Extracto
El cáncer de pulmón es la forma más frecuente de cáncer. La tasa de supervivencia para los pacientes con cáncer de pulmón metastásico es de ~ 5%, por lo tanto, las estrategias terapéuticas alternativas para el tratamiento de esta enfermedad son muy necesarios. Estudios recientes sugieren que las rutas biosintéticas de lípidos, especialmente la síntesis de ácidos grasos y desaturación, son dianas moleculares prometedores para la terapia del cáncer. Hemos informado anteriormente de que la inhibición de stearoylCoA desaturasa-1 (SCD1), la enzima que produce ácidos grasos monoinsaturados (MUFA), afecta la proliferación de células de cáncer de pulmón, la supervivencia y la invasividad, y reduce drásticamente la formación de tumores en ratones. En este informe, muestran que la inhibición de la actividad de SCD en células de cáncer de pulmón humano con la pequeña molécula inhibidora SCD 11127 CVT-síntesis de lípidos reducida y la proliferación alterada mediante el bloqueo de la progresión del ciclo celular a través del G
1 /S frontera y por desencadenar la muerte celular programada. Estas alteraciones resultantes de SCD bloqueo estaban completamente invertidos por cualquiera oleico (18: 1 n-9), ácido palmitoleico (16: 1n-7) o el ácido cis-vaccenico (18: 1n-7), demostrando lo cis-MUFA son moléculas clave para proliferación de células cancerosas. Además, co-tratamiento de células con CVT-11127 y CP-640,186, un inhibidor de la carboxilasa de acetil-CoA específico (ACC), no potenció el efecto inhibidor del crecimiento de estos compuestos, lo que sugiere que la inhibición de la ACC o SCD1 afecta a un objetivo similar crítico para la célula proliferación, probablemente MUFA, el producto de ácido graso común en la vía. Esta hipótesis se ve reforzada por la observación de que el ácido oleico exógena revierte el efecto anti-crecimiento de los inhibidores de SCD y ACC. Por último, el ácido oleico exógeno restauró el nivel mundial disminución de los niveles de lípidos de células en las células sometidas a un bloqueo de la actividad de SCD, lo que indica que se requiere la síntesis de lípidos activo para el ácido graso mediada por la restauración de la proliferación en células SCD1 inhibida. En conjunto, estas observaciones sugieren que SCD1 controla la progresión del ciclo celular y la apoptosis y, en consecuencia, la tasa global de la proliferación de las células cancerosas a través de la activación mediada por ácidos grasos monoinsaturados de la síntesis de lípidos
Visto:. Hess D, Chisholm JW, Igal RA (2010) La inhibición de la actividad desaturasa StearoylCoA bloques de la progresión del ciclo celular e induce la muerte celular programada en células de cáncer de pulmón. PLoS ONE 5 (6): e11394. doi: 10.1371 /journal.pone.0011394
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 11 Abril, 2010; Aceptado: June 2, 2010; Publicado: 30 de junio 2010
Derechos de Autor © 2010 Hess et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la Facultad de Ciencias Biológicas y ambientales y el Johanna y Fundación Charles Busch, Universidad de Rutgers, y una beca de la portilla del Departamento de Agricultura de Estados Unidos. Gilead Sciences Inc. proporcionó CVT-11127 en apoyo de los estudios y JWC contribuyó científicamente para la interpretación de los datos y redacción del manuscrito. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. JWC es un empleado y accionista de Gilead Sciences Inc. (Palo Alto) y una inventor en una patente relacionada SCD y varias solicitudes de patente SCD.
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón de células es la causa principal de muerte por cáncer en el mundo desarrollado. La tasa de supervivencia a 5 años es de ~ 15% de los pacientes con cáncer de pulmón, y disminuye a ~ 5% en sujetos con cáncer metastásico [1], por lo tanto, se necesitan nuevos enfoques terapéuticos basados en nuevas dianas moleculares. En los últimos años, los estudios han revelado que la activación constitutiva de la biosíntesis de lípidos, especialmente la síntesis de saturados (SFA) y los ácidos grasos monoinsaturados (MUFA), es un evento crítico en la carcinogénesis [2], [3], lo que sugiere que las vías lipogénicos puede ser objetivos valiosos para la intervención cáncer. SCD es una familia de isoformas de desaturasa de ácido Δ9-grasos que convierte SFA en MUFA [4]. Dos isoformas están presentes en los seres humanos; SCD1, que se expresa en la mayoría de tejidos adultos, y SCD5, que está altamente expresado en los tejidos de embriones y cerebro adulto [5], [6]. Se ha demostrado que la transformación maligna en células de cáncer de pulmón se correlaciona positivamente con la actividad de SCD1 y la expresión [7]. Además cuando varias líneas celulares de cáncer se seleccionaron con una biblioteca de siRNA contra 3.700 genes para identificar dianas adecuadas para la inducción de la citotoxicidad y la muerte celular, SCD1 era uno de los principales objetivos identificados [8]. En las células de cáncer de pulmón, la abrogación de la expresión génica de SCD1 conduce a la síntesis de novo de lípidos deteriorada, un tipo reducido de proliferación celular, una pérdida de crecimiento independiente de anclaje y mayores tasas de apoptosis independiente de ceramida [9]. Estos resultados implican fuertemente SCD1 en la regulación de la proliferación, la invasión y la supervivencia de las células cancerosas.
SCD1 también juega un papel clave en la formación de tumores y el crecimiento. En ratones, el nivel de fondo de expresión de SCD1 se correlaciona con la predisposición a la carcinogénesis hepática; roedores con niveles más altos de SCD1 son más susceptibles a la inducción de cáncer [10]. Además, usando ratones atímicos "desnudos", hemos demostrado por primera vez que las células de cáncer de pulmón con niveles reducidos de SCD1 exhiben una alteración en la capacidad severamente por la formación de tumores y la progresión del crecimiento del tumor, lo que sugiere que SCD1 es un factor crítico en la tumorigénesis [11] .
Hemos informado anteriormente [9], [11], [12] que SCD1, mediante la conversión de SFA en ácidos grasos monoinsaturados, regula la lipogénesis de las células cancerosas por: i) mantener el CAC en su estado de activación, aunque la conversión de acylCoAs saturadas que son inhibidores alostéricos del CAC en ácidos grasos monoinsaturados; ii) la promoción de la defosforilación e inactivación de la AMPK, el sensor de combustible de células de cáncer principal que se dirige a ACC para la fosforilación /inactivación; y iii) la inducción de la activación de la ruta Akt, que activa la expresión de enzimas lipogénicos clave [3]. Si bien estos resultados apoyan claramente SCD1 como un regulador central de la lipogénesis en las células cancerosas, no explican completamente cómo interactúan SCD1 y la lipogénesis en la regulación de la mitogénesis de las células cancerosas y la transformación.
El objetivo del presente estudio fue investigar la papel de SCD1 en la modulación de la progresión del ciclo celular. El uso de un novedoso inhibidor de molécula pequeña de la actividad de SCD, se determinó que la inhibición farmacológica aguda de SCD1 en células pulmonares bloquea el paso del ciclo de las células de G
1 a la fase S e induce la entrada de las células en la muerte celular programada. Por otra parte, en las células incubadas con un inhibidor de molécula pequeña de ACC, una enzima lipogénica limitante de la velocidad que es modulada por los niveles de actividad SCD1, se observaron alteraciones similares en la proliferación celular. De acuerdo con la síntesis de ácidos grasos de ser la vía objetivo común, no hubo ningún efecto citostático sinérgico cuando las células se incubaron tanto con una ACC y el inhibidor de SCD.
Materiales y Métodos
Materiales
AG01518 fibroblastos de la piel humanos normales se obtuvieron de Coriell (Camden, NJ). células de adenocarcinoma de pulmón humano H460 eran de ATCC (Manassas, VA). medios de cultivo celular y otros reactivos de cultivo eran de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). [6-
3H] timidina era de American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, MO). Ultrafiltrado de suero bovino fetal (FBS), libre de ácido graso de albúmina de suero bovino (BSA), ratón anti-β-actina anticuerpo monoclonal, anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa, fosfatasa y inhibidor de la proteasa cóctel fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO ). Ciclina D1 y CDK6 anticuerpos eran de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). Los suministros de cultivo celular, placas de cromatografía en gel de sílice 60, y disolventes fueron de grado analítico de Fisher Scientific, (Morris Plains, Nueva Jersey). CP-640,186 fue amablemente donado por Donnie Owens, Pfizer.
Cultivo de células
Las células se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS, penicilina (100 U /ml), estreptomicina (10 mg /ml), 1% de ácidos no esenciales aminoácidos y 1% de solución de vitamina MEM (medio de crecimiento), a 37 ° C, 5% de CO
2, y 100% de humedad.
La proliferación celular ensayo
tasa de proliferación celular se determinó en los fibroblastos humanos normales y células cancerosas H460 mediante el ensayo de violeta cristal [12]. Brevemente, las células se fijaron con metanol, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en agua destilada y se enjuagaron tres veces con agua. El medio de contraste en las células teñidas se solubilizó en 10% de metanol, solución de ácido acético al 5% y se cuantifica por espectrofotometría a 580 nm. El valor de un bien en blanco se sustrajo en cada caso. Los resultados se expresaron como porcentaje de cambio en la proliferación celular con respecto a los valores de densidad óptica del control tratado con vehículo (100%). En estas células, la actividad de SCD1 sido abrogada por la incubación con el inhibidor de molécula pequeña SCD CVT-11127 [13]. A las concentraciones usadas en los experimentos, CVT-11127 inhibió la actividad de SCD1 más de 95% [12]. Las células también se trataron con 20 mM de CP-640,186, un potente inhibidor de la actividad de ACC [14]. Se incubaron las células con los inhibidores durante 48 h o más con el fin de permitir al menos una duplicación de la población. Para algunos experimentos, se añadieron los ácidos grasos exógenos complejados con BSA (proporción 02:01) a los medios de incubación.
Determinación de la distribución del ciclo celular
Con el fin de determinar la distribución de las poblaciones de células en diferentes fases del ciclo celular, las células H460 se trataron con 1 M CVT-11127, 20 M CP-640,186, o DMSO vehículo para 48 h. Los grupos de células se incubaron en paralelo con 100 mM ácidos grasos complejados con BSA. Al final de las incubaciones, se recogieron las células y se trataron con 50 l de RNasa I (1 mg /ml) y se tiñeron con 5 ul de yoduro de propidio (1 mg /ml). El porcentaje de células en fases del ciclo celular se analizó mediante fluorocytometry
Determinación de la apoptosis por el ADN ensayo de fragmentación de
Se realizó la determinación de la tasa de fragmentación de ADN como se describe por Scaglia & amp.; Igal [11]. Brevemente, el ADN en las células preconfluentes se marcó con 0,4 Ci [
3H] timidina en medio de crecimiento normal durante 24 h. a continuación, se retiró el medio, las monocapas de células se lavaron dos veces con PBS a 37 ° C y se dejó que las células crecer durante 24 h en presencia de 1 mM CVT-11127 o vehículo. Los grupos de células se complementaron con ácido oleico. Después del tratamiento, se recogió el medio que contiene las células apoptóticas persecución unifamiliares y el [
3H] se determinó la radiactividad en un contador de centelleo. Las monocapas de células se lisaron en PBS con 1% de Triton-X100 y 0,2 mM EDTA y sedimentaron por centrifugación. La radiactividad se cuantifica en el sobrenadante que contiene fragmentada [
3H] ADN, y en el sedimento que contiene el ADN celular intacta. El sedimento se lavó y se resuspendió en 1% de Triton-X100 y 0,2 mM EDTA. El porcentaje de [3H
] fragmentada ADN se estimó de acuerdo con el siguiente cálculo:. (Medio Chase DPM DPM + sobrenadante) /total de DPM
extracción de lípidos de la célula y el análisis
lípidos celulares se extrajeron siguiendo el procedimiento de Bligh & amp; Dyer [15]. Total de fosfolípidos y lípidos neutros individuales se separaron por cromatografía en capa fina (TLC) como se describe en Scaglia y Igal [7]. manchas de lípidos en la placa de TLC se tiñeron con vapores de yodo, fotografiados y su contenido relativo se cuantificó por densitometría óptica en el sistema de imagen digital Bio-Rad ChemiDoc utilizando el software QuantityOne.
Resultados
SCD1 controla el paso de las células H460 a través del G
1 /S frontera del ciclo celular
los estudios previos de nuestro laboratorio estableció que el agotamiento agudo y crónico de SCD1 en las células cancerosas se tradujo en la proliferación celular alterada [9], [ ,,,0],11], [12]. Para comprender mejor el mecanismo por el que la inhibición de SCD1 perjudica el crecimiento celular, las células de adenocarcinoma de pulmón H460 se incubaron con 1 M CVT-11127, un nuevo inhibidor de molécula pequeña de SCD1, en medios que contienen suero durante 48 h y la progresión del ciclo celular se analizó mediante el flujo de citometría (Fig. 1A). Se observó que la población de células en fase S se redujo ~ 75% con CVT-11127 de tratamiento en comparación con los controles tratados con vehículo, lo que indica que la inhibición de SCD1 se dirige específicamente a la progresión del ciclo celular en el nivel de la fase sintética . Un aumento concomitante de la población de células deficientes en SCD1 G
1 fase también se detectó, mientras que no hubo cambios en el porcentaje de células en G
2 /M fase. Sin embargo, en las células incubadas con el inhibidor de SCD en medio de suero deficiente, una disminución de ~ 50% en las células en G
2 /También se observó la fase M (datos no presentados), lo que sugiere que los componentes identificados de suero, posiblemente MUFA -Con lípidos, fueron capaces de mantener el paso de las células deficientes en SCD1 través de la mitosis. En general, estos resultados indican que las células de ciclismo con un bloqueo de la actividad de SCD1 no fueron capaces de progresar a través de las primeras etapas del ciclo celular. ácido oleico exógena invierte notablemente los cambios del ciclo celular producidos por la inhibición de SCD1 lo que demuestra la importancia crítica de ácidos grasos monoinsaturados a la progresión del ciclo celular.
En las células de cáncer de pulmón H460 tratadas con 1μM CVT-11127 (CVT) o DMSO durante 48 h, en presencia o ausencia de 100μM oleico (Ole), la distribución de células en fases del ciclo celular se determinó por fluorocytometry (A), los niveles de ciclina D1, CDK6 y β-actina se evaluaron por Western blot (B), y la tasa de apoptosis se determinó mediante los niveles de [
3H] timidina fragmentado marcado de ADN (C). *, P & lt; 0,05 o menos frente a células tratadas con vehículo; **, P. & Lt; 0,05 o menos frente a células tratadas con CVT, mediante la prueba de la t de Student
Los niveles de ciclinas y quinasas de mamíferos dependientes de ciclinas (CDK) fluctúan notablemente durante la progresión del ciclo celular. Las ciclinas D y CDK son factores clave en el paso del ciclo celular a través de G
1 fase, más allá del punto de restricción y en la fase S. Habiendo observado que la ablación farmacológica de SCD1 promueve una alteración en la progresión G
1 → S, determinamos los niveles de ciclina D1 y CDK6, en comparación con los controles tratados con vehículo. Hemos observado que después de tratar las células durante 48 h con el inhibidor de SCD1, las células cancerosas exhiben una marcada disminución en el contenido de tanto la ciclina D1 y CDK6 (Fig. 1B). La incubación de células SCD1-empobrecido con ácido oleico normalizó los niveles de ambas proteínas confirman que MUFA son moléculas cruciales en la regulación del ciclo celular
.
Dado que la capacidad de las células cancerosas para evadir la muerte celular programada también contribuye a la tasa de proliferación de células cancerosas, los efectos del ácido oleico en la restauración de la proliferación celular en presencia de un inhibidor de SCD1 puede ser debido, en parte, a la supresión de la apoptosis. Por lo tanto, se determinó la tasa de fragmentación de ADN, un marcador típico de apoptosis, en las células tratadas con CVT-11127 o DMSO durante 48 h en presencia o ausencia de 100 mM de ácido oleico. Como se muestra en la Fig. 1C, la fragmentación de ADN se incrementó en 2,2 veces en las células SCD1 mediante ablación en comparación con los controles, lo que indica que SCD1 es un factor de supervivencia clave en las células cancerosas. También hemos observado que el ácido oleico exógeno redujo el nivel de fragmentación de ADN en las células deficientes en SCD1 para controlar los valores, lo que sugiere que este ácido graso o un producto de ácidos grasos de SCD1 es esencial para la prevención de la apoptosis en las células cancerosas.
Cis la proliferación de células de rescate -MUFA afectada por la inhibición de SCD1
Hemos demostrado previamente que los efectos antiproliferativos de CVT-11127 (1 M) podrían invertirse por el ácido oleico [12]. Sin embargo, el efecto de otros ácidos grasos de productos de SCD no se ha investigado. En las células de cáncer de pulmón H460, encontramos que palmitoleico (16: 1 n-7) y cis-vacénico ácidos (18: 1n-7), como el ácido oleico revirtió completamente el efecto anti-proliferativo de CVT-11127 (Fig. 2A) . Sin embargo, cuando las células H460 se incubaron con o sin 1 CVT uM o DMSO durante 48 h en presencia de cualquiera de 100 M mirístico (14: 0), palmítico (16: 0), heptadecanoico (17: 0), o ácido esteárico (18 :. 0) (Fig 2B), se observó que todo el SFA, con la excepción de ácido heptadecanoico, un ácido graso no natural, aumenta el efecto anti-proliferativo del inhibidor de SCD, mientras que la SFA no tuvo ningún efecto antiproliferativo en las células tratadas con vehículo. Además, el efecto antiproliferativo de tanto la inhibición de SCD1 y ácido esteárico podría ser superado por la co-incubación con ácido oleico. En conjunto estas observaciones muestran claramente que ambos SFA endógenos y exógenos son citotóxicos en ausencia de cualquiera de SCD para producir ácidos grasos monoinsaturados o exógenamente añadido MUFA.
A, las células de cáncer de pulmón H460 se trataron con 1 M CVT-11127 (CVT ) o DMSO durante 48 h en presencia o ausencia de ácido palmitoleico 100 M cis-MUFA (Pol), ácido oleico (Ole) o cis-vaccénico de ácido; y la proliferación celular se determinó por tinción con cristal violeta. La proliferación se evaluó de manera similar en células H460 que fueron tratadas con 1 mM CVT-11127 (CVT) o DMSO durante 48 h en presencia o ausencia de 100 M SFA mirístico (Myr), palmítico (Pal), heptadecanoico (Hep), o esteárico ( ste) ácidos (B), o 250 Pal M, más o menos 250 M Ole o elaıdico (ELA) (C). Grupos de DMSO y células CVT tratados se incubaron con 2 mg /ml tunicamicina en presencia o ausencia de 100 mM de ácido oleico durante 48 h y se determinó el crecimiento celular (D). *, P & lt; 0,05 o menos, vs DMSO; **, P & lt;. 0,05 o menos versus control tratado con ácido graso, por la prueba de la t de Student
Como se muestra en la Fig. 2C, cuando las células se incubaron con CVT tratada o sus controles con 250 mM proliferación celular ácido palmítico se redujo aún más que en las células con un bloqueo en SCD1 y se incubó con 100 mM de ácido palmítico. Sin embargo, el efecto citotóxico de ácido palmítico muy alta se impidió completamente con ácido oleico pero sólo parcialmente con 250 mM del ácido elaídico trans-MUFA, lo que sugiere que sólo cis-MUFA son funcionalmente adecuado para contrarrestar el efecto citotóxico de los altos niveles de SFA.
para determinar si MUFA proporciona una amplia protección contra la citotoxicidad, se determinó la capacidad del ácido oleico para superar el efecto anti-crecimiento de tunicamicina, un compuesto que promueve el estrés celular y la apoptosis mediante la inhibición de la glicosilación de proteínas. Tunicamicina disminución de la proliferación celular en un 80% tanto en las células cancerosas tratadas con vehículo CVT y, mientras que la adición de ácido oleico fue incapaz de restaurar la proliferación de las células inhibidas-SCD1 (Fig. 2D). Esta observación pone de relieve que la acción protectora de SCD1 contra la citotoxicidad mediada por SFA en los resultados de las células cancerosas a partir de su actividad específica en la ruta biosintética de ácidos grasos y no actividad citoprotectora general.
El bloqueo de la actividad de SCD1 con CVT-11127 dañen la proliferación de las células cancerosas H460 pero no en fibroblastos humanos normales
En estudios anteriores hemos informado de que la proliferación de fibroblastos de piel humana normal no se veía afectada por la inhibición de la SCD [12]. Sin embargo, es posible que estas células son resistentes a los efectos de la inhibición de SCD y necesitan ser incubaron durante un período más largo de tiempo con el inhibidor o con una mayor concentración de inhibidor. Para observar el efecto del tiempo de incubación y la concentración de inhibidor, los fibroblastos humanos normales se incubaron durante 96 h, tiempo suficiente para garantizar al menos una duplicación de la población, con 1 y 2 M CVT-11127 en un medio que contiene 10% de FBS. Como se muestra en la Fig. 3A, la incubación con el inhibidor de SCD no afectó la proliferación de estas células. Sin embargo, condiciones similares bloquearon completamente (98%) el crecimiento de células H460 (Fig. 3B). Tanto las células normales y cancerosas se trataron con el inhibidor de SCD en medio de suero deficiente y el efecto del inhibidor de SCD en el crecimiento celular es independiente de la presencia de suero (datos no mostrados). El hecho de que los fibroblastos eran completamente insensibles al efecto citostático del inhibidor de SCD sugiere que las células no cancerosas tienen un requisito más pequeño para MUFA producida endógenamente que las células de cáncer de
.
El crecimiento celular se determinó en los fibroblastos humanos normales AG01518 (A ) en presencia de 1 y 2 M CVT-11127 en 10% de FBS DMEM o vehículo durante 96 h. células H460 (B) fueron tratadas con 1 mM CVT-11127 o vehículo durante 96 h. tasa de proliferación celular se evaluó mediante tinción con cristal violeta. *, P & lt; 0,05 o menos, vs DMSO; mediante la prueba t de Student.
Se requiere la síntesis de novo de lípidos activo para mediada por el ácido graso reversión del efecto antiproliferativo de la inhibición de SCD1
Nos han informado de que la inhibición de SCD1 reduce lipogénesis, al menos en parte mediante la inactivación de la enzima limitante de la velocidad lipogénica ACC-α y que la reducción de la lipogénesis puede contribuir a la baja la proliferación de células de SCD1 mediante ablación [12]. Para investigar la relación entre SCD1, ACC y la lipogénesis en la proliferación de células de cáncer, se trataron células H460 con CP-640,186, un inhibidor específico de la ACC, a una concentración de 20 mM que inhibe más del 95% de la actividad enzimática [14]. Como se muestra en la Fig. 4A, la incubación de células con el inhibidor de la ACC durante 48 h dio lugar a una disminución de ~ 30% en el número de células en comparación con controles tratados con vehículo. Esto está de acuerdo con estudios reportados anteriores [16], [17]. El efecto citostático de bloqueo ACC era reversible por tanto 100 M de ácido palmítico y 100 mM de ácido oleico (Fig. 4A), sugiriendo que la actividad ACC regula la proliferación celular mediante el suministro de ácidos grasos para la biosíntesis de lípidos. El efecto inhibidor del crecimiento de inhibición de la ACC fue causada por un bloqueo en la progresión del ciclo celular puesto que había una reducción significativa de la población de células en S y G
2 /M fases y un aumento concomitante de células en G
0 /G
1 con respecto a los controles (Fig. 4B). ácido oleico exógena tuvo un marcado efecto sobre la recuperación del perfil del ciclo celular de las células agotadas-ACC, similar al efecto sobre las células inhibidas SCD1 se refuerzan el concepto de que el propósito final del metabolismo de la activación concertada de ACC, FAS y SCD1 observado en las células cancerosas es la producción de ácidos grasos monoinsaturados.
células H460 de cáncer de pulmón fueron tratados con 1 mM CVT-11127 (CVT), 10 mM CP-640186 o ambos en presencia o ausencia de 100 mu M de ácido palmítico (Pal) o ácido oleico ( Ole) (A), y la proliferación celular se evaluó después de 48 h. Distribución de células en fases del ciclo celular se determinó por fluorocytometry en las células incubadas con CP-640,186 de más o menos 100 mM de ácido oleico y (B). proliferación de células cancerosas también se determinó tras el tratamiento con 1 mM CVT-11127 (CVT), 20 mM de CP-640,186, o ambos en presencia o ausencia de 100 mu M de ácido palmítico (Pal) o ácido oleico (OLE) (C), y en células tratadas durante 48 h con 1 M CVT-11127, 25-hidroxicolesterol o ambos, de más o menos 100 mM de ácido oleico (D). En todos los experimentos, las células de control recibieron volúmenes equivalentes de vehículo DMSO. *, P & lt; 0,05 o menos en comparación con DMSO; **, P & lt; 0,05 o menos en comparación con el control CVT-tratada, mediante la prueba de la t de Student
Curiosamente, co-tratamiento con CVT-11127 y CP-640186 no potenció el efecto inhibidor del crecimiento de. cada uno de estos compuestos, lo que sugiere que la inhibición de cualquiera de ACC o SCD1 afecta a un producto común de la vía. Desde SCD1 es más tarde en la ruta de biosíntesis de ácidos grasos, ácidos grasos monoinsaturados son el ácido graso esencial para la proliferación celular. De hecho, en las células incubadas con inhibidores de la ACC y SCD1 tanto, el ácido oleico fue capaz de restaurar completamente la tasa de proliferación celular bajo de células H460 para controlar los valores. Estos datos apoyan fuertemente la conclusión de que MUFA son el producto final funcional (s) de la biosíntesis de ácidos grasos que se requiere para el crecimiento de células de cáncer.
biosíntesis de lípidos en células de mamífero se controla por los factores de transcripción SREBP-1a y SREBP -1 quater, que son reguladores centrales de los ácidos grasos y la síntesis de fosfolípidos en células de mamífero [18], [19]. La inducción de la lipogénesis en células no transformadas y de cáncer humano requiere SREBP-1 de activación [20] - [22], por lo tanto, se determinó el efecto de la regulación por disminución de la lipogénesis por SREBP-1 inactivación en la proliferación celular. células H460 se incubaron con el inhibidor de SCD1 durante 48 h en presencia o ausencia de 25-hidroxicolesterol, un potente inhibidor de SREBP-1 de activación y la escisión por SCAP [19]. La incubación con 25-hidroxicolesterol solo no afectó a la proliferación de células de cáncer, sin embargo co-tratamiento de las células con el hydroxysterol y CVT-11127 promovió un efecto inhibidor del crecimiento más profunda que con el inhibidor de SCD1 solo, un efecto probablemente debido a una potenciación de los anti actividad -lipogenic de ambos inhibidores (Fig. 4D). En consonancia con nuestras observaciones anteriores, 100 mM de ácido oleico fue suficiente para superar los efectos citostáticos de tanto la inhibición de SCD1 y la inhibición de SCD1 combinado y regulación por disminución de la síntesis de lípidos, lo que confirma aún más la importancia tanto de la síntesis de lípidos y ácidos grasos desaturación por SCD1 en la prestación de los sustratos para el crecimiento de células de cáncer.
Finalmente, una prueba adicional de que la formación de lípidos activo es un paso clave en la regulación de la proliferación celular por SCD1 se obtuvo examinando el contenido relativo de los principales lípidos en las células sometidas a la inhibición de SCD1 y se trató con ácidos grasos exógenos. Como se muestra en la Fig. 5A, el bloqueo de SCD1 con CVT-11127 condujo a una reducción significativa de los principales lípidos neutros, CE y TAG, mientras que los fosfolípidos totales se reducen ligeramente. La incubación de células SCD1-empobrecido con 100 mM de ácido oleico aumentó de manera espectacular los niveles de TAG por 4,4 veces sobre los valores de control (Fig. 5B). La adición de ácido oleico restauró completamente el contenido disminuido de CE en las células deficientes en SCD1 (Fig. 5C), mientras que regresó niveles de fosfolípidos (Fig. 5D) para los valores de control. En conjunto, estas observaciones refuerzan la noción de que SCD1 determina la tasa de la progresión del ciclo celular y la muerte celular programada, y en última instancia, la proliferación de las células cancerosas mediante el mantenimiento de la síntesis de lípidos y activa la producción de cis-MUFA.
células H460 de cáncer de pulmón se trataron con 1 M CVT-11127 (CVT) durante 48 h en presencia o ausencia de 100 M de ácido oleico (Ole). Se extrajeron los lípidos totales de células, separadas por TLC y se tiñeron con vapores de yodo (A). Los niveles relativos de, triacilgliceroles (B), cholesterolesters (C), y fosfolípidos (D), se determinaron por exploración densitométrica. *, P & lt; 0,05 o menos, vs DMSO; **, P. & Lt; 0,05 o menos versus control CVT-tratada, mediante la prueba de la t de Student
Discusión
En estudios anteriores, se informó que la ablación genética y farmacológica de SCD1 severamente alteradas la capacidad de las células cancerosas para proliferar [12]. En el presente trabajo, proporcionamos nuevas pruebas de que SCD1 controla la velocidad de la mitogénesis de las células cancerosas mediante la modulación de la progresión del ciclo celular. Nuestra observación de que las células cancerosas tratadas con un inhibidor farmacológico de SCD1 son detenidos en el G
1 fase y que este efecto es restaurado por ácido oleico sugiere que se requiere la síntesis de ácidos grasos monoinsaturados en las primeras fases del ciclo celular. Además, la inhibición de la ACC y FAS, dos enzimas clave de la síntesis de ácidos grasos, provocó un bloqueo similar en la progresión del ciclo celular a través de la G
1 /S frontera [16], [23], [24] . Estas observaciones sugieren que se requiere una activación concertada de la síntesis de SFA y la posterior conversión de SFA en MUFA para proporcionar la maquinaria biosintética de fosfolípidos con sustratos MUFA para la síntesis de membrana nueva antes de o durante la fase de síntesis del ciclo celular. De hecho, los estudios elegantes por Jackowski [25], [26] reveló que la acumulación de nuevos fosfolípidos de las células en división es el producto de la síntesis elevada y la rotación que se produce durante el G
1 y S fases tempranas.
Nuestros datos también sugieren que SCD1 puede controlar la progresión del ciclo celular mediante la alteración de los niveles de ciclina D1 y CDK6, dos proteínas cuya expresión y de interacción son críticos para el paso del ciclo de las células a través de G
1 /S transición [27]. la actividad de SCD1 puede regular indirectamente el contenido de estas proteínas del ciclo celular mediante la modulación de GSK3, un objetivo corriente abajo de la ruta de Akt que aumenta la degradación de la ciclina D1 [28]. Hemos informado anteriormente de que la inhibición de la expresión de SCD1 inactiva Akt y aumenta la desfosforilación y la activación de GSK3. Los cambios en la composición bioquímica y por lo tanto las propiedades biofísicas de los dominios de membrana celulares pueden activar la transducción de la señal y de transcripción vías que modulan la mitogénesis [3]. Control de la SFA y MUFA equilibrio por SCD1 parece ser un modulador crítico de las señales de crecimiento en las células humanas [11], [12], sin embargo, los mecanismos por los que esta enzima coordina modificaciones en la composición lipídica de la membrana, las señales de la membrana de la derivada y sus efectos corriente abajo todavía no se entienden completamente.
Mientras que las células cancerosas se multiplican a través de la división celular persistente, el número de células en proliferación también se ve afectada por la tasa de muerte celular. Además de favorecer una mayor tasa de mitogénesis celular, aportar pruebas de que SCD1 es un factor importante de la supervivencia de las células cancerosas por ayudar a la célula evitan la muerte celular programada a través de la producción de cis-MUFA. la actividad de SCD1 puede prevenir la apoptosis de células de cáncer por al menos dos mecanismos: la protección contra la toxicidad o lipoapoptosis [11] mediada por SFA, [29], y la estimulación de la biosíntesis de cis-MUFA para la proliferación celular. síntesis de ácidos grasos constitutiva alta se encuentra normalmente en las células del cáncer [3], por lo tanto, una forma tónica de SCD1 activo puede prevenir los efectos potencialmente nocivos de la acumulación endógena SFA. Dado que el ácido elaıdico, una trans-ácidos grasos monoinsaturados, sólo débilmente impidió que el efecto citotóxico de SCD1 tanto por deficiencia y la proliferación SFA mientras cis-MUFA totalmente restaurada, parece existir cierta especificidad de especies de ácidos grasos para el efecto protector. Esto posiblemente se produce por el desplazamiento de MUFA SFA a partir de reacciones metabólicas clave citotóxicos.
lipogénesis activa, la síntesis de lípidos de membrana particular, es un requisito crítico para la proliferación continua de células cancerosas y un mecanismo para evitar la entrada en el programa de la apoptosis [ ,,,0],30]. Hemos establecido anteriormente que SCD1 controla la velocidad global de la síntesis de lípidos en las células de cáncer de pulmón [9], [11], [12]. Los resultados de este trabajo refuerzan el concepto de que SCD1 puede controlar la proliferación celular al afectar la tasa de biosíntesis de ácidos grasos [12]. Se observó una disminución significativa en la proliferación de células H460 en presencia de un inhibidor de la ACC y el efecto anti-proliferativa que se puede atribuir a defectuoso síntesis de ácidos grasos podrían ser rescatados por tanto el ácido oleico (MUFA) y ácido palmítico (SFA). Estos resultados están de acuerdo con los informes anteriores que demuestran que la detención del crecimiento celular en las células del CAC empobrecido podrían invertirse por el ácido palmítico exógeno [16], [17].