Extracto
En el presente estudio se evaluó la expresión del potasio activados por calcio de conductancia intermedia (KCa3.1 ) de canal en células madre similares a glioblastoma humano (CSC) y se investigó su papel en la motilidad celular. Mientras que el canal KCa3.1 no se expresa en los tejidos neuronal- y gliales derivadas de individuos sanos, tanto en el mRNA y la proteína KCa3.1 están presentes en la población tumor glioblastoma, y se han mejorado de manera significativa en células madre cancerosas derivadas de U87MG tanto línea celular establecida y una línea celular primaria, FCN9. De acuerdo con estos datos, las corrientes de voltaje independiente y TRAM-34 de potasio sensibles imputables al canal KCa3.1 se registraron en la línea celular murina GL261 y varias líneas de células de glioblastoma humanas primarias. Por otra parte, una corriente KCa3.1 significativamente más alta se registró en las células U87MG-CD133 positivas en comparación con la subpoblación negativo U87MG-CD133. Además, se encontró que la motilidad de las células del tumor se asocia fuertemente con la expresión del canal KCa3.1. El bloqueo del canal de KCa3.1 con el inhibidor específico TRAM-34 tiene, de hecho, un mayor impacto en la motilidad de células madre cancerosas (reducción de 75%), que expresan un alto nivel de canal KCa3.1, que en la población parental FCN9 ( reducción del 32%), donde el canal KCa3.1 se expresa en el nivel inferior. Resultados similares se observaron también con las células madre cancerosas derivadas de U87MG. Debido a la invasión de los tejidos circundantes es una de las principales causas de fracaso del tratamiento en el glioblastoma, estos hallazgos pueden ser relevantes para el desarrollo futuro de los medicamentos terapéuticos de cáncer
Visto:. Ruggieri P, G Mangino, Fioretti B, L Catacuzzeno , Puca R, Ponti D, et al. (2012) La inhibición de la actividad KCa3.1 Canales Reduce la motilidad celular en las células madre del cáncer de glioblastoma derivados. PLoS ONE 7 (10): e47825. doi: 10.1371 /journal.pone.0047825
Editor: Massimo Avoli, McGill University, Canada |
Recibido: 30 de mayo de 2012; Aceptado: September 17, 2012; Publicado: 22 Octubre 2012
Copyright: © Ruggieri et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Caja de Ahorros, Perugia (FF) y de COFIN-MIUR (Ministero della Ricerca e dell'Università Scientifica) 812.111 de 2007 (AC). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el glioblastoma multiforme (GBM) es el sistema maligna más común Nervioso central (SNC) de tumores en adultos, y el más difícil de curar a pesar de los avances en la cirugía y la terapia adyuvante [1]. Representa del 30 al 60% de los tumores primarios del sistema nervioso central, con una incidencia de 2 a 3 casos por cada 100 000 personas por año [2], [3]. Sólo el 30% de los pacientes con GBM viven más de un año después del diagnóstico, y la esperanza de vida media se mantiene aproximadamente 14-18 meses [4], [5]. El mal pronóstico para los pacientes con GBM no ha mejorado significativamente en las últimas décadas, sobre todo debido a las dificultades y desafíos en la detección y tratamiento de este cáncer mortal.
Varias propiedades de cáncer, incluyendo el glioblastoma, están influenciados por una regulación deficiente de iones canal de expresión o función [6] - [8]. La reducción de expresión rectificador interno canales de K [9] y el aumento de expresión de los canales de Na sensibles a amilorida [10], los canales de Cl activados por voltaje [11], y los canales BK [12] han sido reportados en varios gliomas, en comparación con los astrocitos normales. KCa3.1 canal de expresión también puede ser desregulado en el glioblastoma. El canal KCa3.1, también conocido como IK1, SK4, KCNN4, IKCA es un miembro de la familia del canal de potasio activado por calcio (KCA), con una conductancia unitaria de 20 a 60 pS en simétrica 150 mMK [13], [14 ]. Se distingue de los canales relacionados funcionalmente activados por calcio y potasio de mayor tamaño (100-200 pS; BK) y menor (2-20 pS; SK) conductancia unitaria por su farmacología, la biofísica y la fisiología [13], [14]. Los tres miembros de la familia de canales de KCa fueron mostrados por el grupo de Sontheimer que se transcribe en las células de glioma, aunque sólo los canales BK eran funcionales en el tumor, y su inhibición influenciadas fuertemente la migración celular in vitro [15]. Recientemente nuestro grupo informó de la expresión funcional del canal KCa3.1 en líneas celulares de glioblastoma y demostrado que estos canales tienen profundos efectos en la promoción de la migración celular, como se muestra por ensayo de migración transwell en presencia de bloqueadores de los canales KCa3.1 específicos [16]. Posteriormente, la expresión y la actividad funcional del canal KCa3.1 se estableció firmemente en dos líneas celulares de glioma y en las células de un cultivo primario [17]
.
La evidencia reciente sugiere que los glioblastomas son originarios de un grupo de stem- como las células que comparten propiedades en común con las células madre neuronales. stemness comportamiento y capacidad migratoria están estrechamente relacionados y regulado por vías de señalización comunes [18]. Sobre la base de estos datos nos propusimos investigar si los canales KCa3.1 están involucrados en el proceso migratorio de las células madre aisladas de similar primario derivado del tumor y líneas celulares permanentes. Encontramos una expresión pronunciada de canales KCa3.1 activamente funcionales en la fracción enriquecida de células madre con propiedades similares y que su bloqueo selectivo de la motilidad celular drásticamente inhibida.
Resultados
KCa3.1 Funcional los canales se expresa en la U87MG y líneas de células GL261
con el fin de determinar los niveles de ARNm KCa3.1 en las células cancerosas de glioblastoma, que mide su expresión por PCR en tiempo real en dos líneas celulares bien caracterizadas, el ser humano U87MG y el GL261 murino.
KCa3.1
mRNA se detecta claramente en ambas líneas celulares y se expresa en niveles más altos en comparación con los astrocitos normales humanos y murinos. Sus niveles eran 118.47 ± 14,6 veces mayor en el U87MG y 76,13 ± 16,52 en GL261 células (datos no presentados). El análisis de transferencia Western de lisados de células enteras, lleva a cabo para evaluar la expresión de la proteína, mostró una banda de ~48 kDa en ambas líneas celulares co-migran con el control positivo proporcionado por el productor de anticuerpos específicos (Figura 1A). La cantidad de proteína detectada en la KCa3.1 U87MG es claramente mayor en comparación con la observada a partir de la línea celular GL261. La densidad óptica (OD) de las mediciones de intensidad de la banda, después de la normalización, que se estima el nivel KCa3.1 en el U87MG a ser de aproximadamente 4 veces mayor que en el GL261. También se evaluó la frecuencia de células positivas en las dos líneas celulares mediante análisis de citometría (Figura 1B, C). El porcentaje de células positivas KCa3.1 era 72.66% en la línea celular U87MG y 37,51% en la línea celular GL261. El análisis por inmunotransferencia Estas frecuencias son relativamente alto si se compara con la de las células positivas KCa3.1 (2,82%) que se encuentran en los astrocitos adultos de ratón normal, tomadas como células de control (Figura 1D).
(A) de U87MG y GL261 mostró una expresión de canales KCa3.1 correlacionados con los niveles de transcripción. (B) (C) cytofluorimetric análisis de KCa3.1 en U87MG, GL261 y astrocitos adultos de ratón normal (NMA). Las células se incubaron con anti-KCa3.1 seguido por el anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con AlexaFluor488 como se informa en la sección de Materiales y métodos. Diez mil eventos fueron registrados y analizados con Cyflogic. histogramas grises: autofluorescencia celular; histogramas negros: AlexaFluor488 conjugado de cabra anti-conejo solos; histogramas verdes: anti-KCa3.1 (D) El tiempo típico curso de la corriente KCa3.1 partir de una célula GL261, grabado de curvas IV a 0 mV, en las condiciones de control, después de la aplicación de la CC-EBIO (100 M) + ionomicina ( 500 nM), y después de la aplicación de 3 M TRAM-34 en presencia continua de DC-EBIO + ionomicina. rampas de tensión se aplicaron cada 5 s. círculos rellenos son los puntos de datos obtenidos inmediatamente antes de las curvas IV que se muestran en el panel E. (E) curvas de Representante IV obtenidos mediante la aplicación de rampas de tensión -100 a 50 mV desde un potencial de mantenimiento de 0 mV, en condiciones de control (CTRL), siguiendo la aplicación de DC-EBIO + ionomicina, y después de la adición de TRAM-34 en presencia continua de DC-EBIO + ionomicina. (F) Media KCa3.1 densidad de corriente medida en el ratón NMA, como control, en líneas celulares de glioblastoma U87MG en GL261 y 0 mV, evaluado como la diferencia entre la densidad de corriente pico en DC-EBIO + ionomicina y la corriente residual después de la adición del tranvía 34 (círculos rellenos cf. en el panel D).
la expresión funcional de los canales KCa3.1 en U87MG y células de glioblastoma GL261 se verificó con las mediciones de patch-clamp en el conjunto de células perforado configuración. TEA (3 mM) y octanole (1 mM) estaban presentes en todas las soluciones para bloquear el BK y canales en ocasiones presentan diferencias, por lo general co-expresados con canales KCa3.1 en células de glioblastoma (ver Métodos, [16]). Un experimento típico que ilustra el protocolo utilizado para evaluar la corriente KCa3.1 se muestra en la Figura 1E y F. Las células se estimularon repetidamente con rampas de tensión -100 a 50 mV desde un potencial de mantenimiento de 0 mV, y la corriente KCa3.1 se evaluó aplicando primero el canal activador KCa3.1 /SK DC-EBIO (100 mM) más ionomicina (500 nM; DC-EBIO + ionomicina), y después añadiendo el inhibidor de canal KCa3.1 específica TRAM-34 (3 M) en la presencia continua de DC-EBIO + ionomicina. En ambas líneas celulares, después de la perfusión extracelular con DC-EBIO + ionomicina, se observó el desarrollo de una corriente independiente del voltaje con un potencial de inversión (media de -85 ± 3 mV para las células GL261, n = 3, y -82 ± 4 para las células U87MG, n = 4) cerca al potencial de equilibrio K en nuestras condiciones de grabación (-90 mV). La corriente inducida por ionomicina DC-EBIO + tenían en la mayoría de las células de una fase transitoria inicial que precede a una meseta sostenida. Tanto el transitorio y componentes sostenidos de hecho podrían ser atribuidos a la corriente KCa3.1, ya que nunca se observaron tras la aplicación de la CC-EBIO + ionomicina en células preincubadas-TRAM-34. La densidad de corriente media de KCa3.1 U87MG y GL261 células (transitoria, más sostenida, evaluados a 0 mV) fue de 16,2 ± 5,0, n = 18, y 11,5 ± 3,9, n = 7, respectivamente. Por el contrario, no se observó TRAM-34 sensible a la corriente activada por ionomicina + DCEBIO en astrocitos de ratón adulto normal (n = 7) (Figura 1G).
Inducción de neuroesferas y CD133 es seguido por la estimulación de la KCa3.1 canales de expresión, en la línea celular U87MG
a continuación trató de examinar la expresión y función de los canales KCa3.1 en las células U87MG cultivadas en medio de células madre permisiva. Cell acondicionado se evaluó con microscopía óptica y citofluorimetría mediante la verificación de la aparición de neuroesferas y CD133
+ células, que fueron monitoreados hasta tres semanas después (Figura 2A, B, C). CD133 es un marcador de la mayoría de las células madre como tumorales, especialmente en tumores cerebrales [19]. CD133
+ células acumularse hasta un máximo de 6,3% (Figura 2D) después de 10 días de acondicionamiento (U87MG-NS), y todavía fueron positivos después de 16 días (4,6%, datos no mostrados).
(A) imagen de microscopía de fase muestra células U87MG neurosphere subconfluentes y derivados de U87MG después de 7 (B) y 14 días (C) de suero acondicionado medio libre. (D) Análisis cytofluorimetric de CD133 en U87MG y U87MG-NS. Las células fueron teñidas con PE-conjugado anti-CD133 (1) o histotype anticuerpos emparejados como se describe en la sección Materiales y métodos. Diez mil eventos fueron registrados y analizados con Cyflogic. histograma gris: autofluorescencia celular; histograma negro: el control isotípico; histograma naranja: anti-CD133 (1) (E) El análisis por inmunotransferencia de U87MG y U87MG-NS mostró una expresión de canales KCa3.1 correlacionados con los niveles de transcripción. (F) El contraste de fases (arriba) e inmunofluorescencia (parte inferior) imágenes de las células U87MG-NS mecánicamente disociadas siguientes 30 minutos de incubación con el anticuerpo anti-CD133, que muestra CD133
+ y CD133
- células (indicado por grueso y flechas delgadas, respectivamente). (G) diagrama de barras que muestra las medias KCa3.1 densidad de corriente medido a 0 mV en CD133
+ y CD133
- células U87MG-NS. Los experimentos se realizaron como se describe en la leyenda de la Figura 1D-F. * Prueba de ANOVA, p. & Lt; 0,05
Con el fin de verificar las propiedades madre-como de U87MG-NS se realizó PCR en tiempo real para examinar la expresión de
nestina
y
Cambios GFAP.
en la expresión de
nestina
, un marcador de las células madre neurales, y
GFAP
, un marcador de astrocitos diferenciados, son indicativos de diferenciación
In vitro
de células madre como derivado de glioblastoma [1]. En comparación con U87MG sin tratar,
nestin
expresión se aumentó 2,68 ± 0,56 veces (p & lt; 0,001), mientras que
se encontró GFAP
a disminuir (0,516 ± 0,05, p & lt; 0,05). Estos resultados fueron confirmados por la tinción de inmunofluorescencia de la U87MG y U87MG-NS con anticuerpos contra CD133, GFAP, y nestina (véanse los datos suplementarios).
A continuación, examinamos la expresión de los canales KCa3.1 en U87MG-NS. La expresión de
KCa3.1
mRNA fue 2,02 ± 0,10 veces mayor que en las células no tratadas (p & lt; 0,001). También la cantidad de proteína KCa3.1 detectado en el U87MG-NS es mayor que en la U87MG (la relación OD es 1,8), como se espera de los altos niveles de mRNA (Figura 2E). El análisis electrofisiológico realizado en el CD133
+ células derivadas de U87MG-NS también demostró la mayor actividad de los canales en estas células. Específicamente, hemos realizado mediciones patch-clamp en cualquiera de las células negativas o positivas CD133, después de la tinción con anticuerpos anti-CD133 por inmunofluorescencia (Figura 2F). Como se muestra en la figura 2G, tanto las células muestran corrientes KCa3.1, tal como se evaluó mediante la aplicación del protocolo estándar en la configuración de célula completa. En particular, se encontró que CD133
+ células que expresan un nivel significativamente más alto de densidad de corriente KCa3.1 (21,3 ± 3,7 pA /pF, n = 7, frente a un 8,1 ± 3,5 pA /pF, n = 5, respectivamente; p & lt; 0,05).
el subconjunto de CD133
+ U87MG células expresan niveles más altos de
KCa3.1
ARNm
Dado que el principal objetivo de estos estudios es la em
KCa3.1
canal de expresión en las células tumorales del cerebro con propiedades similares a madre, que luego dirige nuestra investigación hacia CD133
+ subpoblaciones fraccionados de U87MG-NS. El uso de células de clasificación que hemos obtenido fracciones de células con hasta 32% de CD133
+ células (Figura 3) y con un nivel de
CD133
transcripciones más de 11 veces mayor (11,63 ± 3,23, p & lt; 0,001 ).
KCa3.1
nivel de ARNm en las fracciones enriquecidas en CD133, también ensayadas por PCR en tiempo real, era aproximadamente 4 veces más altos (3,99 ± 0,195, p & lt; 0,05). Que en subconjuntos empobrecido-CD133
análisis citofluorimétrico de condicionado U87MG-NS se realizó mediante tinción de las células con el anticuerpo anti-CD133 conjugado con PE como se informa en la sección material y métodos. Porcentaje de CD133
+ células antes (izquierda) y después del procedimiento de clasificación (panel de la derecha) se muestran en rojo. Diez mil eventos fueron adquiridos y analizados mediante el software FACS diva.
El KCa3.1 inhibidor específico TRAM-34 reduce la motilidad del U87 MG-NS
Hemos demostrado anteriormente que la modulación de los flujos de iones a través de canales de la membrana es esencial para la estimulación de la motilidad celular de glioblastoma. Desde TRAM-34 inhibe selectivamente la corriente de iones a través de los canales KCa3.1, hemos puesto a prueba la hipótesis de que el menoscabo de la corriente de iones con el tranvía-34 tendría un efecto en
in vitro
motilidad del U87MG-NS (evaluada por fibronectina transwell ensayos recubierto). Como se muestra en la Figura 4A, se encontró que TRAM-34 a una concentración de 1 y 3 M motilidad inhibida por 49,5% ± 21,52 (n = 10, p & lt; 0,001) y 65,4% ± 27,46, (n = 10, p & lt; 0,001 ), respectivamente.
(a) análisis cuantitativo de la invasión de células con cámara de Boyden ensayo recubiertos de fibronectina se describe en la sección Materiales y métodos. Diferentes concentraciones de TRAM-34 (1 y 3 M) inhibieron la motilidad celular en una forma dependiente de la dosis. La inhibición fue estadísticamente significativa en comparación con las células no tratadas (*** p & lt; 0,001). Las barras son la media ± SD. (B, C, D) campos microscópicos representativos de células madre como glioblastoma U87MG-NS que han migrado por 48 h a través de un filtro de tamaño de poro 8 micras en ausencia (B) y en presencia de 1 mM (C) y 3 M (D) TRAM-34.
KCa3.1 canales están ausentes en adultos saludable del cerebro y el cerebelo, pero altamente expresado en muestras de tumores de glioblastoma y derivado líneas celulares primarias
Para determinar si nuestros hallazgos podrían ser relevantes para el estudio de los tumores cerebrales, hemos ampliado nuestras investigaciones a la expresión de los canales KCa3.1 de los astrocitos humanos normales (CNS), secciones en parafina procedentes de tumores gliales humanos, y tres líneas celulares de glioblastoma humanas primarias (CRL8 , FCN9 y MZC12). Los niveles de expresión KCa3.1 diferían mucho entre las muestras investigadas. El factor de cambio medio con respecto a la ASN fue 318,9 ± 21,13 para CRL8, 176 ± 34.64 (FCN9) y 57,6 ± 2,4 (MZC12) (p & lt; 0,001) en las tres líneas celulares primarios (Figura 5A). La tinción inmunohistoquímica reveló que los canales KCa3.1 estaban ausentes en la materia blanca del cerebro normal, excepto para las células endoteliales de los vasos sanguíneos (Figura 5B), mientras que fueron altamente expresado en las secciones de tres tumores diferentes (Figura 5C, D, E). A astrocitoma de grado I se muestra en la Figura 5F con tinción positiva KCa3.1 confinada a zonas enriquecidas en nuevos vasos sanguíneos. En la Figura 5G una sección de tejido de pulmón normal se muestra como control positivo
(A) PCR en tiempo real en tres líneas celulares primarios humanos de los glioblastomas (CRL8, carril 1;. FCN9, carril 2; MZC12, carril 3) demostró que las transcripciones KCa3.1 expresión es mayor en comparación con NHA (carril 4). (B-G) La tinción inmunohistoquímica en el tejido cerebral humano normal reveló la presencia de proteínas KCa3.1 sólo en las células endoteliales de los vasos sanguíneos (B) mientras que se observó una tinción difusa en los tumores de alto grado (CRL8, C; FCN9, D, MZC12, E ) y una señal de KCa3.1 sólo en el área de la neo-vascularización (glio de bajo grado, F). Como control positivo se utilizó tejido pulmonar fisiológica (G). (H) curso de tiempo típica de la corriente registrada a -40 mV a partir de una célula FCN9 aplicando repetitivas (cada 5 segundos) las rampas de voltaje de -100 a +100 mV. 3 mM y 1 mM de TEA octanole se añadieron a bloquear el canal BK y en ocasiones presentan diferencias, respectivamente, por lo general co-expresada con canales KCa3.1 en células de glioblastoma (21; 22). DC-EBIO (100 mM) + ionomicina (0,5 M) y DC-EBIO + ion 3 M TRAM-34 se aplicaron en sucesión para verificar la expresión funcional de las corrientes KCa3.1 (texto cf). (I) las relaciones Representante I-V en presencia de DC-EBIO + ionomicina, y DC-EBIO + ionomicina + TRAM-34. Los datos de panel (H) y (I) son del mismo experimento.
El recuadro
: I-V relación de la corriente KCa3.1 obtiene restando las rampas de corriente registrados en la CC-EBIO + ion + TRAM-34 de la registrada en la CC-EBIO + iones. (L) Plot informar de la densidad de corriente en KCa3.1 0 mV (evaluado como en el panel I) medido en las tres líneas celulares de glioblastoma primarios. Dado que en varias células de una corriente de K dependiente de voltaje en la activación de los potenciales de membrana mayor que -20 mV estaba presente, en estos casos las mediciones de la densidad de corriente KCa3.1 se realizaron a -40 mV, y luego la densidad de corriente evaluado se extrapoló a 0 mV suponiendo una relación lineal de corriente-tensión. * Prueba de ANOVA, p. & Lt; 0,05
Estudios funcionales en primaria líneas celulares de glioblastoma
La expresión funcional de los canales KCa3.1 en las tres líneas celulares de glioblastoma primario se verificó con patch- medidas con la pinza en la configuración de célula entera perforada (Figura 5H, I, L). En todas las células ensayadas (CRL8, n = 8; FCN9, n = 5, y MZC12, n = 4) la corriente KCa3.1 fue identificado como la corriente hacia el exterior activada por perfusión extracelular de DC-EBIO + ionomicina, y se inhibe por el KCa3.1-canal selectivo inhibidor de TRAM-34 (3 M) (Figura 5H, I). Figura 5L, que muestra la densidad de corriente media KCa3.1 evaluado en las tres líneas celulares, indica que la línea celular CRL8 tiene una densidad significativamente mayor que las líneas celulares FCN9 y MZC12. Tenga en cuenta que a diferencia de las líneas celulares estables, en las células primarias se han tomado las corrientes KCa3.1 para la construcción de la trama a -40 mV en lugar de 0 mV debido a este voltaje más despolarizado una corriente significativa DRK dependiente de voltaje era a veces presentan que se inhibió con sensatez por la solución de activación KCa3.1 DC-EBIO + ionomicina. Por lo tanto, para permitir una comparación directa con las densidades de corriente KCa3.1 evaluados en líneas celulares de glioblastoma, los datos mostrados en la Figura 5L se dan a 0 mV. Los datos se obtuvieron por extrapolación ajuste lineal de la relación IV en el rango de voltaje de -100 /-40.
La motilidad de las subpoblaciones de células madre similares a derivados de líneas celulares primarias están fuertemente inhibida por TRAM-34
Última hemos examinado el
KCa3.1
la expresión del ARNm y la capacidad de migración en tratamiento TRAM-34 en una línea celular primaria (FCN9) y sus propiedades madre-como clonal derivada de subcultivo que ofrece (2B5) [ ,,,0],20].
KCa3.1
la transcripción del ARNm y la expresión de proteínas se encontraron para ser mejorada en 2B5 células en comparación con FCN9 (1,5 veces ± 0,2, p & lt; 0,05 para el ARNm, y ver la figura 6B para inmunotransferencia). Una diferencia significativa entre las dos líneas celulares también se encontró por citometría de flujo (a la intensidad de fluorescencia media de 1.061,97 y 1.716,37 para KCa3.1 se encontró en FCN9 y 2B5, respectivamente). El porcentaje de células positivas también fueron diferentes entre las dos líneas celulares (51,86% en FCN9 y 70,68% en 2B5). Además, la forma de histograma (es decir, una curva de Gauss bimodal superposición en 2B5 en comparación con una curva de Gauss en FCN9) revela la presencia en las células 2B5 de una subpoblación que expresan altos niveles de KCa3.1, que está ausente en FCN9 (Figura 6A). En conjunto, estos resultados indican que la 2B5 clon derivado de tallo como expresa niveles más altos KCa3.1 que las células parentales FCN9.
(A) análisis citofluorimétrico de KCa3.1 en FCN9 (panel superior) y derivan 2B5 clone (panel inferior). Las células se tiñeron con anti-KCa3.1 seguido de AlexaFluor488 conjugado de cabra anti conejo. Diez mil eventos fueron registrados y analizados con el software Cyflogic. histogramas Grey: autofluorescencia celular; histograma verde anti KCa3.1; histograma negro: AlexaFluor488 conjugado de cabra anti-conejo. (B) Análisis de inmunotransferencia de FCN9 y 2B5 mostraron una mayor expresión de canales que ofrecen propiedades en KCa3.1 madre-como subcultura clonal derivada (2B5). (C) Análisis cuantitativo de la invasión de células realizó en cámara de Boyden recubiertos de fibronectina, utilizando 3 M TRAM-34. Los resultados, representados como porcentaje de inhibición de la motilidad en comparación con las células no tratadas, fueron estadísticamente significativas (*** p & lt; 0,001). Las barras son la media ± SD.
Una reducción significativa de la motilidad fue inducida por 3 M TRAM-34 en ambas líneas celulares. Sin embargo, la reducción observada en las células 2B5 (75%) fue mucho mayor que en FCN9 células. (32%; Figura 6C)
Discusión
Junto con la mayoría de los tumores sólidos que consisten en células de cáncer heterogéneos como así como vasculatures, elementos del estroma y células inflamatorias [21], GBMs mostrar notable heterogeneidad intratumoral y la jerarquía celular. El aumento de la evidencia también apoya firmemente el concepto de que una subpoblación de células cancerosas en la masa tumoral tiene un mayor potencial para la iniciación del cáncer y la repoblación [22] - [27]. Estas células se conocen como células madre del cáncer (CSC) o células tumorales iniciadoras, ya que comparten varias propiedades críticas con células madre típicas, incluyendo la capacidad de auto-renovación, diferenciación multi-linaje, y la proliferación mantienen [28] - [31] . De acuerdo con la literatura reciente, las células madre de glioma también promueven radioresistance, la angiogénesis del tumor [32], [33] y la unidad metástasis [34]. Un problema importante con células GBM es su naturaleza altamente infiltrante. Como consecuencia, la invasión agresiva de las células de cáncer de GBM en el tejido normal del cerebro y la médula espinal a menudo impide la eliminación completa de las células tumorales [35]. La migración comienza cuando una célula responde a una señal externa que conduce a la polarización y la extensión de un "frente líder" en la dirección del movimiento [36]. aumento de la evidencia muestra que los canales iónicos son componentes necesarios de la compleja maquinaria responsable de la migración celular. En concreto, los canales iónicos hacen posible la migración a través de flujos osmóticos y la consiguiente contracción y expansión del cuerpo celular. Se encuentran tanto en el lado posterior de la célula y en la parte frontal que lleva, en el que se ejercen también un papel invasiva a través de la acidificación de la zona de ECM y la promoción de la actividad proteolítica de la metaloproteinasa [37]. La infracción de la arquitectura del epitelio homeostático, junto con la adquisición de un fenotipo migratorio, es un momento clave en la progresión tumoral de los tumores sólidos. Aún no está claro si es principalmente el componente de células madre del tumor, ya presentan propiedades invasivas en vivo, que adquiere el fenotipo migratorio [34]. El conocimiento limitado disponible sobre las propiedades migratorias de las células tumorales de glioma in vitro en relación con la actividad del canal KCa3.1. El canal KCa3.1 es predominantemente activo en el borde posterior de la célula [38] y facilita la inflamación celular y la disminución en las células tumorales durante la migración [37]. Además, el canal KCa3.1 ha estado involucrado en la respuesta migratoria solicitada por CXCL12, el ligando de quimiocina de CXCR4 [39]. Recientemente hemos demostrado que la inhibición densidad de corriente de ambos KCa3.1 y los canales de cloruro en U87MG impide casi por completo la migración sin afectar la proliferación [40]. Los canales iónicos se han investigado en células madre de diferentes tipos de tejidos normales, como los canales KCa3.1 en las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea de ratón [41]. Sin embargo, el conocimiento relativo a los canales de iones en células madre cancerosas se en lugar muy limitada [41]. Esto nos llevó a investigar la presencia y la función del canal KCa3.1 en células madre cancerosas de glioblastoma humano y cómo se relacionan con el fenotipo móvil en estas células.
En primer lugar, mostramos que las transcripciones de canal se expresan en KCa3.1 diferentes tipos de células en cultivo, como se establecen de forma permanente y líneas de células primarias. Los niveles registrados de Real-Time PCR son de hasta 118 veces mayor en el U87MG, 76 veces en el GL261, y 318.9, 176, y 57,6 veces en tres líneas de células primarias, en comparación con los astrocitos normales. diferencias menores pero igualmente importantes se han encontrado entre la células madre cancerosas y la contraparte de los padres en U87MG y la línea celular primaria FCN9. También se observaron diferencias en la intensidad de fluorescencia de anticuerpos KCa3.1 canal -bound y la fracción de células positivas, por primera vez, por citofluorimetrıa.
En el cerebro murino adulto normal la corriente KCa3.1 Basta ha informado en microglia activada [42], las células endoteliales capilares del cerebro [43], las células de Purkinje [44], y en una subpoblación de los astrocitos que participan en el acoplamiento neurovascular [45] - [47] [8]. En conjunto, estos datos sugieren que en el cerebro murino la expresión funcional del canal KCa3.1 se limita a las subpoblaciones de células astrocíticos específicos. En consecuencia, aquí informe que los astrocitos normales de ratón adulto prácticamente no expresan actual KCa3.1. Este hallazgo también es consistente con la muy baja fracción (alrededor de 2,5%) de células positivas KCa3.1 encontradas por análisis FACS en astrocitos normales. También se investigó la presencia de los canales de K activados por Ca por inmunohistoquímico en secciones de tejido de ambas muestras normales y tumorales humanos. El canal KCa3.1 presentado con una tinción difusa y fuerte sólo en las muestras de tumores de alto grado.
Canal expresión nos permitió examinar la cuestión de la función del canal KCa3.1 sobre la capacidad migratoria de células por realizar transwell ensayos de movilidad, en presencia y ausencia de un inhibidor específico del canal. No se observaron diferencias notables en la capacidad de migración bajo el efecto del inhibidor del canal KCa3.1, TRAM-34. En un trabajo anterior, se encontró que 3 M TRAM-34 inhibe la motilidad U87MG un 58,5% [40]. En este trabajo se muestra que la misma concentración de bloqueador de los canales reduce la motilidad del U87MG-NS, la subpoblación derivados de tallo como de U87MG, en un 66%.
Mediante el empleo de técnicas de patch-clamp también hemos sido capaces para sondear diferencias de actividad actuales entre CD133 fracciones positivas y negativas presentes en la población U87MG-NS. Esto nos permitió estimar una K actuales 2,6 veces mayor en el CD133
+ muestra. Aún más sorprendente fue la reducción de la motilidad 2B5 (-75%) bajo el efecto de TRAM-34 en comparación con la reducción observada en FCN9 (-32%). La caída observada en la motilidad y se correlaciona con los niveles de expresión de los canales KCa3.1 en las dos líneas celulares, debido a la mayor sensibilidad de 2B5 a TRAM-34. La correlación encontrado aparece más significativo a la luz del hecho de que el canal KCa3.1 es sólo uno de una serie de diferentes tipos de canales de iones que promueven la movilidad celular. En general, nuestros resultados muestran que la expresión de los canales KCa3.1 y función son más pronunciados en las poblaciones menos diferenciadas, lo que favorece un papel más influyente en el fenotipo de la motilidad.
La capacidad altamente invasiva in vivo es una característica de la madre Células. Por otra parte, también se ha planteado la hipótesis de que hay dos tipos de CSC, uno fijo y el otro móvil [48]. Esto plantea la cuestión de si la reducción del flujo de iones operado por TRAM-34 altera la motilidad de las células directamente o por medio de una señal que actúa sobre el interruptor fenotípica de estacionario a móvil, a través de una vía de reglamentación desconocido. Esta última hipótesis es atractiva a la vista de las observaciones muy recientes que muestran que el bloqueo del complejo del canal de sodio de la membrana de plasma inhibe la proliferación de células de glioma, además de la migración, y que lo más probable implica alteraciones en el programa de expresión génica a través de un mecanismo aún no resuelto [49]. También para los canales KCa3.1 no podemos excluir una relación entre la modulación de la actividad actual y la reprogramación de la expresión génica. Esta cuestión sigue sin resolverse.
Materiales y Métodos
Cultivos Celulares
El ratón establecido y líneas celulares de glioblastoma humano, (GL261 y U87MG) se cultivaron respectivamente en D-MEM F -12 y D-MEM medio (Invitrogen) suplementado con ácidos no esenciales 1% aminoácidos, 1% de L-glutamina, 100 IU /ml de penicilina, 100 IU /ml de estreptomicina y 10% de suero de ternera fetal (FCS, Flow Laboratories) a 37 ° C en un 5% de CO
2 atmósfera húmeda en el aire. Ratón y cultivos de glioblastoma humano U87MG GL261 y se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rochville, MD, EE.UU.). Astrocitoma primaria MZC12, CRL8 y FCN9 (grado IV de la OMS) se realizaron en un trabajo previo de nuestro grupo a partir de muestras tumorales de los pacientes [50]. Los detalles de la aprobación del comité institucional y el consentimiento informado de los pacientes son citados en la referencia anterior.