Extracto
salinomicina elevó la esperanza de ser eficaz en terapias contra el cáncer debido a su capacidad para superar la apoptosis-resistencia en varios tipos de células cancerosas. Recientemente, su eficacia contra las células de carcinoma hepatocelular humano (HCC), tanto
in vitro
y
in vivo se demostró
. Sin embargo, el mecanismo de acción sigue siendo poco clara. Los últimos estudios implicados interferencia con la degradación de la vía de la autofagia. Este estudio tuvo como objetivo determinar el impacto de la salinomicina en HCC-autofagia y si hepatocitos humanos primarios (HPH) De la misma manera se ven afectados. Se llevó a cabo después de la exposición de las líneas celulares de HCC HepG2 y Huh7 con concentraciones variables de salinomicina (0-10 mM), el análisis exhaustivo de la actividad de autofagia mediante Western-blot y citometría de flujo. Los efectos del fármaco se analizaron en la configuración de la estimulación de la autofagia por inanición o PP242-tratamiento y se correlacionan con la viabilidad celular, la proliferación, la inducción de la apoptosis, la acumulación de masa mitocondrial y especies reactivas de oxígeno formación (ROS). Se analizó impacto en la inducción de apoptosis y la función de las células de la HPP.
constitutivo y estimulado actividades autofágicos tanto se suprime eficazmente en el CHC por salinomicina. Esta inhibición se asoció con la acumulación de mitocondrias disfuncional, aumento de la apoptosis y la disminución de la proliferación y la viabilidad celular. Efectos de la salinomicina eran dosis y tiempo dependiente y fácilmente podría ser replicado por la inhibición farmacológica y genética de HCC-autofagia solo. salinomicina la exposición a PHH dio lugar a alteración transitoria de la función de síntesis y la viabilidad celular y sin inducción de la apoptosis. En conclusión, nuestros datos sugieren que la salinomicina suprime las últimas etapas de HCC-autofagia, dando lugar a alteración de reciclaje y la acumulación de las mitocondrias disfuncional con el aumento de ROS-producción todos los cuales están asociados con la inducción de la apoptosis
Visto:. Klose J , Stankov MV, Kleine M, W Ramackers, Panayotova-D Dimitrova, Jäger MD, et al. (2014) La inhibición de la autofagia Flux por salinomicina Resultados de Lucha contra el Cáncer efecto en células de carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 9 (5): e95970. doi: 10.1371 /journal.pone.0095970
Editor: Manlio Vinciguerra, University College de Londres, Reino Unido
Recibido: 10 Enero, 2014; Aceptado: April 1, 2014; Publicado: 9 Mayo 2014
Derechos de Autor © 2014 Klose et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por Heidelberger Stiftung Cirugía y Gesellschaft der Freunde für Cirugía (JK), de KFO 250 (GB, MVS), Renacimiento EXC 62/1 (GB), y Else Kröner-Fresenius-Stiftung (FWRV; 2010_A49). Los autores reconocen el apoyo financiero de Deutsche Forschungsgemeinschaft y Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg dentro del programa de financiación de Publicaciones de Acceso Abierto. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
salinomicina (Sal) es un antibiótico poliéter ampliamente utilizado como anticoccidial en aves de corral [1] y el suplemento dietético en raza rumiantes y cerdos '[2], [3] debido a su actividad antimicrobiana. Recientemente, el potencial de la Sal como un agente anti-cáncer se ha aclarado [4]. Gupta et al. demostrado una eficacia de más de 100 veces de Sal comparación con Paclitaxel para matar las células madre de cáncer de mama en ratones [5]. Más tarde, la eficacia de la Sal contra las células tumorales fue ratificado en varias líneas celulares de cáncer de origen diferente, incluyendo tumores sólidos y no sólidos [6] - [9]. Sal también representa un candidato prometedor para el tratamiento de enfermedades malignas hepatobiliares como se ha demostrado para el CHC
In vitro e
in vivo
[10]. También hemos demostrado recientemente que Sal es factible para romper apoptosis-resistencia en colangiocarcinoma humano (CC) células [11]. Sin embargo, el modo preciso de acción de Sal como un agente anti-cáncer sigue siendo poco clara. Se han propuesto varios mecanismos tales como el bloqueo de la vía de tipo wingless (Wnt) /β-catenina [12] o de la activación de las caspasas convencional impulsado vías de apoptosis [13]. Últimamente, se sugirió un nuevo mecanismo responsable del efecto anti-cáncer de Sal implica alteración mediada por fármaco de la actividad de células de cáncer de autofagia. La autofagia es una vía de reciclaje de proteínas existentes, orgánulos o el daño celular. En las células tumorales se asume la autofagia para promover la supervivencia. Dependiendo del sistema experimental, ya sea la inhibición [14] o la activación [15] - [17] por Sal de esta vía de degradación celular se han reportado
Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue verificar la anti-cáncer. propiedades de Sal relativa HCC y para dilucidar su efecto sobre el mecanismo de pro-supervivencia de la autofagia de estas células cancerosas. Desde entonces se han sugerido efectos pro-apoptóticos de la Sal de sobra células benignas [9], estábamos más interesados en su impacto en hepatocitos humanos primarios (PHH). Hemos demostrado que la salinomicina parece suprimir las últimas etapas de HCC-autofagia, dando lugar a alteración de reciclaje y la acumulación de las mitocondrias disfuncionales con el aumento de ROS-producción y la inducción de apoptosis. Por otra parte, se demostró una reducción temporal de la función celular en PHH tras la exposición a salinomicina.
Materiales y Métodos
salinomicina
Sal fue adquirido de Sigma-Aldrich y se disolvió en DMSO . Las soluciones madre se almacenaron a -20 ° C. Las concentraciones de fármaco estaban en el rango de
in vitro
experimentos similares [10], [11], [14].
hepatocitos aislamiento
El aislamiento de hepatocitos humanos primarios (PHH ) se realizó mediante la técnica de perfusión de colagenasa en 2 pasos como se informó anteriormente [18] (ver información de apoyo). Todos los donantes de tejidos dieron su consentimiento informado por escrito para el uso experimental de la muestra de hígado. El protocolo fue aprobado por la Comisión de Ética de la Facultad de Medicina de Hannover.
Cultivo de células
líneas celulares de HCC humano HepG2 (American Type Culture Collection (ATCC), número de orden HB-8065) y Huh7 [ ,,,0],19] se cultivaron en DMEM (PAA) complementado con 10% de FCS, penicilina (50 U /ml) y estreptomicina (50 mg /l) (Invitrogen). El medio se cambió cada 48 h. Para los estudios de autofagia ambas líneas celulares se mantuvieron en EMEM suplementado formulado ATCC tal como se describe anteriormente [20]. inhibidores y activadores de la autofagia establecidos fueron utilizados en concentraciones que han sido registradas análogos
in vitro
experimentos: 3 MA (0,4 a 10 mM), LY294002 (0,8 a 20 mM), vinblastina (0,5-10 M), nocodazole (0,5 a 10 mM), PP242 (5 M), la cloroquina (CQ) (5-100 mM) y cloruro de amonio (ACH) (1-20 mM) [21]. inducción fisiológica de la autofagia se ha realizado utilizando HBSS que contiene glucosa 6 mM (medio de inanición)
recién aisladas PHH con una viabilidad de & gt;. 90% se sembraron en placas de 6 y 96 pocillos recubiertas de colágeno en 1,5 y 0,05 × 10
6 células viables /pocillo, respectivamente, y se cultivaron usando Williams Medio e como se describe anteriormente [18]. Tras la exposición a concentraciones variables de Sal (0-10 mM) de 24/48 h, que se cultivaron con medio normal por otros 5 días. El medio se cambió diariamente. Los sobrenadantes y las células adherentes se recogieron para su análisis en los días 1/3/5.
La viabilidad celular
PHH y células de HCC humanos fueron investigados por
in vitro
la viabilidad celular en CellTiter Una solución 96AQueous Ensayo de proliferación celular (Promega) como se describe anteriormente [18]. Por otra parte, la muerte celular también se analizó utilizando propidiumiodite (PI) ensayo de exclusión y la citometría de flujo. Alternativamente apoptosis se analizó mediante cambios en el FSC celular vs gráfico de puntos de SSC como se describe anteriormente [20].
Ensayo de proliferación de células
HepG2 y Huh7 fueron cultivadas a 1 × 10
3 /bien en medio solo o con 1 hasta 10 mM Sal en placas de 96 pocillos durante 24 h. Durante los últimos 16 h de cultivo de células se pulsaron con 1 Ci
3H-timidina y la incorporación detectada por un β-counter como se describe anteriormente [11].
Anexina-V
analiza
se analizaron las células HepG2 y Huh7 para la inducción de apoptosis después de la exposición a 1-10 mM Sal de 24 h de aplicar el kit de detección de apoptosis con anexina-V (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante tal como se describe anteriormente [11].
constructos y la infección retroviral
La plásmidos pBABE-puro mCherry-EGFP-LC3B y pBabePuro GFP-LC3 (N#22418 y 22405), diseñado por Jayanta Debnath [21], se obtuvieron a partir Addgene. transducción de células y la selección se realizaron como se describe anteriormente [20], [22]. La inhibición genética de la autofagia se logró utilizando
ATG7
shRNA mediada por tumbar (Santa Cruz). shRNA no específica (control), así como copGFP se aplicaron según las instrucciones del fabricante (Santa Cruz). La transducción se llevó a cabo utilizando partículas lentivirales con hasta cinco expresión distinta construye como se describe en otra parte [20]. La eficacia de transducción se cuantificó el número de células GFP-positivas y, en general excedió el 94% al final de la selección de puromicina.
efectos mediados por Salinomicina Análisis de la actividad autophagic HCC
compartimentos autofagia ( pre-autofagosomas, autofagosomas y autophago-lisosomas) representan los componentes intermedios de un proceso de degradación dinámica y su importe total en un momento determinado punto está determinada por la dinámica de su creación y la degradación [23]. Hemos llevado a cabo estudios que miden el flujo de autofagia según las directrices recientes [23]. flujo de autofagia se refiere a todo el proceso de autofagia incluyendo entrega de la carga y la consiguiente degradación autolysosomal. Medición de flujo de autofagia permite la discriminación entre la inducción y la inhibición de la maduración tardía autofagosoma ya que ambos se caracterizan por una mayor presencia de autofagosomas [23], [24]. La conversión de GFP-LC3-I a GFP-LC3-II se determinó por transferencia de Western usando el anticuerpo anti-LC-3B (Sigma-Aldrich) [23]. flujo de autofagia se evaluó como no degradado acumulación de GFP-LC3-II después de bloquear la degradación autophagosomal tecla ACH. bandas Densitometría LC3-II se ha realizado mediante LabImage1D Software (Kapelan Bio-Imaging Solutions) y normalizado a la densidad óptica (OD) de actina [24]. Además, el flujo de la autofagia en las líneas celulares de HCC se analizó mediante la detección de cambios en el total de la señal celular GFP-LC3 o mCherry-GFP-LC3 utilizando citometría de flujo como se describe anteriormente [20]. En pocas palabras, el aumento de flujo de autofagia corresponde a una entrega progresiva de GFP-LC3 a autolisosomas para la degradación y desaparición de la señal. Además, el flujo autophagic inhibido traduce en una reducción de desaparición GFP-LC3 y debido a la producción celular constitutiva se detecta como un aumento de la señal celular total [20]. El análisis se hizo en LSR-II (BD Biosciences). flujo autofagia también se determinó usando el kit de detección de autofagia cito-ID (Enzo Life Sciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante tal como se describe anteriormente [25]. Este ensayo se basa en un colorante específico que tiñe selectivamente compartimentos autofágicas. por lo tanto el flujo de autofagia se cuantifica como la acumulación de compartimentos autofágicos en condiciones básicas o activadas (HBSS o PP242-incubación) después de que el bloqueo de la degradación autophagolysosomal por CQ o ACH. Se calcula restando el valor de cito-ID MFI de la muestra sin CQ /ACH a partir del valor cito-ID MFI de la muestra con CQ /ACH para cada condición mediante la fórmula: ΔMFI cito-ID = MFI cito-ID (+ CQ /ACH) -. MFI cito-ID (-CQ /ACH)
mitocondrial masa
masa mitocondrial se determinó mediante citometría de flujo utilizando MitoTracker verde FM (MTR verde) y la tinción de acuerdo con el fabricante instrucciones (Molecular Probes) como se describe anteriormente [26].
especies reactivas de oxígeno (ROS) guía
ROS se determinaron por citometría de flujo aplicando 5- (y 6) -chloromethyl-2 ' , 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein, éster de acetilo (CM-H2DCFDA) tinción de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen) como se describe anteriormente [20].
aspartato-aminotransferasa fugas y urea formación
como medir el grado de daño celular la actividad de la aspartato aminotransferasa (AST) se determinó para culturas PHH. Además, se investigó la formación de urea como un indicador para la función celular. Se detectaron ambos parámetros en los sobrenadantes de cultivo mediante ensayos de actividad enzimática estandarizada (Roche Molecular Diagnostics) realizadas por el laboratorio central de la Escuela de Medicina de Hannover.
síntesis de albúmina
La síntesis de la albúmina por PHH se evaluó mediante la albúmina ELISA la cuantificación Conjunto humano (Bethyl Laboratories) tal como se describe anteriormente [27].
in vitro
morfología
la morfología de PHH unido a las placas recubiertas con colágeno tratada con /sin Sal fue evaluada diariamente a lo largo de todo el período de cultivo utilizando microscopía de contraste de fase.
inmunofluorescencia
PHH se cultivaron en portaobjetos de cámara recubiertos con colágeno a 5 x 10
4 células /cámara. Después de 24 h-incubación con concentraciones variables de Sal (0-10 mM) o ligando Fas (FasL) como un control positivo (1 mg /ml), la tinción de apoptosis se realizó utilizando el kit M30 CytoDeath (TECOmedical GmbH) de acuerdo con el fabricante del instrucciones.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS 20.0 y GraphPadPrism 4. La prueba de Mann-Whitney-U, de Student t-test y ANOVA con análisis post-hoc de Dunnett eran aplicado como apropiado. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativa con p & lt; 0,05. Los resultados se expresaron como media ± desviación estándar de al menos tres experimentos independientes.
Resultados
La exposición a la salinomicina reduce significativamente la viabilidad y proliferación de las células de HCC celular por inducción de la apoptosis
Para confirmar el efecto anticancerígeno de la Sal en células de HCC humanos, se determinó la viabilidad celular después de tratamiento con fármaco. Para esto, las células HepG2 y Huh7 fueron expuestas a concentraciones crecientes de Sal (1-10 mM) durante 24 h seguido de análisis utilizando el MTS-ensayo. la viabilidad de células tumorales en efecto se redujo significativamente a concentraciones de fármaco por encima de 2 mM Sal (Fig. 1A). A continuación, el impacto sobre la proliferación celular de células de HCC se determinó por
de 3H-timidina-incorporación después de 24 h-incubación con el agente. Como se demuestra en la Figura 1B, la proliferación celular fue significativamente afectada en ambas líneas celulares en una manera dependiente de la dosis. Este efecto fue detectable después de la exposición a una dosis más bien moderado de 2 M Sal. concentraciones de fármaco más altas casi completamente la disminución de la proliferación de células de HCC humanos.
células
HepG2 y Huh7 fueron expuestas a concentraciones crecientes de salinomicina (1, 2, 5 y 10 mM) durante 24 horas. (A) La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTS-; altas concentraciones de salinomicina llevaron a disminuyó significativamente la viabilidad de las dos líneas celulares (n = 5). células (B) HCC revelaron proliferación redujo significativamente después de la exposición a la salinomicina como se demuestra por una disminución de la absorción
3H-timidina. (C) Las bajas concentraciones de salinomicina (panel izquierdo, línea continua) llevaron a débil aumento de las células apoptóticas en comparación con las células no tratadas (línea punteada en la superposición). la apoptosis inducida por concentraciones elevadas notablemente (panel de la derecha, línea continua). Los resultados se muestran como representante de dispersión-gramos de Anexina-V
+ - células o resumidos como media ± desviación estándar de n = 4 experimentos independientes (D). * P & lt; 0,05, ** p & lt;.
0,01
Además, se analizó, ya sea Sal indujo apoptosis en estas líneas celulares. Como se ha demostrado en las Figuras 1C + D, se observó un aumento dependiente de la dosis de Anexina-V
+ células tras la exposición a Sal en las células HepG2. En las células Huh7 inducción de la apoptosis significativa se encontró en concentraciones Sal en y por encima de 2 mM. La inducción de la apoptosis por Sal fue más eficiente en HepG2 que en las células Huh7 (25,3% vs. 14,3%).
salinomicina inhibe el flujo de autofagia y conduce a la acumulación de autofagia sustrato
Para evaluar el efecto de Sal en la autofagia en células de HCC, las células se cultivaron en presencia o ausencia de 10 mM Sal durante 15 h con y sin ACH para el último 1 h. Western blot semicuantitativo demostró inducida por aumento de Sal, en LC3-II (Fig. 2A), que argumenta en contra de una inhibición mediada por Sal de las primeras etapas de la formación autophagosomal. En su lugar, esto puede corresponder tanto a la generación de autofagosoma mejorada debido al aumento de la actividad de autofagia o suprimida autofagosoma maduración [23]. Para abordar esta cuestión y para evaluar el flujo de autofagia por Western blot se estimó la acumulación de banda LC3-II posterior a la obstrucción mediada por la degradación de ACH autophagolysosomal. La acumulación de la banda de LC3-II se calculó restando la intensidad densitométrica de la muestra sin ACH a partir de la muestra con ACH para cada condición (control 3,6-1,0 = 2,6; Sal 03/07 a 01/06 = 2,1). La disminución de la acumulación de la banda LC3-II después de la adición de ACH en los cultivos tratados con Sal (2,6 & gt; 2,1) sugirió la supresión mediada por fármacos de flujo de autofagia (Fig. 2A). Una disminución similar en flujo autophagic se detectó como resultado de la supresión vinblastine- y mediada por nocodazole de maduración autophagosome (
datos no presentados
).
células HepG2 y Huh7 fueron expuestas a diferentes concentraciones de salinomicina (0,5, 2 y 8 M) para diferentes puntos de tiempo y se analizaron para la actividad de la autofagia. (A) El análisis por inmunotransferencia de LC3-I y LC3-II-isoformas (arriba) con el análisis cuantitativo densitometría (hacia abajo) en las células HepG2 reveló LC3-II-acumulación inducida por Sal debido a la inhibición del flujo de autofagia como se demuestra por la reducción de LC3-II -acumulación después de la adición de ACH. (B) y el flujo básico de autofagia-PP242 activada en las células Huh7 (barras negras). El tratamiento con inhibidores de la autofagia 3MA (2 y 10 mM), ACH (5 y 20 mM) o CQ (5, 20 mM) durante 24 h contrarresta activación PP242 de flujo autofagia. (C) La inhibición de la autofagia en las células de flujo Huh7 después mediada desmontables shRNA de ATG7. (D + E) disminución de la acumulación de compartimentos autofágicos después de que el bloqueo de la degradación autophagolysosomal por ACH indica que reduce el flujo de autofagia en células HepG2 (D) y Huh7 (E) células tratadas con Sal durante 24 h. Al lado del gráfico de barras, histogramas representativos se muestran. Todos los experimentos se presentan como media ± desviación estándar de n = 3 experimentos independientes * p & lt;. 0,05; ** P & lt; 0,01, *** p & lt;. 0.001
Antes de poder evaluar el impacto de la Sal en el flujo de autofagia HCC, se validó la vigilancia por citometría de flujo intracelular de la facturación de compartimentos autofágicos en células de HCC [25], [28]. la activación de la autofagia por PP242 condujo a un claro aumento en el flujo de autofagia (Fig. 2B). La adición de inhibidores de la autofagia, tales como 3-MA, ACH, o CQ resultó en una disminución del flujo de autofagia. Se obtuvieron resultados similares usando la rapamicina o el hambre (
datos no presentados
) y se confirmó la aplicabilidad del ensayo en células de HCC. Para excluir finalmente efectos pleiotrópicos de los inhibidores farmacológicos, verificamos medición del flujo de autofagia mediante cito-ID mediante mediada desmontables shRNA-autofagia específica de
ATG7 gratis (Fig. 2C).
A continuación, querido evaluar el efecto de Sal de flujo autophagic de HCC. las células HepG2 se cultivaron en presencia de Sal (0,5, 2 y 8 M) durante 24 h y se compararon con células no tratadas. Sal reduce notablemente el flujo de autofagia tiempo- y dependiente de la dosis, incluso cuando la autofagia fue inducida por PP242 (Fig. 2D). Se observaron resultados similares utilizando células Huh7 (Fig. 2E) y activación alternativa por la rapamicina o el hambre (
los datos no presentados
).
Por último, se aplicó el seguimiento de intracelular LC3-volumen de negocios [22] . Para ello, hemos utilizado células HepG2 expresan de forma estable LC3-GFP. La incubación con 3 MA (2 y 10 mM), LY (2 y 10 mM), nocodazol (2 y 10 mM) o ACH (0,8 y 4 mM) durante 7 h conducir a la acumulación de la señal de GFP-LC3, como se esperaba (Fig . 3A). El hambre aumentó el flujo autophagic como se detectó por una disminución de la señal de LC3-GFP en células de control, lo que indica una mayor degradación (Fig. 3A), un efecto que se había perdido cuando los inhibidores de la autofagia farmacológicas estaban presentes (Fig. 3A). células HepG2 Siguiente expresan constitutivamente la proteína de fusión LC3-GFP se cultivaron con y sin Sal de 24 h. Sal inhibió notablemente el flujo de autofagia como se detecta por la acumulación del total de la señal LC3-GFP celular (Fig. 3B). Una vez más, los efectos de la Sal de flujo autophagic eran tiempo y dependiente de la dosis y fácilmente apreciable a concentraciones reportados previamente para ejercer efectos anti-cáncer [10]. Supresión de la autofagia se ha asociado con la acumulación disfuncional mitocondrias con aumento de la producción de ROS [29], [30], que pueden desencadenar la apoptosis [29] - [32]. Por lo tanto, analizamos si el tratamiento Sal estuvo acompañado por la acumulación de la masa mitocondrial. De hecho, nuestros resultados confirmaron una acumulación dependiente de la dosis de la masa mitocondrial (Fig. 3C). Por otra parte, las mitocondrias acumulados muestran signos de disfunción como se demuestra por una mayor presencia de la producción de ROS (Fig. 3D). Es importante destacar que la inhibición farmacológica y genética de la autofagia en células de HCC reiteró completamente Sal efectos sobre la acumulación de las mitocondrias disfuncionales, la producción de ROS y la viabilidad celular. Con base en esta concluimos que los efectos sobre las células de HCC Sal podrían al menos parcialmente estar mediadas a través de su capacidad para suprimir el flujo autophagic (véase el archivo S1 y la Fig. S1).
(A) Inhibición de la base y HBSS activa- flujo autofagia en las células HepG2 que expresan establemente LC3-GFP se trató con 3 MA (2 y 10 mM), LY (2 y 10 mM), nocodazol (2 y 10 mM) o ACH (0,8 y 4 mM) durante 7 h. (B) Inhibición de flujo de autofagia en las células HepG2 tratadas con Sal (0,5, 2 y 8 M) durante 24 h (izquierda) con histogramas representativos (derecha). análisis (C) de citometría de flujo de la masa mitocondrial total usando MitoTracker Verde (MTR verde) revela acumulación de mitocondrias disfuncionales. (D) La evidencia de aumento de ROS-producción utilizando CM-H2DCFDA (izquierda) con histogramas representativos (derecha). Todos los experimentos se presentan como media ± desviación estándar de n = 3 experimentos independientes. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01
La exposición de PHH a los resultados salinomicina en la reducción transitoria de la función celular y
in vitro
morfología, pero no conduce a la apoptosis
sobre la base de los informes de que Sal exhibe efectos anticancerígenos contra las células tumorales, pero causó poco de la apoptosis en células no tumorales y el hecho de que el hígado representaría un órgano diana para el tratamiento de HCC, el próximo centramos en el efecto de la Sal de hepatocitos humanos primarios. En general, el tratamiento con bajas concentraciones de Sal (1-2 M) durante 24 h no alteró de forma explícita PHH-apariencia (Fig. 4A). Comparado con el control, los hepatocitos parecían ligeramente afectada con membranas celulares irregulares. Las concentraciones más altas de Sal (5-10 mM), aunque, en parte, dio lugar a alteraciones más obvias: PHH mostraron signos de destrucción integridad e incluso la pérdida de confluencia. Además de incubación de estos cultivos en ausencia de Sal llevó a completar la recuperación de PHH expuestas a dosis bajas e intermedias de hasta 5 micras. Por el contrario, después de la estimulación con 10 mM Sal durante 24 h no hubo detección microscópica de luz de recuperación eficaz para la mayoría de los casos. La incubación de PHH durante 48 h dio lugar a patrones similares: (Fig. 4A). Tratamiento con bajas concentraciones del agente provocó cambios morfológicos en lugar marginales, mientras que las dosis más altas de nuevo podría dar lugar a alteraciones celulares
Después de un día de incubación cultivadas PHH se expusieron a concentraciones crecientes de salinomicina (1, 2, 5 y 10 mM) en el momento de la exposición diferentes (24 y 48 horas, respectivamente). (A) Deterioro del valor de
in vitro
morfología y sin recuperación posterior sólo eran detectables después del tratamiento con altas concentraciones de salinomicina (10 mM), mientras que el tratamiento con hasta 5 M salinomicina como resultado una recuperación morfológica después de transcurrir el agente. (B + C) La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTS-. se observó tratamiento salinomicina para 24 (B) y 48 (C) horas conducido a alteraciones significativas de la viabilidad celular a día 1 y 3. Tras una posterior recuperación incubación de las células como se indica mediante el aumento de la producción de la formazaan-producto coloreado (n = 6) . (D + E) El daño celular de PHH como el representado por la liberación de AST fue sólo detectable inmediatamente después de la exposición al fármaco (día 1) a 10 mM durante 24 salinomicina (D) y 48 horas (E), respectivamente. Esta diferencia no alcanzó significación estadística (n = 3). incubación en curso fue acompañada por la liberación de AST apenas medible. * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0.005
A continuación se investigó el
in vitro
de la viabilidad celular en PHH utilizando el MTS-ensayo. La viabilidad celular se evaluó inmediatamente después de fármaco-exposición (día 1), así como en los días 3 y 5 después de Sal-tratamiento. Como se demuestra en la Figura 4B, 24 h-exposición significativamente afectada la viabilidad celular en los días 1 y 3 de una manera dependiente de la dosis. Caducidad de la incubación de drogas y en curso condujo a la recuperación casi completa de PHH para el día 5 (Fig. 4B). La estimulación con Sal durante 48 h dio como resultado una disminución dependiente de la dosis similar de la viabilidad celular y la posterior recuperación. Sin embargo, esta última no era tan suficiente como se observa después de 24 h a la exposición (Fig. 4C).
Dado que la incubación de PHH con concentraciones crecientes de Sal resultó en una reducción provisional de la viabilidad celular y alteraciones histomorfológicas, nos investigaron si mismo modo se pudieron detectar otros marcadores de daño celular. Figuras 4D + E demuestran que la pérdida comparable de AST se encontró entre todos los grupos experimentales. Un pico marcado de AST de liberación sólo se observó en el día 1 después de la exposición a 10 mM Sal pero no alcanzó significación estadística. incubación en curso y sin Sal resultó en la liberación básica moderada de AST en todos los grupos.
A continuación se analizó si Sal-tratamiento impide la función de la HPP. Para esto, se determinaron urea-formación y albúmina-síntesis de PHH expuestos a las drogas. Como se ha demostrado en las figuras 5A + B no hubo variabilidad relevante en la formación de urea-después de 24 h-estimulación con Sal. Por el contrario, después de 48 h-exposición que una disminución dependiente de la dosis de urea-formación era detectable, especialmente en los días 3 y 5, pero no alcanzó significación estadística (Fig. 5A + B). La albúmina-síntesis por PHH expuesta a Sal durante 24 h se caracteriza por disminución dependiente de la dosis en el día 1 (Fig. 5C + D). Lapso de Sal causó una lenta recuperación de la funcionalidad celular con un aumento continuo de la albúmina-producción, sin embargo, después de la estimulación con altas concentraciones de drogas-. Un efecto similar, pero aún más pronunciada se observó por 48 h-exposición. Una vez más, después de un lapso del agente a continua - se encontró recuperación de PHH (Figura 5C + D.)
La funcionalidad de PHH después del tratamiento con salinomicina fue analizado por la formación de urea y la síntesis de albúmina - aunque mucho más lenta.. (A) 24 horas de exposición a concentraciones variables Salinomicina no fue acompañada por la formación de urea deteriorado en absoluto. (B) En contraste, el tratamiento durante 48 horas resultó en una disminución dependiente de la dosis de la formación de urea en los días 1, 3 y 5 sin alcanzar significación estadística. síntesis de (C + D) de albúmina fue notablemente afectada en día 1 después de la estimulación con salinomicina durante 24 y 48 horas, respectivamente. Además de incubación dio lugar a la recuperación continua de la síntesis de albúmina en los grupos con 24 horas de exposición al fármaco. En contraste, el tratamiento durante 48 horas dio como resultado sólo en recuperación moderada de la síntesis de albúmina (n = 3). * P & lt; 0,05, ** p & lt;. 0.005
Finalmente, estábamos interesados en determinar si la alteración transitoria de la PHH tras 24 h de exposición a Sal se correlaciona con la inducción de la apoptosis. Como se muestra en la Figura 6, la exposición a Sal no provocó apoptosis de estas células benignas en contraste con FasL-tratamiento.
Cultured PHH se expusieron a concentraciones crecientes de salinomicina (1, 2, 5 y 10 mM) para 24 horas. La apoptosis se detectó mediante el kit M30 CytoDeath. El tratamiento con ligando Fas (FasL) sirvió como control positivo. La tinción de PHH con DAPI (azul) y kit M30 CytoDeath (rojo) no reveló ninguna evidencia de inducción de la apoptosis en PHH incluso después del tratamiento con altas concentraciones de salinomicina. Por el contrario, FasL indujo apoptosis en PHH claramente.
Discusión
Nuestros datos apoyan la noción de que Sal ejerce un efecto pro-apoptótica en células de HCC por la inhibición de la autofagia flujo que conduce a acumulación de mitocondrias disfuncionales y el aumento de ROS-formación. Dado que se cree que las células tumorales a experimentar más estrés inherente y, por tanto, se prevé que sean altamente dependientes de la autofagia para la supervivencia [33] nuestro estudio podría ayudar a entender por qué Sal mata selectivamente las células cancerosas sin afectar las células benignas. Esta hipótesis se ve aumentada por la observación de que la exposición de PHH a Sal solamente da lugar a alteración transitoria de la función de las células sin daño sustancial
.
Desde el HCC es la tercera causa principal de cáncer [34] y el tumor maligno primario de hígado más frecuente con limitadas opciones de tratamiento-particularmente en la etapa avanzada de la enfermedad [34], [35], los enfoques terapéuticos innovadores son esenciales. El potencial de la Sal para el tratamiento del CHC en primer lugar fue sugerido por el trabajo de Wang et al. quien demostró la inhibición de la proliferación y la inducción de la apoptosis en el CHC
in vitro
y
in vivo
después de la exposición de drogas [10]. Para diseccionar el modo preciso de acción de la Sal nos hemos centrado en el mecanismo molecular de la Sal en el CHC. El uso de células HepG2 y Huh7 y cuantitativa de estudios exhaustivos hemos sido capaces de demostrar que Sal inhibe el flujo de autofagia en las células de HCC humanos. Los siguientes resultados nos llevaron a la conclusión de que la inhibición de la autofagia flujo Sal-mediada podría ser responsable de la apoptosis en células de HCC. En primer lugar, hemos demostrado una acumulación dependiente de la dosis de las mitocondrias disfuncionales con el aumento de ROS-producción. Eliminación de las mitocondrias disfuncionales y por lo tanto la reducción de las señales pro-apoptóticos como citocromo
c
liberación se considera que son una parte integral del mecanismo a favor de la supervivencia de la autofagia [36]. Es de destacar que la autofagia se ha demostrado en varias ocasiones que es crucial para la eliminación de las mitocondrias disfuncionales [31], [37]. alteración detectable de la masa mitocondrial y ROS apareció sólo después de la inhibición sustancial de flujo autophagic y fue seguido por una inducción masiva de apoptosis y muerte celular. En segundo lugar, en nuestras condiciones experimentales la inhibición farmacológica y genética de la autofagia reiteró su totalidad estos eventos. Incluso si se considera que la casi totalidad de los inhibidores farmacológicos presentes efectos pleiotrópicos sobre múltiples vías [23], el hecho de que la inhibición genética dio lugar a alteración análoga argumenta a favor de la posibilidad de que nuestras observaciones están al menos parcialmente mediados por la supresión de flujo autofagia. El impacto de la Sal en la autofagia en las células cancerosas se han despertado controversia actualmente. Jangamreddy et al. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01;