Extracto
Antecedentes
Las células cancerosas presentan una síntesis de ácidos grasos de novo sostenida con un aumento de la producción de ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) y saturada. Este cambio en el metabolismo de ácido graso está asociada con la sobreexpresión de estearoil-CoA desaturasa 1 (SCD1), que cataliza la transformación de los ácidos grasos saturados en ácidos grasos monoinsaturados (por ejemplo ácido oleico). Varios informes han demostrado que la inhibición de SCD1 condujo al bloqueo de la proliferación y la inducción de apoptosis en células de cáncer. Sin embargo, la activación de los mecanismos de muerte celular aún no se entiende mejor.
Principales conclusiones
En este estudio, hemos demostrado que SCD1 extinción de siRNA provocó la supresión de la síntesis de novo de ácidos grasos monoinsaturados en el cáncer y la no Células cancerígenas. Scd1 la muerte celular activada por la inhibición se observó sólo en las células cancerosas con la inducción de la actividad de caspasa 3 y PARP-escisión. suplementación exógena con ácido oleico no invirtió la muerte celular mediada por la ablación SCD1. Además, el agotamiento inducido SCD1 distintivos (EPU) de respuesta de la proteína desplegada como Xbp1 mRNA de empalme, la fosforilación de eIF2α y el aumento de la expresión de CHOP. Sin embargo, la expresión chaperón GRP78, otro sello UPR, no se vio afectada por Scd1 caída en estas células de cáncer que indica una activación UPR peculiar. Por último, hemos demostrado que la inducción CHOP participó a la celda de activación de la muerte por SCD1 extinción. De hecho, la sobreexpresión de constructo dominante negativo CHOP y extinción de CHOP restauró parcialmente la viabilidad de las células cancerosas-agotado SCD1.
Conclusión
Estos resultados sugieren que la inhibición de la síntesis de novo de ácidos grasos monoinsaturados por SCD1 extinción podrían ser un objetivo prometedor contra el cáncer mediante la inducción de la muerte celular a través de UPR y la activación CHOP
Visto:. Minville-Walz M, Pierre AS, Pichon L, S Bellenger, Fèvre C, Bellenger J, et al. (2010) La inhibición de la estearoil-CoA desaturasa 1 Expresión induce la muerte celular CHOP-dependiente en células de cáncer humano. PLoS ONE 5 (12): e14363. doi: 10.1371 /journal.pone.0014363
Editor: Michael Polymenis, Texas A & amp; M University, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de julio de 2010; Aceptado: November 26, 2010; Publicado: 16 de diciembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Minville-Walz et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de INSERM, Región Bourgogne y el Centro Nacional Interprofesional de la Economía Laitiare. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las células cancerosas exhiben alteraciones del metabolismo caracterizado por el aumento de la glucólisis y la lipogénesis [1], [2]. la proliferación de células de cáncer activos presentes no sólo cambios cuantitativos en
de novo
la biosíntesis de lípidos, sino también modificaciones de la composición de los lípidos de membrana que afectan a la fluidez de membrana, transducción de señales y expresión de genes [3], [4]. Los cambios en la composición de la membrana de lípidos se observan en una amplia variedad de cánceres, que se caracteriza principalmente por saturado (SFA) y ácido grasos monoinsaturados (MUFA) acumulación que aparece menos debido a aumento de la captación de SFA y MUFA que a la síntesis de ácidos grasos endógeno exacerbado, con independencia de suministro nutricional lípidos adecuada [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Estas modificaciones de SFA y el contenido de ácidos grasos monoinsaturados se asocian con la modulación de la expresión y la actividad de las enzimas lipogénicas. Por lo tanto, la sobreexpresión de acetil Co-A α carboxilasa y ácido graso sintasa, que participan en los primeros pasos de la biosíntesis del ácido graso, se describieron en varios tipos de cáncer [12], [13], [14], [15], [16], [17].
un mayor contenido de ácidos grasos monoinsaturados podría ser también debido a una sobre regulación de estearoil Co-a desaturasa (SCD, el delta-9 desaturasa) la expresión, la enzima limitante de la velocidad de la síntesis de ácidos grasos monoinsaturados. De hecho, Scd cataliza la introducción de un doble enlace entre los carbonos 9 y 10 de varios ácidos grasos saturados tales como ácido palmítico (16:00) y ácidos para producir palmitoleico (16:01) y oleico esteárico (18:00) (18:01 ácidos), respectivamente. Esta enzima residente retículo endoplásmico existe bajo dos isoformas en seres humanos, y Scd1 Scd5 [18]. SCD1 se encuentra en casi todos los tejidos con una expresión importante en el hígado, mientras que la expresión se restringe a Scd5 páncreas y el cerebro. expresión de SCD1, en correlación con el contenido de ácidos grasos monoinsaturados, se aumenta en adenoma hepatocelular, carcinoma de colon y esófago, así como en tumores genetically- y químicamente inducidos por [19], [20], [21]. Para el cáncer de próstata, dos estudios presentan resultados contradictorios sobre SCD1 nivel de expresión [22], [23]. Por lo tanto, la expresión de SCD1 puede estar relacionada con los procesos de carcinogénesis que implican la alteración del equilibrio proliferación /apoptosis. De hecho, scd1 células que sobre-expresan presentan una ventaja de crecimiento, mientras que scd1 knock-down conduce a tasas más lentas de la proliferación celular y la muerte celular
in vivo
y
in vitro
[24], [25] , [26], [27]. El mecanismo de muerte celular observado en células de cáncer de pulmón Scd1 deficientes parece implicar la modificación de una relación de SFA /MUFA que activa la inhibición de la vía de Akt y la activación de la vía de AMPK [24], [28]. En efecto, en ausencia de SCD1, el contenido de los aumentos de SFA que alivia la activación de Akt normalmente obtenida por MUFA (por ejemplo, ácido oleico) para el mantenimiento de la proliferación celular y la supervivencia [29]. Además, diferentes células de cáncer que carecen de actividad Scd1 reducen
de novo
lipogénesis través de la activación de la vía de AMPK [22], [24]. La alteración de la producción de lípidos en las células Scd1 deficientes se refiere principalmente a una reducción de la biosíntesis de fosfolípidos, que desencadena el estrés celular y la expresión de la proteína C /proteína relacionada con la apoptosis EBP homóloga (CHOP /GADD153) [26], [27], [30 ], [31]. CHOP pertenece a una vía de la tensión peculiar llamado retículo (ER) endoplásmico que pueden inducir la apoptosis.
estrés ER es provocada por diferentes condiciones de estrés tales como alteraciones en el estado posterior a la traducción de proteínas y la síntesis de lípidos, la hipoxia, la interrupción de la homeostasis del calcio y la privación de nutrientes, y conduce a la activación de un programa de adaptación, conocida como la respuesta de proteína no plegada (UPR), para restablecer el equilibrio [32]. La activación de la canónica UPR involucra tres ramas de señalización concertadas distintas mediadas por los sensores de membrana ER anclados: ARN dependiente de la proteína quinasa (PKR) -como ER quinasa (PERK), la activación de factor de transcripción 6 (ATF6) e inositol que requiere 1α enzima (IRE1α) [ ,,,0],33]. Hincapié en las células, la proteína chaperona GRP78 se disocia de sensores UPR Perk, ATF6 y IRE1α que conduce a su activación para aliviar el estrés ER primera. PERK fosforila la 2α eucariótica factor de iniciación de la traducción (FEI), lo cual inhibe la síntesis de proteínas mundial. ATF6 activa se transloca al Golgi y se escinde de la membrana por sitio-1 y -2 proteasas. ATF6 escinde a continuación localiza en el núcleo e induce la transcripción de chaperones XBP1 y ER como GRP78. IRE1α dispone de una actividad endorribonucleasa que alternativamente empalmes ARNm Xbp1 (sXbp1), que se traduce en un factor de transcripción activo. Sin embargo, en un estrés severo o prolongado, la UPR puede desencadenar señales pro-apoptóticas a través de la activación de la CHOP factor de transcripción, que actúa para reprimir la expresión del gen bcl-2, por lo tanto abajo de la regulación anti-apoptótica de proteínas Bcl-2 y de la representación células sensibles a los efectos pro-apoptóticos de BH3-sólo las proteínas [34], [35], [36].
Mientras que estos datos apoyan claramente la implicación de SCD1 como un regulador central de la lipogénesis en las células cancerosas, la vínculo entre SCD1 y la inducción de estrés ER y la muerte celular en células de cáncer aún no se ha comprendido mejor. En este estudio, estábamos en consecuencia interesado en buscar para la inducción de la UPR en las células cancerosas que carecen de expresión SCD1 y en la investigación del papel de esta vía de la tensión sobre la viabilidad de las células cancerosas durante SCD1 extinción. Hemos demostrado que el agotamiento de SCD1 en las células cancerosas marcadores UPR y muerte de células cancerosas inducida activa sin efecto sobre la viabilidad celular no cáncer. Por otra parte, se evidenció que CHOP participó a la muerte celular mediada por SCD1.
Resultados
inhibición de la expresión de SCD1 eficiente y supresión de
de novo
MUFA síntesis
en este estudio se investigó el efecto de silenciamiento SCD1 usando ARNip en diferentes líneas celulares de cáncer humano (U2OS, SW480 y HCT116). Las células cancerosas se transfectaron con 75 nM siRNA dirigidos relacionado ARNm humano (siRNA SCR) y ARNm de SCD1 (siRNA Scd1.A y Scd1.B). Tanto siRNA dirigido contra Scd1 comparación con el control siRNA (SCR) expresión suprimida drásticamente de SCD1 ARNm y proteínas tan pronto como 24 h después de la transfección (Figuras 1A y 1B).
A) U2OS células fueron transfectadas con ARNsi de control ( SCR) o con siRNA contra SCD1 (Scd1.A y Scd1.B) y se recogió el 24 y 48 h después de la transfección para la expresión de ARNm de SCD1 tiempo real RT-PCR. scd1 expresión de ARNm se normalizó a ß-actina expresión. Los valores representan la media ± SEM en relación con la expresión de SCD1 ARNm en células U2OS scr tratados a las 24 h. *, P & lt; 0,05 frente a siRNA células tratadas con scr por análisis ANOVA seguido por la prueba de Tuckey. B) las células U2OS y SW480 se trataron con oligofectamine (-), control siRNA (SCR) o con siRNA contra Scd1 (Scd1.A y Scd1.B). Las células se recogieron 24 h después de la transfección para el análisis de la expresión de SCD1 mediante transferencia de Western. C) Las células U2OS y SW480 tratadas con siRNA 72 h se incubaron durante 6 h con [
14C] ácido esteárico y se realizó la extracción de lípidos totales. la actividad de SCD se evaluó por HPLC como la tasa de [
14C] conversión de ácido esteárico en [
14C] ácido oleico en las células tratadas con ARNsi para 72 h. la actividad de SCD se expresó como la relación de% de [
14C] ácido oleico a [
14C] ácidos oleico y esteárico. Los valores representan la media ± SEM de al menos dos experimentos separados. *, P & lt; 0,05 frente a siRNA células tratadas con scr por análisis ANOVA seguido por la prueba de Tuckey. Un representante de la expresión de proteína SCD1 se demostró durante 72 h de tratamiento siRNA. D) células U2OS fueron expuestos a DMSO como vehículo, inhibidores de SCD1 (CVT-11127 o MF-438) en 10 M durante 24 h y se prepararon como anteriormente C) para la medición de la actividad de SCD. Los valores representan la media ± SEM de tres experimentos. *, P & lt; 0,05 frente a células tratadas con vehículo mediante análisis ANOVA seguido de la prueba de Tuckey
Como SCD1 cataliza la conversión del ácido esteárico en ácido oleico, una disminución en la producción de ácido oleico evidenciaría la abolición. de la actividad de SCD1 por siRNA dirigidos a esta enzima. Para hacer frente a la actividad de SCD después de 72 h de SCD1 silenciamiento, se trataron más U2OS y células SW480 durante 6 h con [14C
] radiomarcado ácido esteárico que conduce a medir la producción de [
14C] ácido oleico en Scd1- células deficientes en comparación con las células de control SCR-tratada. La incorporación de ácido esteárico [
14C] fue similar en scr siRNA y las células tratadas con SCD1 (datos no mostrados). Las células cancerosas transfectadas por la no focalización humano mRNA siRNA (SCR) presentan una tasa de desaturación de 31,49% para U2OS y 25,66% para SW480. En las dos líneas celulares, Scd1 extinción condujo a una caída en la biosíntesis del ácido oleico con una tasa restante desaturación de 5,135% y 5,28% en el U2OS tratadas por siRNA Scd1.A y Scd1.B, respectivamente, y 5,89% y 7,55% , respectivamente, en SW480 (Figura 1C). Además, expusimos U2OS células durante 24 h a la Scd1 inhibidores de CVT-11127 y MF-438 (10 M). Obtuvimos capacidad similar con inhibidores de SCD1 que siRNA dirigidos contra Scd1 para inhibir la producción de ácido oleico a partir de ácido esteárico en células U2OS (Figura 1D).
En conjunto, estos resultados demostraron una inhibición drástica de la actividad de SCD en siRNA Scd1 células tratadas. Por otra parte, en estas líneas celulares de cáncer, SCD1 aparece como la principal enzima implicada en la producción endógena de ácido oleico.
SCD1 promueve la extinción de las células de la apoptosis la muerte
Con el fin de evaluar el efecto de la caída SCD1 sobre la viabilidad celular, se determinó primero el número de células a las 24 h, 48 h y 72 h después de la transfección usando el reactivo CyQuant® que cuantifica la cantidad de ácidos nucleicos. Tan pronto como 48 horas después de la transfección, el número de células fue significativamente menor en las células U2OS-agotado SCD1 en comparación con las células control. Mientras que la fluorescencia relativa (RF) se incrementó para las células tratadas con scr siRNA todo lo largo de la 72 h después de la transfección, RF no cambió significativamente para las células silenciadas-Scd1 siRNA durante el curso del tiempo. Hemos observado que la RF se dos veces veces mayor en células SCR siRNA en comparación con empobrecido en Scd1 siRNA U2OS 72 h después de la transfección que indica inhibición de la proliferación o de inducción de muerte celular en células ablación-Scd1 (Figura 2A). Luego, hemos demostrado por el recuento de células de exclusión con azul de tripano 72 h después de la transfección de ARNsi que Scd1 caída condujo a una disminución de la viabilidad celular tanto en U2OS y células SW480, pero mucho más drásticamente en células U2OS (Figura 2B). Más del 30% de U2OS tratadas con siRNA SCD1 y aproximadamente el 20% de SW480 tratadas con siRNA SCD1 fueron positivos para PI representa un aumento de tres y dos pliegues en comparación con las células U2OS y SW480 tratadas con siRNA scr, respectivamente (Figura 2C). La inhibición de la actividad de SCD1 por ambos compuestos (CVT-11127 y MF-438) también condujo a aumentar la muerte celular a las 48 h en una manera dosis-respuesta (Figura 2D). Sin embargo, encontramos que estos compuestos afectadas de manera diferente la viabilidad celular con CVT 11.127 más potente para la inducción de muerte celular de MF-438 en U2OS. Por otra parte, hemos demostrado que el agotamiento de SCD1 inducida por la activación de la apoptosis, como se muestra por la inducción de alto nivel de la actividad de caspasa 3 y la escisión de PARP (figuras 2E y 2F).
A) U2OS células fueron tratadas con siRNA scr (control) y la orientación SCD1 (Scd1.A y Scd1.B), y se recogieron 24 h, 48 h o 72 h después de la transfección. estado de proliferación se determinó mediante el ensayo de proliferación CyQuant®. Cada valor es la media de unidades de fluorescencia relativa ± SEM de por triplicado y representativos de tres experimentos independientes. B) Las células U2OS y SW480 se cultivaron durante 72 horas después de la transfección de siRNA y se recogieron para el ensayo de exclusión del colorante azul de tripano. Los valores son la media ± SEM de tres ejemplares y representativos de otros dos experimentos independientes. Se recogieron las células C) U2OS ad SW480 tratadas 72 h con siRNA y la muerte total de células se analizaron por citometría de flujo después de la tinción con yoduro de propidio (PI). Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. D) las células U2OS se trataron durante 48 h con inhibidores de SCD1 en las concentraciones indicadas y se cosecharon para la tinción de yoduro de propidio. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos. E) U2OS células se recogieron 72 h después de la transfección y se prepararon para la caspasa 3 medición de la actividad por citometría de flujo como se detalla en los materiales y métodos. Los datos se muestran como veces de incremento sobre el control (scr siRNA) y representan la media ± SEM de dos experimentos independientes. F) lisados de células enteras se prepararon 72 h post-transfección con siRNA y la escisión de PARP (c-PARP nivel) se determinó por Western-blot. G) U2OS células fueron tratadas durante 72 h con el control de siRNA (SCR) y la orientación SCD1 en ausencia (vehículo) o presencia de 100 mM de ácido oleico unido a BSA. El número de células se cuantificó por ensayo de proliferación CyQuant® como se describió anteriormente. Los datos se muestran como cambio veces sobre las células SCR tratados con siRNA vehículo y representan la media de unidades de fluorescencia relativa ± SEM de tres ejemplares. *, ** P & lt; 0,05 frente siRNA scr-tratado con el vehículo y las células de ácido oleico, respectivamente, mediante el análisis de varianza seguido de la prueba de Tuckey
A continuación, postulamos que la muerte celular fue provocada por la reducción de la oleico. contenido de la celda de ácido. Por lo tanto, se realizó para complementar-agotadas las células Scd1 siRNA con 100 mM de ácido oleico con el fin de evaluar la capacidad de la suplementación exógena para revertir la muerte celular. Figura 2G evidencia de que la exposición de las células U2OS SCD1 con deficiencia de ácido oleico exógeno no cambió la tasa de citotoxicidad.
La inhibición de la expresión de SCD1 activa respuesta de las proteínas parcialmente desplegada
Las perturbaciones de plomo ER homeostasis a ER estrés mediante la activación de la UPR que podría desencadenar la muerte celular. Con el fin de controlar la activación de la vía de la UPR, se determinó el nivel de expresión de GRP78, fosfo-eIF2α y empalme no convencional de Xbp1 ARNm. U2OS y SW480 células tienen la maquinaria funcional para responder a thapsigargina inducida por el estrés ER, como hemos observado empalme de Xbp1, sobre regulación de la expresión GRP78 y fosfo-eIF2α (Figuras 3A y B). A continuación, analizamos estos marcadores de estrés ER en las células deficientes en SCD1. Supresión de SCD1 en U2OS y células SW480 llevó a un procesamiento parcial de Xbp1 mRNA: spliced- e híbridos-XBP1 especies (s- y h-Xbp1) de ARNm se incrementaron en las células deficientes en SCD1 que indica la activación de brazo IRE1α en ambas líneas celulares, de una manera más pronunciada en las células SW480 (Figura 3A). Traducción de s-Xbp1 produce el factor de transcripción funcional Xbp1, que participa en un programa de transcripción con el fin de primera función ER re-establecer y supervivencia celular. La chaperona GRP78 también regula la vía favor de la supervivencia durante el estrés ER a través de su regulación. Sin embargo, no fuimos capaces de observar dicha regulación en U2OS células SW480 y silenciada para SCD1 48 h después de la transfección (Figura 3C). No se observó ningún cambio en el nivel de ARNm y proteínas para la expresión GRP78 en diferentes momentos después de la transfección (24, 48 y 72 h, los datos no presentados). PERK también pertenece a la UPR y su activación induce la fosforilación de eIF2α desencadenar la represión de la traducción general. Hemos observado a las 48 h post-transfección de que las células agotadas en SCD1 expresan mayor cantidad de fosfo-eIF2α en comparación con las células control que sugiere la activación del brazo PERK (Figura 3D). Con el fin de asignar la fosforilación de eiF2αto Scd1 extinción y no un artefacto debido a la activación de PKR por siRNA transfección, se analizaron el nivel de fosfo-eIF2α en U2OS tratadas con 5 y 10 mM de inhibidor de SCD1 (CVT-11127 y MF-438) para 10 y 24 h. Se observó aumento de la expresión de p-eIF2α tan pronto como 10 horas para ambos inhibidores que demuestran que la fosforilación de eIF2α fue inducida por la extinción de la actividad de SCD1 (Figura 3E).
U2OS células SW480 y fueron tratados con siRNA control (SCR ) y siRNA contra Scd1 durante 72 h. A) Las muestras se prepararon para los análisis de mRNA de procesamiento Xbp1 por semi-cuantitativos de RT-PCR. Los productos de PCR se corrieron en un gel de agarosa al 3% y la Xbp1 empalmado (sXbp1), unspliced Xbp1 (uXbp1) e híbridos especies Xbp1 (hXbp1) de ARNm se observaron en las células siRNA tratados (CTR) y células thapsigargine tratados (Tg) como control positivo de la activación de la UPR. B) Total de proteína lisados se prepararon a partir tratadas y no tratadas thapsigargina-células (Tg, 0,2 M, 16 h) y se analizó la fosforilación eiF2α y GRP78 sobre regulación de transferencia de Western. C y D) Scd1-agotado U2OS y se prepararon células SW480 como en 3B) y se analizaron por transferencia de Western para SCD1, GRP78 y la expresión de fosfo-eiF2α. E) U2OS células fueron tratadas con 5 y 10 mM de inhibidores de SCD1 (MF-438 y CVT-11127) y se recogieron después de 10 h y 24 h de tratamiento para el análisis de la expresión de fosfo-eiF2α por transferencia de Western. Las transferencias son representativos de al menos dos experimentos independientes.
CHOP participa de SCD1 depleción de la muerte celular inducida
En ER estrés apoptosis mediada, CHOP expresión aumenta y aparece como un efector esencial de este programa de muerte celular. Nos dirigimos a la primera evaluación de la expresión CHOP en las células cancerosas tratadas con siRNA scr o en contra de SCD1. Se observó un aumento de CHOP mRNA y expresión de proteínas en las células que han perdido la expresión de SCD1 en comparación con las células control (Figuras 4A y 4B). Para determinar el papel de CHOP en la inducción de muerte celular, transfectadas transitoriamente vector vacío (CTR) o la forma dominante negativa de CHOP (DN-CHOP) en células U2OS. DN-CHOP construcción de puertos mutaciones en el dominio de cremallera de leucina (L134A /L141A) que impide su actividad transcripcional [37]. Hemos demostrado por tinción con PI que DN-CHOP sobreexpresión citotoxicidad reducida inducida por la inhibición de SCD1 en comparación con las células de control transfectadas (CTR) (Figura 4C). Por otra parte, se estimó el efecto de la expresión forzada de DN-CHOP en caspasa 3 activa de inducción en U2OS-silenciado SCD1. Nos mostró una disminución de la activación de caspasa 3 en células U2OS-desmontables scd1 expresar DN-CHOP y evidenció un efecto protector de la DN-CHOP contra la apoptosis inducida por el agotamiento de SCD1 (Figura 4D).
A) las células U2OS y SW480 fueron tratados con siRNA control (SCR) y siRNA contra SCD1 durante 72 h. ARN total fue aislado y la expresión de mRNA CHOP normalizó a ß-actina de la expresión de ARNm se cuantificó por el tiempo real de RT-PCR. Los resultados se representaron como la media de inducción de plegado ± SEM con relación a las células tratadas con scr siRNA de al menos tres experimentos independientes. *, P & lt; 0,05 frente a siRNA células tratadas con scr por análisis ANOVA seguido por la prueba de Tuckey. B) Nuclear extractos de U2OS se prepararon 72 h después de la adición de siRNA. CHOP expresión fue analizada por Western-Blot y la lamina A /C se carga el control de muestras de extracto nuclear. ) las células U2OS C fueron transfectadas transitoriamente con vacío (CTR) o dominante negativo CHOP (DN-CHOP vector de expresión) y seleccionados durante tres días en G418. Las células resistentes transfectadas por el constructo ctr o DN-CHOP fueron tratados por siRNA SCR de control o en contra de SCD1 (Scd1.A y Scd1.B) durante 72 horas y se recogieron para el análisis de tinción con yoduro de propidio mediante citometría de flujo. Los valores se muestran como veces de incremento sobre los controles (SCR siRNA) y representan la media ± SEM de dos experimentos independientes. *, **, P & lt; 0,05 frente siRNA scr tratados con células ctr y DN-CHOP, respectivamente, por análisis de ANOVA seguido de la prueba de Tuckey. #, P & lt; 0,05 mediante análisis de ANOVA seguido por la prueba de Tuckey. Se prepararon D) células U2OS como C) y se recogieron para el análisis activa la caspasa 3 por citometría de flujo. Los valores se muestran como veces de incremento sobre los controles (SCR siRNA) y representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. *, **, P & lt; 0,05 frente siRNA scr tratados con células ctr y DN-CHOP, respectivamente, por análisis de ANOVA seguido de la prueba de Tuckey. #, P. & Lt; 0,05 mediante análisis de varianza seguido de la prueba de Tuckey
CHOP extinción alivia parcialmente SCD1 agotamiento de la apoptosis inducida por
La protección observada por la inhibición de células U2OS CHOP contra el agotamiento mediada SCD1 la muerte también se ha evaluado en línea de células tumorales de colon HCT116. En este objetivo, hemos utilizado células CHOP-HCT116 desmontables y Ba1 transitorios que son células HCT116 transfectadas de forma estable con ADNc antisentido humana CHOP construir [38]. El agotamiento de SCD1 con siRNA en HCT116 indujo más del 30% de muerte celular como lo demuestra la tinción PI (Figura 5A). También mostramos en 72 h que la extinción de la actividad de SCD1 de siRNA y los inhibidores (datos no mostrados) apoptosis inducida en HCT116 se evidencia por la caspasa activa 3 o detección PARP-división (figuras 5B y 5C). En estas células, también se encontró que la supresión de la expresión de SCD1 llevó a la sobre regulación de la expresión de mRNA CHOP como ya se ha observado para U2OS y las células SW480 (Figura 5D). Por otra parte, se confirmó que en U2OS que la reducción de la expresión de CHOP alivió parcialmente la citotoxicidad inducida por el silenciamiento de SCD1. De hecho, se observó una disminución de la tinción con PI en las células en comparación con su BA1 HCT116 parental (p-HCT116) homólogos cuando la expresión Scd1 fue abolida (Figura 5E). Por otra parte, la protección contra la muerte celular SCD1 silenciamiento mediado inducida por CHOP extinción parecía ser específica y no una protección contra todos los factores pro-apoptóticos. De hecho, la extinción de CHOP no modificó la inducción de apoptosis por etopósido en DN-CHOP U2OS o BA1 en comparación con sus respectivas células de control (datos no mostrados). También hemos llevado a cabo para evaluar el efecto de la extinción por CHOP siRNA tratamiento sobre la apoptosis inducida por SCD1 abolición. Con este fin, hemos realizado co-tratamiento de las células HCT116 con el control de siRNA (SCR) o dirigido contra SCD1 (Scd1.A y Scd1.B), y con siRNA CHOP o control (-). Hemos validado CHOP siARN en las células HCT116 y mostró que CHOP siRNA no modificó nivel de extinción Scd1 mRNA inducido por Scd1 siRNAs (datos no mostrados). Con el fin de estimar la función CHOP en la apoptosis inducida por SCD1, se realiza entonces siRNA co-transfección. Observamos 72 h después de la transfección que CHOP silenciar HCT116 protegidos contra la muerte de las células apoptosis inducida por SCD1 extinción (Figuras 5F y 5G).
Células HCT116
A) trataron 72 h con el control de siRNA (SCR) o la orientación SCD1 ( Scd1.A y Scd1.B) se recogieron y la muerte total de células se analizaron por citometría de flujo después de la tinción con yoduro de propidio. Los resultados fueron la media ± SEM de tres experimentos realizados por triplicado. B) se recogieron las células HCT116 tratadas por siRNA 72 h después de la transfección y se prepararon para la caspasa 3 medición de la actividad por citometría de flujo como se detalla en los materiales y métodos. Los datos representan la media ± SEM de tres experimentos independientes. C) HCT116 se trataron como en A) y se cosecha para el análisis de SCD1 y la expresión de PARP-escisión por Western-Blot. D) HCT116 se trataron como en A) y se cosecha para la purificación de ARN total. la expresión de mRNA CHOP y SCD1 se analizó por tiempo real RT-PCR después de la normalización de ß-actina. Todos los experimentos representan al menos dos repeticiones, por triplicado. E) HCT116 células fueron transfectadas establemente con ADNc antisentido constructo CHOP humano y su vacío vector de control. BA1 y p-HCT116 son clones de HCT116 con CHOP construcción antisentido y el vector de control, respectivamente. Las células fueron silenciados por siRNA Scd1.A y Scd1.B durante 72 h, y se recogieron para el análisis total de la muerte celular por citometría de flujo después de la tinción con yoduro de propidio. Los resultados fueron la media de veces el cambio de células positivas PI relativos a las correspondientes células HCT116 siRNA scr ± SEM de un experimento representativo de tres experimentos realizados por triplicado. *, **, P & lt; 0,05 vs. siRNA células p-HCT116 y BA1, respectivamente, scr-tratada por análisis ANOVA seguido por la prueba de Tuckey. #, P & lt; 0,05 mediante análisis de ANOVA seguido por la prueba de Tuckey. F) y g) las células HCT116 se transfectaron con ARNsi scr, Scd1.A o Scd1.B a 75 nM, y, o bien con 25 nM de ARNsi scr (-) o siRNA CHOP. Las células se recogieron a las 72 h después de la transfección para la tinción PI y la caspasa 3 activa análisis por citometría de flujo. Los resultados fueron la media ± SEM de un experimento representativo de dos experimentos independientes realizados por triplicado. *, **, P & lt; 0,05 vs. células HCT116 tratadas con scr siRNA por análisis ANOVA seguido por la prueba de Tuckey correspondiente. #, P. & Lt; 0,05 mediante análisis de varianza seguido de la prueba de Tuckey
SCD1 agotamiento no afectó la viabilidad de las células no cancerosas
Las células cancerígenas fueron sensibles a SCD1 la muerte celular mediada por la depleción de .no eran entonces interesados en analizar el efecto potencial de una ausencia de síntesis
de novo
MUFA en las células no cancerosas. En este objetivo, se evaluó el impacto de la inhibición de SCD1 usando ARNip en fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). Estas células tienen una tasa de desaturación basal de 15% menor que las células U2OS y SW480 como se muestra anteriormente en la Figura 1C. Su tratamiento con siRNA Scd1.A o Scd1.B condujo a una reducción de la actividad de SCD para alcanzar una actividad restante de 8,3% y 6,3%, respectivamente (Figura 6B). La actividad de SCD residual fue similar a la obtenida para las células de cáncer tratados con el siRNA SCD1. Como se muestra arriba, la ablación de la actividad de SCD en las células cancerosas condujo a citotoxicidad mientras que el agotamiento de la expresión de SCD1 no indujo la muerte celular en NHDF pero reduce ligeramente su número de células (Figuras 6C y 6D). Luego, en las células no cancerosas, SCD1 derogación podría bloquear la proliferación sin afectar la viabilidad celular.
normales fibroblastos dérmicos humanos (NHDF) fueron transfectadas con siRNA control (SCR) y siRNA dirigidos SCD1 (Scd1.A y Scd1.B ). se recogieron las células NHDF después de 72 h de tratamiento siRNA y se recogieron para análisis adicionales. A) Las proteínas totales se prepararon para el análisis de la expresión de SCD1 mediante transferencia de Western. B) NHDF tratada 72 h con siRNA se incubaron durante 6 h con [
14C] ácido esteárico y la extracción de lípidos totales se llevó a cabo. La conversión de [
14C] ácido esteárico en ácido oleico se realizó por HPLC. la actividad de SCD se expresó como la relación de% de [
14C] ácido oleico a [
14C] ácidos oleico y esteárico. Los valores representan la media ± SEM de al menos dos experimentos separados. C) Estado de proliferación de las NHDF tratados con siRNA se determina en el momento indicado por el ensayo de proliferación CyQuant®. Cada valor es la media de unidades de fluorescencia relativa ± SEM de tres experimentos independientes. D) NHDF se recogieron 72 h después de la transfección y el análisis total de la muerte celular se realizó por citometría de flujo después de la tinción con yoduro de propidio. Los resultados fueron la media ± SEM de PI células positivas (%) por un representante de dos experimentos realizados por triplicado. *, P & lt; 0,05 frente siRNA células tratadas con scr mediante análisis ANOVA seguido de la prueba de Tuckey
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado que la expresión de SCD1 silenciamiento condujo a la inducción. de los marcadores de la UPR (empalme Xbp1, p-eIF2α y CHOP) y la muerte celular CHOP dependiente en las células cancerosas. También demostramos que la abrogación de la de novo vía de síntesis de ácidos grasos monoinsaturados por extinción de su enzima limitante de la velocidad Scd1 viabilidad alterado de las células de cáncer sin necesidad de cambiar la supervivencia de las células no cancerosas. Estos datos sugieren diferentes necesidades en la síntesis de novo de ácidos grasos monoinsaturados para las células normales y tumorales. Sin embargo, la adición exógena de ácido oleico, el principal producto de la actividad de SCD1 en ácidos grasos monoinsaturados, no previno la muerte celular de las células cancerosas en la que la biosíntesis de ácidos grasos monoinsaturados endógena fue suprimida.
En este informe, estamos de acuerdo con los informes anteriores de que la descripción de SCD1 extinción condujo a la muerte celular por apoptosis en diferentes tipos de células del cáncer [22], [25], [27], [39]. De hecho, se observó la inducción de la actividad de caspasa 3 y PARP-división (Figuras 2D y 2E) en las células-agotado SCD1.
También se evidencia en este trabajo que las células normales y cancerosas no respondieron de la misma manera que la prevención de la síntesis de ácidos grasos monoinsaturados por SCD1 extinción. En efecto, mientras que las células cancerosas murieron por el agotamiento de SCD1, las células no cancerosas todavía estaban vivos. Sin embargo, se observó una ligera disminución en el número de células en NHDF tratado con SCD1 que un bloque o una menor tasa de proliferación podían explicar. Podemos entonces la hipótesis de que la viabilidad de las células no cancerosas no se vio afectado debido al hecho de que no requieren una síntesis MUFA tan rápida y alta. De hecho, proliferan a una tasa más baja (Figura 6C) y preferentemente sostenidos nueva síntesis de la membrana a partir de ácidos grasos exógenos efectos de adopción mientras que las células cancerosas proliferan a una velocidad más alta y la necesidad de síntesis de ácidos grasos de novo [10].
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