Extracto
Antecedentes
El topotecan produce daños en el ADN que induce la autofagia en las células cancerosas . En este estudio, la sensibilización de topotecan a las células de cáncer de colon con diferente estado de p53 a través de la modulación de la autofagia se examinó.
Metodología /Principales conclusiones
El daño en el ADN inducido por el tratamiento con topotecán resultó en la autofagia citoprotector en el colon las células de cáncer con p53 de tipo salvaje. Sin embargo, en las células con p53 mutante o knockout p53, el tratamiento con la muerte celular inducida por la autofagia asociada topotecan. En las células de cáncer de colon p53 de tipo salvaje, el tratamiento activado topotecan p53, upregulated la expresión de sestrina 2, inducida por la fosforilación de la subunidad AMPKα en Thr172, e inhibió la vía mTORC1. Por otra parte, la inhibición de la autofagia aumentó el efecto antitumoral del tratamiento con topotecán en células de cáncer de colon p53 de tipo salvaje, pero alivió el efecto antitumoral del tratamiento con topotecán en células p53 knockout in vivo.
Conclusiones /Importancia
Estos resultados implican que la de tipo salvaje p53 dependiente de la inducción de la autofagia citoprotector es una de las respuestas celulares que determina la sensibilidad celular a la topotecan droga que daña el ADN. Por lo tanto, nuestro estudio proporciona una potencial estrategia terapéutica que utiliza una combinación de agentes que dañan el ADN y los inhibidores de la autofagia para el tratamiento de cáncer de colon con p53 de tipo salvaje
Visto:. Li DD, Sun T, Wu XQ, Chen SP, Deng R, S Jiang, et al. (2012) La inhibición de la autofagia sensibiliza las células del cáncer de colon con p53 de tipo salvaje, pero no p53 mutante con topotecan. PLoS ONE 7 (9): e45058. doi: 10.1371 /journal.pone.0045058
Editor: Gian Maria Fimia, Istituto Nazionale per le Malattie Infettive, Italia |
Recibido: 13 Febrero, 2012; Aceptado: 15 de agosto de 2012; Publicado: 14 Septiembre 2012
Copyright: © Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30873085, 30972882, 81101670) (http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default106.htm), el Proyecto Principal de Ciencia y Tecnología de la Investigación Nacional básico programa (973 programas) de China (2011CB504300) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong en China (S2011020002759). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el topotecán, un inhibidor de topoisomerasa I que induce daño en el ADN, se utiliza para tratar el cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de pulmón y cáncer de cuello uterino avanzado [1], [2]. Mientras que los agentes que dañan el ADN se han utilizado en los últimos 50 años, la razón de que algunos pacientes muestran diferentes sensibilidades a una droga que daña el ADN sigue siendo poco clara. Por lo tanto, una idea de las respuestas celulares provocadas por fármacos que dañan el ADN y los mecanismos que determinan la sensibilidad de drogas es fundamental para ampliar la utilidad de ADN -damaging fármacos para el tratamiento de cánceres.
autofagia es un mecanismo implicado en catabólico el reciclaje y la rotación de los componentes citoplasmáticos [3], [4]. La autofagia puede facilitar la supervivencia celular o la muerte en respuesta a diferentes estímulos de estrés [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. La autofagia también juega un papel esencial en el mantenimiento de la estabilidad genómica [13], [14], [15] por mantener el metabolismo y la supervivencia durante el estrés (por ejemplo, daño en el ADN) en beneficio de la supervivencia celular [16]. Muchos estudios han demostrado que la autofagia se asocia con una serie de condiciones patológicas, incluyendo el cáncer [10], las enfermedades infecciosas, las miopatías y trastornos neurodegenerativos [17], [18], [19]. Dado que la función de la autofagia en el cáncer es complicada y puede tener [7], se han propuesto muchas hipótesis consecuencias opuestas con respecto al papel de la autofagia en el cáncer. Una de estas hipótesis sugiere que el papel de la autofagia depende de la etapa de desarrollo del tumor [20]. En una etapa temprana del desarrollo del tumor, la evidencia genética indica firmemente que la autofagia suprime la iniciación del tumor. Sin embargo, los datos de peso también sugiere que las células tumorales establecidos, pero no iniciar las células tumorales, requieren la autofagia como una vía de supervivencia fundamental en etapas avanzadas de desarrollo del tumor. Los tumores a menudo residen en un ambiente privado de nutrientes, factores de crecimiento, y el oxígeno. Por lo tanto, la autofagia se localiza en las regiones tumorales hipóxicas que son las más alejadas de los vasos sanguíneos de nutrientes de suministro donde sostiene la supervivencia de células tumorales. Otra hipótesis propone que la autofagia regula cáncer en un por células y tejidos específicos de manera [21], [22]. Muchas células cancerosas se someten a la muerte celular por autofagia después de terapias contra el cáncer; sin embargo, la autofagia también protege algunas células de cáncer contra tratamientos anticancerosos mediante el bloqueo de la vía apoptótica.
El supresor de tumores p53 es una molécula clave en la respuesta al daño del ADN. En respuesta a condiciones adversas, incluyendo genotóxico, hipóxico, y /o el estrés oncogénico, p53 sufre rápidamente reversible modificaciones post-traduccionales que facilitan su estabilización [23]. En el núcleo, p53 activa puede unirse a las regiones promotoras y transactivate una gran cantidad de genes diana implicados en la progresión del ciclo celular, apoptosis, y /o el metabolismo [24]. p53 también media funciones supresoras de tumores de transcripción independiente fuera del núcleo [25]. Por ejemplo, p53 citoplasmática puede relocalise a la mitocondria y desencadenar la membrana mitocondrial permeabilización [26], [27].
En el cáncer, existen muchos vínculos entre la autofagia y p53 que aún no se han comprendido plenamente [28]. Un estudio informó que la autofagia P53 promovido a través de AMP-quinasa activación (AMPK) y mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR) inhibición [29]. Sin embargo, la evidencia acumulada indica que el supresor de tumores p53 puede modular la autofagia de varias maneras dependiendo de su localización subcelular [25]. Por un lado, p53 es un factor de transcripción que responde al estrés celular y transactiva genes tales como DRAM, sestrins1 y sestrins2 que inducen la autofagia o muerte celular autofágica [30], [31], [32]. Sin embargo, por otro lado, citoplasmática pero no p53 nuclear puede activar mTOR y reprimir la autofagia [33]. Por otra parte, p53 también puede inducir la autofagia mediante la regulación de LC3 [34]. Sin embargo, la comprensión de cómo se consiguen estos efectos sigue siendo difícil de alcanzar.
En el presente estudio, mostramos que la p53 de tipo salvaje puede activar AMPK, inhibir mTORC1 y promover la supervivencia de las células del cáncer de colon, permitiendo la autofagia citoprotector en respuesta al tratamiento topotecan . Por otra parte, la inhibición de la autofagia sensibiliza las células de cáncer de colon con p53 de tipo salvaje al tratamiento topotecan. En contraste, la inhibición de la autofagia alivia el efecto anti-tumor del tratamiento topotecán en células mutantes p53 o de cáncer de colon knockout tanto in vitro como in vivo. Por lo tanto, nuestro estudio indica que una combinación de agentes que dañan el ADN y los inhibidores de la autofagia podría servir como un enfoque novedoso quimioterapéutico para el tratamiento de las células del cáncer de colon con p53 de tipo salvaje.
Resultados
topotecan autofagia inducida por el tratamiento de cáncer de colon líneas celulares
un patrón de tinción puntiforme LC3 se ha identificado como un marcador biológico de la autofagia [35], [36]. Para estudiar si el agente de topotecan que daña el ADN podría inducir la autofagia, se crearon células HCT116, LS-174T y HT29 que expresan LC3 fusionado a la proteína fluorescente amarilla (YFP-LC3). Como se muestra en la Fig. 1A, en las células no tratadas, la YFP-LC3 se distribuyó uniformemente en el citosol. Sin embargo, el tratamiento topotecan indujo una potente acumulación de focos YFP-LC3 en estas células. LC3 se convierte a LC3 lipidada (LC3-II) en la formación de un autophagosome, y LC3-II migra más rápido en comparación con el no lipidada LC3-I en un gel de SDS /PAGE [37]. Se utilizó esta diferencia en la migración de controlar aún más los niveles LC3-II después del tratamiento topotecan y encontramos que la aparición de LC3-II fue inducida en un nivel alto por tratamiento topotecan en una variedad de líneas celulares de cáncer de colon (Fig. 1B y Fig. S1). Maduros auto-lisosomas son sometidas a proteolisis autofagia, que conduce a un nivel reducido de los sustratos autofágicas así como niveles reducidos de la autophagosome y componentes de automóviles-lisosoma, tales como p62 /SQSTM1 [38], [39]. Para confirmar aún más que el proceso de autofagia se indujo por tratamiento topotecan, se detectó la proteína P62 por transferencia de Western. Los resultados revelaron que P62 se degradó después del tratamiento topotecan, lo que indica la autofagia fue inducida en estas células de cáncer de colon (Fig. 1B y Fig. S1).
A. HCT116, LS-174T y HT29 células fueron transfectadas durante 24 h con una construcción de expresión que codifica LC3 fusionado a la proteína fluorescente amarilla (YFP-LC3). A partir de entonces, las células se trataron con o sin 1 mg /ml topotecan (TPT) durante 24 h y se visualizaron bajo un microscopio confocal. B. El indicado células se trataron con las concentraciones indicadas de topotecan para 24 h. Los lisados fueron analizados por inmunotransferencia con los anticuerpos LC3 y P62.
La inhibición de la autofagia aumento de la sensibilidad de las células de cáncer de colon humano con p53 de tipo salvaje, pero no mutantes de p53 o p53 knockout células con topotecan
para estudiar la autofagia inducida por topotecan en mayor detalle, se utilizó ARN de interferencia para agotar dos proteínas autofagia básicos conocidos, beclin1 y ATG5 (Fig. 2A y la Fig. S2A). Como se muestra en la Fig. 2B y la fig. S2B, el agotamiento de beclin 1 o ATG5 por tratamiento siRNA bloqueado eficazmente la acumulación de LC3-II después del tratamiento topotecan, que indica la inhibición de la autofagia. Además, la inhibición de la autofagia por el agotamiento de beclin 1 o ATG5 aumento de la muerte celular inducida por topotecan en el HCT116 y líneas de células LS-174T, que son células de cáncer de colon humano p53 de tipo salvaje (Fig. 2C). Estos resultados también fueron confirmados por el ensayo de SRB (Fig. S3A). Estos resultados indican que el tratamiento topotecan induce la autofagia funcional y citoprotector en estas células p53 de tipo salvaje. Para confirmar aún más nuestros resultados, también inhibió la vía de la autofagia con inhibidores farmacológicos. Se encontró que un co-tratamiento de topotecan con cloroquina (CQ), un inhibidor de la función lisosomal que impide la realización de la autofagia en la etapa final, bloquea eficazmente la degradación inducida por topotecan de P62. Es importante destacar que la inhibición de la autofagia por CQ también sensibiliza las células HCT116 a la muerte celular inducida por topotecan (Fig. 2D y Fig. S2C).
A. Los lisados de células HCT116 transfectadas con el beclin 1-siRNA o Atg5- shRNA se analizaron por inmunotransferencia. B. Un análisis de inmunotransferencia mostró ninguna acumulación de LC3-II en las células de la autofagia defectuoso (es decir, beclin 1-siRNA o shRNA ATG5-tratados) después del tratamiento con 1 mg /ml de TPT. las células de control C. HCT116 y LS-174T, sibeclin 1-células, y shAtg5 células se cultivaron a 6000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se expusieron a diferentes concentraciones de topotecán (0,039 a 1,25 g /ml) durante 72 marido. El nivel de inhibición del crecimiento se detectó usando el ensayo de MTT. Los datos en C son medias ± S. D. (
n
= 3).
P Hotel & lt; 0,05, prueba de la t de Student. células D. HCT116 se incubaron con 1 mg /ml topotecan y /o 10 mg /ml CQ para 24 h. Los lisados se analizaron mediante inmunotransferencia con los anticuerpos P62. células HCT116 se incubaron con las concentraciones indicadas de topotecan o una combinación de topotecan y 10 mg /ml CQ para 24 h. La cantidad de muerte celular se cuantificó usando el ensayo de tinción PI por citometría de flujo. Los datos de D son medias ± S. D. (
n
= 3). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01,
t de Student
Curiosamente, a diferencia de la células con p53 de tipo salvaje, la inhibición de la autofagia por CQ en p53 células mutantes bloqueados de la muerte celular inducida por el tratamiento con topotecán (Fig. 3A). Además, en células en las que el gen p53 se ha somáticamente noqueado (HCT116 p53
- /-), la inhibición de la autofagia mediante tratamiento CQ también bloqueó la muerte celular inducida por topotecan (Fig 3B.). Del mismo modo, la inhibición de la autofagia por el agotamiento ATG5 no sensibilizar a la p53 HCT116 - /- las células a topotecan inducida por la muerte celular (Fig 3C y Fig S3B..). En resumen, la inhibición de la autofagia sensibilizado células de cáncer de colon con p53 de tipo salvaje al tratamiento topotecan; Sin embargo, la muerte celular inducida por topotecan se alivió en las células p53 knockout a la inhibición de la autofagia
.
El HT29, SW480, SW620 y las células se incubaron con las concentraciones indicadas de topotecan o una combinación de topotecan y 10 mg /ml CQ durante 24 h. La cantidad de muerte celular se cuantificó usando el ensayo de tinción PI por citometría de flujo. Los datos de A son las medias ± S. D. (
n
= 3). *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, de Student
t
B. Prueba HCT116 p53
+ /+ y HCT116 p53
- /- células se cultivaron a 6000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se expusieron a diferentes concentraciones de TPT (0,0625 a 2 g /ml) y /o 10 mg /ml CQ para 72 h. El nivel de inhibición del crecimiento se detectó usando el ensayo de MTT. C. Lisados de p53 HCT116
- /- células transfectadas con el vector o ATG5 shRNA se analizaron por inmunotransferencia. El ensayo MTT se utilizó para analizar el nivel de inhibición del crecimiento celular. Los datos en B, C son medias ± S. D. (
n
= 3).
P
. & Lt; 0,05,
t
prueba
Estudiante de topotecan inducida por autofagia mediada por p53 fue mediante la activación de la AMPK y sestrina 2 en células de cáncer de colon con las p53 de tipo salvaje
el supresor de tumores p53 se activa en múltiples tipos de daño en el ADN y, a su vez, inhibe la proliferación celular a través de la inducción de genes específicos [40]. Por lo tanto, el próximo tratado de investigar si P53 y su objetivo genes estaban involucrados en topotecan-autofagia-inducida. Como era de esperar, el tratamiento topotecan estimuló un aumento en el nivel de P53 en una forma dependiente de la dosis en las líneas celulares HCT116 y LS174T. Además, el tratamiento topotecan también aumentó la expresión del gen diana P53, sestrina 2. La fosforilación de AMPK también se aumentó notablemente después de la exposición topotecan (Fig. 4A y la Fig. S4A). Además, el tratamiento con siRNAs dirigidos p53 o sestrina 2 efectivamente derogada la activación de AMPK inducida por topotecan y la acumulación de LC3-II (Fig. 4B y Fig. S4B). Estos hallazgos sugieren que P53 media la autofagia topotecan inducida por la activación de la AMPK y sestrina 2 en células de cáncer de colon con p53 de tipo salvaje.
A. células HCT116 y LS-174T se trataron con varias concentraciones de TPT para 24 h. Los niveles de p53, sestrin2 y p-AMPK se analizaron por inmunotransferencia. células B. HCT116 fueron transfectadas con p53 o sestrina 2 siRNAs durante 24 h, se trata con o sin 1 mg /ml TPT por un período adicional de 24 h, y las proteínas indicadas se analizaron después por inmunotransferencia. células C. HCT116 se transfectaron con LKB1 o CaMKKβ siRNAs, se trata con o sin 1 mg /ml TPT de 24 h adicionales, y las proteínas indicadas se detectaron por inmunotransferencia.
Ca
2 + /calmodulina quinasa dependiente de β (CaMKKβ) pueden fosforilar y activar AMPK en respuesta al aumento de los niveles de calcio [41], [42]. Los estudios también han demostrado que se requiere que el LKB1 serina-treonina quinasa para la activación de AMPK en respuesta al estrés [43]. AMPK puede ser fosforilado por factor de crecimiento transformante-β-quinasa activada 1 (TAK1), que activa AMPK en el tratamiento TRAIL [14]. Para investigar si estos activadores AMPK conocidos estaban involucrados en este proceso, la expresión de LKB1 y CaMKKβ fueron derribados utilizando siRNA. Los resultados demostraron que, incluso después de que el agotamiento eficiente de LKB1 y CaMKKβ, ni la activación de la AMPK topotecan inducida ni la acumulación de LC3-II fueron afectados (Fig. 4C y la Fig. S4C).
Tratamiento autofagia inducida por topotecan través la inhibición AMPK mediada de mTORC1 en células de cáncer de colon p53 de tipo salvaje
AMPK juega un papel clave en el mantenimiento de la homeostasis energética y la activación de la autofagia [44]. Para examinar el efecto del tratamiento con topotecan en la actividad de AMPK, las células HCT116 y LS-174T fueron expuestos a topotecan de una manera dosis-y dependiente del tiempo. tratamiento Topotecan activa noteably AMPK en las dos líneas celulares ensayadas con p53 de tipo salvaje, que se muestra por la fosforilación de AMPKα en el residuo de sitio activo Thr172 (Fig. 5A y la Fig. S5A). Además, el tratamiento topotecan indujo una activación rápida y sostenida de AMPK, que fue evidente por un aumento en la fosforilación de la acetil-CoA-carboxilasa (ACC), un sustrato de AMPK bien conocido, en Ser79 (Fig. 5B. Fig S5B). Los estudios han demostrado que la mTOR puede detectar cambios en el estado de energía celular a través de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), y la inhibición de mTORC1 por AMPK pueden aumentar la autofagia [45]. De acuerdo con estos resultados, se encontró que el tratamiento con topotecán inhibe la vía mTORC1, que era evidente por una fosforilación reducida de proteína ribosomal S6 quinasa 1 (p70S6K), un sustrato mTORC1 directa (Fig. 5A y la Fig. S5A).
HCT116 y LS-174T se trataron con TPT durante 24 h. Los niveles de expresión de las proteínas indicadas se analizaron por inmunotransferencia. células B. HCT116 se trataron con 1 mg /ml TPT durante los tiempos indicados. Los lisados celulares se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos fosfo-ACC. C. Las células fueron tratadas con 1 mg /ml TPT y /o 20 mM compuesto C durante 24 h, y los niveles de expresión de las proteínas indicadas se analizaron por inmunotransferencia. células HCT116 D. fueron transfectadas con siRNAs de control o AMPKα durante 48 h, se trata con o sin 1 mg /ml TPT, y el nivel de las proteínas indicadas se analizaron posteriormente por inmunotransferencia.
Para determinar si actividad de la AMPK era esencial para la autofagia topotecan inducida, que inhibió la actividad de la AMPK utilizando un inhibidor farmacológico o la interferencia de ARN. El tratamiento previo de las células de cáncer con 20 mM del compuesto C, un inhibidor potente y selectivo de la AMPK, la activación de AMPK inducida por topotecan efectivamente impedido. Al mismo tiempo, la acumulación de LC3-II topotecan inducida también fue bloqueada por tratamiento con el compuesto C. Estos resultados indican que la autofagia se inhibió la inhibición AMPK (Fig. 5C y Fig. S5C). El agotamiento de la catalítico α1 subunidad de AMPK usando siRNA también confirmó estos resultados. La inhibición de la actividad de AMPK en efecto bloqueado la inducción de la autofagia, que era evidente por el nivel de LC3-II (Fig. 5D y la Fig. S5D). Además, el agotamiento de AMPKα restauró la actividad p70S6K, lo que indica que la inhibición de mTORC1 fue relevado (Fig. 5D y la Fig. S5D). Estos datos sugieren que la autofagia inducida por el ADN-agente que daña, topotecan, depende de la inhibición mediada por AMPK de mTORC1.
La inhibición de la AMPK de activación aumentó la sensibilidad de las células de cáncer de colon humano con el tipo salvaje p53 pero no p53 mutante con topotecan
con el fin de confirmar si la actividad de AMPK era esencial para la viabilidad celular después del tratamiento topotecan en células de cáncer de tipo salvaje o mutantes de p53, las células de cáncer de colon humano se trataron con diversas concentraciones de topotecán en presencia o ausencia del inhibidor de la AMPK, el compuesto C. Como se muestra en la Fig. 6, el tratamiento combinado de topotecan con el compuesto C resultó en un mayor nivel de citotoxicidad en células de cáncer de colon humano con p53 de tipo salvaje (HCT116 y líneas de células LS174-T). Sin embargo, el tratamiento con el compuesto C no sensibilizar a las células con p53 mutante (líneas de células HT29, SW480 y SW620) con topotecan. Basándose en estos hallazgos, concluimos que la activación de AMPK sirve como un mediador central en la inducción de la autofagia citoprotector en respuesta al daño del ADN en las células de cáncer de colon que contienen p53 de tipo salvaje pero no mutante p53.
Varios células se cultivaron a 6000-8000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se expusieron a diferentes concentraciones de TPT (0,15 a 2,5 mg /ml) y /o 10 mM compuesto C durante 72 h. El nivel de inhibición del crecimiento se detectó usando el ensayo de MTT. Los datos son medias ± S. D. (
n
= 3).
P Hotel & lt; 0,05, de Student
t
prueba
La actividad antitumoral de topotecan en combinación con el inhibidor de la autofagia en un HCT116 cáncer de colon humano de xenoinjerto. modelo
para explorar la eficacia in vivo del inhibidor de la autofagia CQ para sensibilizar a los de tipo salvaje células de cáncer de colon humano p53 con topotecan, se generó un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos. ratones desnudos atímicos se les inyectó por vía subcutánea con 4 × 10
6 HCT116 p53
+ /+ o HCT116 p53
- las células cancerosas, y se dejó que los tumores resultantes crecer durante aproximadamente 5 d para producir un promedio - /el volumen del tumor de 40 mm
3 antes del tratamiento de drogas. Los efectos antitumorales de topotecan, CQ, o un tratamiento de combinación de los dos fármacos se evaluaron en HCT116 p53
+ /+ y HCT116 p53 - /- xenoinjertos. Topotecan se administró por vía intraperitoneal una vez cada 4 d (2 mg /kg), y CQ se administró por vía intraperitoneal una vez al día (10 mg /kg). Como se muestra en la Fig. 7, se observó un retraso en el crecimiento tumoral con el tratamiento con topotecan solo, y la combinación de CQ con el tratamiento topotecan aumentó el efecto anti-tumor en el p53 HCT116
+ /+ modelo de xenoinjerto. Sin embargo, el efecto antitumoral de CQ no se ve reforzada por el tratamiento de combinación con topotecan en el p53 HCT116
- /- modelo de xenoinjerto. Por el contrario, el tratamiento de combinación de drogas parecía afectar a la actividad anti-tumor de topotecan en este modelo.
ratones desnudos atímicos se les inyectaron por vía subcutánea con 4 × 10
6 HCT116 p53
+ /+ o HCT116 p53
- las células cancerosas - /. Seis ratones fueron asignados a cada uno de los grupos de tratamiento. Los tumores se dejaron crecer durante aproximadamente 5 d para producir un volumen medio del tumor de 40 mm
3 antes del tratamiento de drogas. Topotecan se administró por vía intraperitoneal una vez cada 4 d (2 mg /kg), y CQ se administró por vía intraperitoneal cada día (10 mg /kg). El crecimiento del tumor se midió cada 4 días de acuerdo con el método descrito en la sección "Materiales y Métodos". Los resultados se presentan como medias ± S.D. (
n
= 6). *
P
. & Lt; 0,05,
t de Student
Además, el efecto inhibidor de la AMPK compuesto C en combinación con topotecan en el modelo de xenoinjerto era examinado. Después de haber establecido la eficacia in vitro para AMPK quimiosensibilización inducida por inhibidores de a topotecan en células de cáncer de colon humano p53 de tipo salvaje, el modelo de xenoinjerto en ratones desnudos fue generado para explorar si la inhibición de AMPK estaba involucrado en quimiosensibilización a topotecan in vivo. Como se muestra en la Fig. S6, el compuesto C juega un papel similar al de CQ en combinación con el tratamiento con topotecan. Compuesto C podría aumentar el efecto antitumoral en combinación con topotecan en HCT116 p53 + /+ pero no p53 - /-. Modelo de xenoinjerto
Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la inhibición de la autofagia sensibiliza las células de cáncer de colon con p53 de tipo salvaje a que daña el ADN drogas. Desde AMPK sirve como un mediador central en la inducción de la autofagia citoprotector en respuesta al daño del ADN, la inhibición de AMPK también podría mejorar el efecto de fármacos que dañan el ADN a las células de cáncer de colon con p53 de tipo salvaje.
Discusión
la autofagia es un proceso de auto-digestión lisosomal conservadas evolutivamente. Los efectos de la autofagia en la tumorigénesis y la terapia del cáncer son paradójicos. Se ha informado de que la autofagia es capaz de suprimir la tumorigénesis a través de mantener la estabilidad genómica y la eliminación de p62. Sin embargo, la utilización de la autofagia como un mecanismo citoprotector, las células tumorales logran sobrevivir en microambiente duras. En respuesta a muchas de las terapias contra el cáncer, la autofagia se induce como una estrategia de pro-supervivencia en células de cáncer humano o un efecto antitumoral que contribuye. Por lo tanto, una gran cantidad de esfuerzo se debe hacer para aumentar lo decide funciones citoprotectores y citocidas de la autofagia, que es esencial en la orientación de la derecha vías de señalización autofágicos que hace que el tratamiento contra el cáncer más prometedor. En este documento, se encontró que la activación de AMPK mediada por p53 de tipo salvaje dio como resultado la autofagia citoprotector en respuesta a la topotecan droga que daña el ADN en las células de cáncer de colon humano. La inhibición de la autofagia sensibiliza a las células de cáncer de colon con p53 de tipo salvaje con topotecan; sin embargo, la inhibición de la autofagia atenúa el efecto anti-tumor del tratamiento topotecán en células mutantes p53 o de cáncer de colon knockout tanto in vitro como in vivo. Aparte de mecanismos conocidos, hemos sugerido que p53 podría modular la autofagia y propuso que la condición de p53 podría determinar el destino celular después de la droga daños en el ADN autofagia inducida por topotecan y ayudar a mantener la homeostasis de la autofagia.
Con respecto al cáncer, existen muchos enlaces la autofagia con p53. En el presente estudio, nos centramos en el destino de las células cancerosas autofágicos en respuesta a un agente de daño en el ADN bajo diferentes estado de p53. En primer lugar, se muestra que varias líneas celulares de cáncer de colon, incluyendo p53 de tipo salvaje y mutante p53 /células de cáncer de colon humano knockout, morfológica exhibición y características bioquímicas características de las células sometidas a la autofagia después del tratamiento con el fármaco topotecan que daña el ADN. Además, el bloqueo de la autofagia por el agotamiento de ATG5 o beclin 1 de interferencia por ARN o por tratamiento con cloroquina, pero que alivió la citotoxicidad de topotecan en las células cancerosas con p53 mutante o knockout p53. Como se sabe, topotecan no sólo debe hacer daño en el ADN, sino también para detener las células G1 /S detención o G2 /M detención en función de las líneas celulares distintas. Para explorar si la detención del ciclo celular es suficiente para inducir la muerte celular potenciada después de la autofagia de inhibición, se utilizó la vincristina (VCR) como un tipo diferente de fármacos contra el cáncer para confirmar nuestros hallazgos. VCR se une a los dímeros de tubulina, montaje de estructuras de microtúbulos inhibidor. La alteración de los microtúbulos detiene la mitosis en la metafase. En nuestro estudio, la comparación con el tratamiento sólo vídeo, la combinación con inhibidores de la autofagia no hace gran diferencia en las células de cáncer de colon cualquiera que sea el estado de la p53 (Fig. S7). Los resultados sugieren que la muerte celular topotecan mediada y la autofagia citoprotector podrían estar asociadas con daño en el ADN en células de cáncer de colon. Nuestros estudios previos han demostrado que la autofagia contribuye a la muerte celular en las células CNE2 con p53 mutante y células Hep 3B, que son p53 deficiente [46], [47], [48]. Aunque parece racional para ver p53 por sus actividades pro-apoptóticos, mostramos que la prolongación de la supervivencia celular a través de la inducción de la autofagia también fue una característica inherente de p53 de tipo salvaje. Tal función citoprotectora puede estar relacionado con el papel de p53 de tipo salvaje y la autofagia en el mantenimiento de la homeostasis metabólica intracelular. Sin embargo, algunas células cancerosas con p53 mutante o knockout p53 perdieron esta función prosupervivencia de la autofagia. De hecho, el bloqueo de la autofagia puede promover la muerte de células cancerosas en estas condiciones. Nuestros resultados se unieron a un creciente número de ejemplos cuál es la función de la autofagia en la terapia del cáncer y lo que decide el destino de las células cancerosas autofágicos.
Los mecanismos por los que p53 de tipo salvaje induce la autofagia citoprotector parecen surgir principalmente de la transcripción el control de los reguladores de la vía mTOR. De hecho, varios genes diana de p53, tales como AMPK, TSC2, y PTEN, son todos conocidos reguladores negativos de mTORC1. Sorprendentemente, dos genes diana de p53, sestrin1 y sestrin2, se han identificado como un enlace crítico entre la activación de p53 y la actividad mTORC1 [31], [49], [50]. Sobre esta base, la hipótesis de que la p53 de tipo salvaje y su objetivo, sestrina 2, podría activar la AMPK, inhibir mTORC1 y promover la supervivencia celular al permitir que un citoprotector autofagia en respuesta a topotecan. Sobre la base de los datos mostrados en este estudio, esta hipótesis parece correcta. Sin embargo, dos activadores AMPK bien conocidos, LKB1 y CaMKKβ, no eran responsables de la activación de topotecan inducida de la AMPK y la autofagia resultante. Como era de esperar, no se observaron activación de AMPK y la inhibición fosfo-p70S6K después del tratamiento topotecán en células mutantes p53 (Fig. S8). Además, nuestros datos muestran que la inhibición de la AMPK aumento de la sensibilidad celular al tratamiento topotecán en células de cáncer de p53 de tipo salvaje, pero no en las células mutantes de p53. Nuestros resultados sugieren que en células de cáncer de colon p53 de tipo salvaje, pero no las células mutantes de p53, la p53 activada por AMPK sirve como un mediador central en la inducción de la autofagia citoprotector en respuesta al daño del ADN.
En conjunto, la destino de las células cancerosas autofágicos probablemente difiere entre las células con diferente estado de p53. En el caso de las células cancerosas con p53 de tipo salvaje, p53 promueve la AMPK factor de supervivencia. Como resultado de ello, activa AMPK puede promover la autofagia para proteger las células de cáncer para contrarrestar la citotoxicidad causada por el agente que daña el ADN. Por el contrario, la pérdida de p53 mutante o no podían activar AMPK, pero podrían promover otros "estrés activa la proteína quinasa", tales como c-Jun NH2-quinasas terminales, obligar a las altas tasas de autofagia, y eventualmente causar la muerte celular por autofagia. Además, confirmamos que la inhibición de la autofagia sensibiliza a las células de cáncer de colon con p53 de tipo salvaje, que en contraste inhibieron efecto antitumoral en los que tienen p53 knockout para el tratamiento in vivo daños en el ADN. Por lo tanto, nuestro estudio proporciona una estrategia de tratamiento potencial en la que la combinación de agentes de daño de ADN con inhibidor de la autofagia se utilizó en las células de cáncer con p53 de tipo salvaje, sin embargo, la combinación de ADN dañar las drogas y los inductores autofagia podría ser convertido en una estrategia útil para tratar cánceres que expresan p53 mutante o p53 knockout.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
Este estudio y los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y uso de Animales institucional de Sun Yat Sen University con número de permiso 11002A.
Cell Cultura y
HCT116, se cultivaron células LS174-T, SW480, SW620 y HT29 en medio DMEM suplementado con FBS al 10% (inactivado por calor a 56 ° C por 30 min) y las cantidades apropiadas de penicilina y estreptomicina en una incubadora a 37 ° con un humidificado 5% de CO
2 atmósfera. La p53 HCT116
- /- línea celular fue proporcionado amablemente por el profesor Jing Xuan-Pan (Sun-Yat Sen Universidad, China)
Microscopía confocal e inmunofluorescencia indirecta
Las células fueron. transfectadas transitoriamente con un vector de expresión LC3-etiquetados proteína fluorescente (YFP) amarilla usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019). Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron tratadas con topotecan. Después de un tratamiento de 24 h topotecan, las células fueron fijadas con paraformaldehído al 4% y se examinan bajo un microscopio láser confocal de barrido (Olympus, FV-1000).
ARN de interferencia
Las células se transfectaron