 × 10
7 /ratón, rango de 6,68 × 10
5-2,06 x 10
8). Por lo tanto, para el análisis de datos, hemos considerado la tapa de cambio de emisiones entre los animales tratados y no tratados en cada punto de tiempo de tratamiento (14, 21 y 28 días) en lugar de los valores de emisión de fotones absolutos [18].
en la Figura 6, se presenta la determinación de IVIS prima en cada uno ratones tratados con α-cobrotoxin de acuerdo con el anexo 1 y en el grupo de control correspondiente. Como se muestra, no parece que este tratamiento tiene un efecto apreciable sobre el crecimiento tumoral en este modelo animal. La única diferencia notable aparente fue el número de animales muertos al final del período de observación (4 en el grupo de control y 2 en el grupo de tratamiento). Sin embargo, debe tenerse en cuenta que en este momento todos los animales tuvieron que ser sacrificados por razones éticas y que autopsia reveló que el tumor se había extendido fuera de la cavidad torácica en todos los ratones tratados y no tratados. Como se muestra en la Figura 7 también en las dosis más altas utilizadas en el plan de tratamiento de la Lista 2, el efecto de α-cobrotoxin como agente antitumoral fue insignificante, si la hay. Como para el plan de tratamiento horario 1, también estos animales se sacrificaron en el día 28 debido a los síntomas relacionados con el crecimiento de tumores. De hecho, en la autopsia a todos los animales presentan una cavidad torácica completamente invadido con tumores que se extienden fuera del tórax con independencia del régimen de tratamiento.
X designa los animales muertos.
X designa los animales muertos.
en la Figura 8 se informa que el promedio de veces de cambio de la emisión en los grupos de tratamiento y control de la lista 1 (panel a) y el anexo 2 (panel B). A pesar de la diferencia, evaluadas por la prueba de Mann-Withney, no alcanzó significación estadística (a excepción de la lista 1, día 14, p = 0,04), se observó un mayor emisión de golpear en el grupo de tratamiento con toxina con respecto al grupo de control. Este efecto fue dramáticamente evidente en el anexo 2 al día 28, si bien, la diferencia en la emisión de fotones no alcanzó significación estadística, probablemente debido al número limitado de animales de búsqueda
Panel A: Los ratones tratados con α- cobrotoxin de acuerdo al programa 1. Panel B: ratones tratados con α-cobrotoxin según el calendario previsto 2. Panel C: ratones tratados con α-cobratoxin acuerdo con los programas 1 y 2.
Las mismas pautas de tratamiento eran también se utiliza con la α-cobratoxin. Los resultados de esta serie de experimentos demostraron que esta toxina carece de actividad antitumoral evidente también. En la Figura 9, se presenta la determinación de IVIS prima para cada uno de los ratones tratados con α-cobratoxin acuerdo con los programas 1 y 2, mientras que en la Figura 8, panel C, mostramos el factor de cambio promedio de las emisiones en el control y ratones tratados. Como puede verse, el tratamiento no influye apreciablemente el crecimiento del tumor como la emisión de fotones en los ratones tratados era comparable a la de los controles en cada punto del tiempo. El número de animales que tenían que ser sacrificados por razones humanitarias antes del final del período de observación fue mayor en el control, en comparación con los ratones tratados. Sin embargo, debe señalarse que también en este caso, todos los animales en el día 28, presentaron un crecimiento tumoral masiva que se extendía fuera de la cavidad torácica con independencia del plan de tratamiento.
X designa los animales muertos.
los
in vivo
experimentos se llevaron a cabo sólo con la línea celular A549-luc ya que la utilización de la no-luc etiquetados células habrían requerido un gran número de ratones para evaluar la actividad antitumoral de la toxinas. En vista de los resultados obtenidos
in vitro
en 5 líneas celulares y
in vivo con
A549-luc hemos considerado poco ético que preceder con estudios en animales adicionales
La base molecular de cáncer de pulmón han sido ampliamente estudiados y la interacción entre la nicotina y nAChR ha sido reconocida como uno de los eventos clave que conducen al desarrollo de este tumor [2], [4], [5], [6], [7], [ ,,,0],8], [9], [10], [11], [16], [26]. Por lo tanto, no es sorprendente que los nAChR fueron considerados como buenos candidatos para los objetivos de terapias innovadoras "biológicos" [15], [22], [23], [24]. En este sentido, la existencia de potentes toxinas que inhiben los receptores nACh podría abrir la posibilidad de adaptar el concepto "bala mágica" del Paul Ehrlich para el tratamiento del cáncer de pulmón [34].
El veneno de serpiente cobra es una fuente de toxinas diferentes que poseen citolítica y nAChR que inhiben las actividades de [32], [35]. Debido a esta última actividad, la α-cobratoxin de
N. kaouthia
se ha propuesto como un agente terapéutico naturales innovador para el cáncer de pulmón [18], [19], [20], [22], [24] capaz de inhibir de manera espectacular de pulmón de crecimiento las células tumorales y para mejorar significativamente la supervivencia de pulmón de ratones portadores de tumores. Hemos vuelto a evaluar las actividades antitumorales de dos neurotoxinas cobra diferentes
in vitro Opiniones y
in vivo
que utiliza dos esquemas de administración y las mismas condiciones experimentales de los informes anteriores. Los resultados de nuestros experimentos muestran claramente que estas dos toxinas biológicamente activos tienen esencialmente ningún efecto sobre el crecimiento de células tumorales en
in vitro
ensayos in a la concentración informado en otras publicaciones. Se obtuvo una inhibición del crecimiento de células tumorales significativa en la concentración de α-cobratoxin demasiado alta para ser utilizado
in vivo
. Es importante destacar que a-neurotoxinas, en concentraciones utilizables
in vivo
, no inhibió el crecimiento del tumor ni eran capaces de prolongar significativamente la supervivencia en ratones portadores de un CPNM injertado ortotópica. De hecho, el
tuvo que ser interrumpido a los 28 días, o antes, en los animales experimentales tratados y no tratados por razones éticas ya que en todos los casos el tumor injertado había extendido fuera del tórax in vivo
experimentos. Estos resultados están en marcado contraste con los de otros estudios que informó de un aumento de la esperanza de vida de 93% en α-cobratoxin tratados frente a los ratones no tratados [20] y sugieren que cobra α-neurotoxinas tienen ningún efecto terapéutico potencial en el cáncer de pulmón.
queda por explicar por qué en un informe publicado en el mismo grupo todos los animales tuvieron que ser sacrificados por razones humanitarias en el día 29 [18] mientras que en otro estudio los animales, tratados de manera similar, se podría seguir hasta el día 170 [20 ], (revisado en [22]).
Sorprendentemente, se ha observado que la
in vivo
el crecimiento del tumor en los ratones tratados con α-cobrotoxin fue mayor que la de los grupos de control. Este hallazgo inesperado podría sugerir que aunque esta toxina no se une al receptor α7, la informaron subtipo predominante presente en las células A549, se podría activar la vía tumorigénicos dependiente de la nicotina a través de su unión a diferente nAChR (muy probablemente a receptor de tipo muscular) . Por lo tanto, esta toxina puede ser una excelente herramienta para la disección finamente las vías biológicas que presenten un nAChR
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
todos los detalles sobre:. Permisos , se reportan los reglamentos y bienestar de los animales en los "animales" sub-sección de esta sección Métodos
líneas celulares de tumor y preparaciones α-neurotoxina
La línea celular PC12 de feocromocitoma de rata, utilizado como control positivo para α7 nAChR expresión, las líneas celulares de adenocarcinoma de NSCLC humanos H1650 y H1975 se obtuvieron de la ATCC; el adenocarcinoma A549 NSCLC y las líneas celulares de carcinoma escamosas SK-MES 1 y Calu 1, se obtuvieron de nuestro repositorio institucional de la célula (ICLC, www.iclc.it). La línea celular A549-luc, modificado para expresar de forma estable la luciferasa, y se utiliza para
in vivo
estudios fue proporcionado amablemente por el Dr. J. W. Shay (H. Simmons Centro Integral del Cáncer de la Universidad de Texas, Dallas). El A549, A549-luc, SK-MES 1 y H1650 utilizado en el presente estudio tenía el mismo origen de los utilizados en otros trabajos publicados [18], [19], [20], [27]. Las células fueron cultivadas en RPMI 1640 con suero bovino 10%. (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italia).
La cadena corta α-cobrotoxin de
N. atra
(MW 6949 kDa) se obtuvo de Sigma (Milano, Italia). La DL50 en ratones del lote utilizado en este trabajo, determinado por la Compañía, fue de 0,09 mg /kg.
La cadena larga α-cobratoxin (MW 7821 kDa) se purificó a partir de
N. kaouthia
veneno como se describe [36]. El procedimiento consiste en: filtración en gel y de alto rendimiento de intercambio iónico y cromatografía de fase inversa y se utiliza para producir grandes cantidades de la toxina para los estudios de receptores [37]. La α-cobratoxin preparado por este método es totalmente activa e inhibió las corrientes inducidas por acetilcolina en
Xenopus
oocitos que expresan receptor de acetilcolina nicotínico α7 humano con IC
50 de 4,1 nM [38]. La actividad biológica del lote de toxina utilizado en este estudio se ensayó para determinar la capacidad para inhibir radiactivo unión al receptor nicotínico de acetilcolina α7 humana heteróloga expresada en células GH4C1 α-bungarotoxina. A los 20 nM α-α-cobratoxin inhibido bungarotoxina unión en más de un 50%.
Las toxinas liofilizados se disolvieron en la concentración madre de 10
-3 M en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se mantuvo a -20 ° C.
Western blot
Las suspensiones celulares se obtuvieron después de tripsinización de A549 o A549-luc y culturas PC12 (utilizado como control positivo). Las células se disolvieron en tampón de lisis y se procesaron como se describe anteriormente [39]. La concentración de proteína de lisados de células se determinó por la proteína Bio-Rad ensayo (Bio-Rad Laboratories, Segrate, Italia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Cincuenta mg de proteínas totales fueron separados en NuPAGE 4-12% bis-Tris gel (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italia) y después se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante iBlot ™ gel Tranfer Pilas (Invitrogen).
las transferencias se sondearon con el anticuerpo policlonal anti AChR α7 (Santa Cruz, Heidelberg, Alemania) y posteriormente con un anticuerpo monoclonal anti-ßActin (Sigma, Milano, Italia) comprobar que la misma cantidad de proteína se cargó en cada carril.
la inmunodetección se realizó mediante el aumento de quimioluminiscencia ECL kit () (GE Healthcare, Milano, Italia) siguiendo los procedimientos recomendados por el proveedor.
RT y qPCR análisis
el ARN total de A549-luc (sin tratar y tratadas con 1, 3 y 9 nM de α- cobratoxin o α-cobrotoxin para 72 h), A549 (sin tratar y tratadas con 1, 3 y 9 nM de α-cobratoxin), H1650, H1975, SK-MES 1, Calu 1 y de células PC12 líneas fue aislado utilizando el RNAeasy Mini Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. ARN fue tratado con RNasa libre de DNasa durante la purificación en columna. La integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel: relación de 28S a 18S fue de aproximadamente 02:01. RNA se cuantificó por espectrofotometría. La relación de las lecturas a 260 nm y 280 nm fue comprendida entre 1,9 y 2,1
.
Uno g de RNA total se usó para preparar cDNA con el superíndice ™ II RNasa H- Trascriptase inversa (Invitrogen) de acuerdo con la las instrucciones del fabricante.
Para determinar la presencia de α7 nAChR en las líneas celulares, ADNc se utilizaron en una reacción semicuantitativa como se describe en otro lugar [40], [41], [42].
las condiciones de PCR fueron:. 95 ° C durante 10 min, 45 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 55 ° C durante 15 seg y 72 ° C durante 30 segundos)
qPCR reacciones se realizaron utilizando Maxima SYBR Green qPCR Mix Maestro .