Extracto
condroitín sulfato E (CS-E), un glicosaminoglicano altamente sulfatado, es conocido por promover la invasión tumoral y la metástasis. Debido a la presencia de CS-E se detecta tanto en las células tumorales y estromales en el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), la participación de múltiples etapas de CS-E en el desarrollo de PDAC se ha considerado. Sin embargo, su participación en la etapa temprana de la progresión de PDAC todavía no se entiende completamente. En este estudio, para clarificar el papel directo de la CS-E en el tumor, pero no del estroma, células de PDAC, que se centró en carbohidratos sulfotransferasa 15 (CHST15), una enzima específica que biosynthesizes CS-E, y se investigaron los efectos de la CHST15 siRNA sobre la proliferación de células tumorales
in vitro y el crecimiento
in vivo
. CHST15 mRNA es altamente expresado en las líneas celulares de cáncer pancreático humano Panc-1, MIA PACA-2, Capan-1 y Capan-2. CHST15 siRNA inhibe significativamente la expresión de ARNm CHST15 en estas cuatro células
in vitro
. El silenciamiento del gen en las células CHST15 se asoció con una reducción significativa de la proliferación y sobre regulación de la relacionada con el inhibidor del ciclo celular p21 gen
CIP1 /WAF1. En un modelo de tumor de xenoinjerto subcutáneo de PANC-1 en ratones desnudos, una única inyección intratumoral de CHST15 siRNA casi completamente suprimió el crecimiento tumoral. La reducción de señales de la proteína CHST15 asociados con necrosis tumoral se observó con el tratamiento con CHST15 siRNA. Estos resultados proporcionan evidencia de la acción directa de CHST15 sobre la proliferación de células tumorales pancreáticas, en parte a través de la p21
vía CIP1 /WAF1. proliferación de células tumorales tanto, mediadas eje CHST15-CS-E podría ser una nueva diana terapéutica en la etapa temprana de la progresión de PDAC
Visto:. Takakura K, Shibazaki Y, Yoneyama H, Fujii M, Hashiguchi T, Ito Z, et al. (2015) La inhibición de la proliferación celular y el crecimiento del cáncer pancreático por el silenciamiento de carbohidratos sulfotransferasa 15
in vitro Opiniones y en un modelo de xenoinjerto. PLoS ONE 10 (12): e0142981. doi: 10.1371 /journal.pone.0142981
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos |
Recibido: 7 Febrero, 2015; Aceptado: 29 de octubre de 2015; Publicado: December 7, 2015
Derechos de Autor © 2015 Takakura et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado, en parte, por la Fundación vida Mitsui Bienestar Social, el número de concesión N /a, SK. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Además de esto, los gastos necesarios se pagan con los recursos financieros de nuestra oficina médica (División de Gastroenterología y Hepatología, Departamento de Medicina Interna, La Escuela de Medicina de la Universidad de Jikei). Stelic Institute & amp; Co., Inc. prestado apoyo en forma de salarios de los autores (YS, HY, MF, TH), pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito . Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección "autores contribuciones"
Conflicto de intereses: Stelic Institute & amp;. Co., Inc. proporcionó apoyo en forma de salarios de los autores (YS, HY, MF, TH). Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) ha firmemente establecido como uno de los tumores humanos sólidos más letales en todo el mundo [1]. los casos de morbilidad y mortalidad relacionadas con el PDAC han mostrado tanto ir en aumento. , Es una necesidad urgente investigación de los mecanismos que subyacen a las características malignas del PDAC, como un diagnóstico tardío agresiva invasión, difusión temprana y quimio-resistencia para establecer un tratamiento eficaz y para mejorar el pronóstico. La progresión tumoral implica un proceso de múltiples pasos, tales como la proliferación, invasión, metástasis y angiogénesis, sin embargo, estos procesos siguen siendo poco conocidos en PDAC. En las células de cáncer de páncreas primarios, las señales proliferativas se mantienen constitutivamente activa de genes mutantes, y la proliferación infinita de genéticamente distintas sub-clones se observa antes del proceso de invasión. Las alteraciones genéticas pueden ocurrir en sitios distantes después de metástasis [2-4]. Todas las etapas de la progresión del tumor también se ven afectados por el microambiente que rodea donde glicano juega un papel fundamental en la modificación de las células tumorales y en mutaciones genéticas. Los tumores contienen diferentes glicosaminoglicanos (GAG) que regulan los comportamientos de células mediante la interacción con diferentes moléculas tales como factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, proteinasas y sus inhibidores [5]. GAGs incluyen sulfato de condroitina (CS), sulfato de heparina, sulfato de queratano, y ácido hialurónico. El esqueleto de azúcar de CS consiste en la repetición de unidades de disacárido de D-glucurónico acidβ1-3
N
acetil-D-galactosamina (GalNAc). Durante elongación de la cadena en la biosíntesis de CS, las unidades de disacáridos son modificados por sulfotransferasas específicos en C-2 de GlcA y C-4 y /o C-6 de GalNAc en varias combinaciones y muestran una enorme diversidad estructural, produciendo patrones de sulfato característica crítica para la unión a una variedad de proteínas funcionales. unidades de disacárido altamente sulfatados como E-unidad, GlcAβ1-3GalNAc (4S, 6S), donde 4S y 6S reposar por 4 a
O CD - y 6-
O -sulfato
, respectivamente, y preparaciones e-unidad ricos en CS (CS-e) son sintetizados por una enzima específica, sulfotransferasa hidratos de carbono 15 (CHST15), y muestran notables actividades biológicas [6-12]. La acumulación de pruebas ha puesto de manifiesto la implicación de CS-E en invasión de células tumorales y la metástasis en el pulmón [6, 13], ovario [7, 14], de mama [15] y la piel [16]. Se demostró el papel de CS-E en el inicio de la invasión de células tumorales, lo que sugiere el potencial de CS-E como una molécula clave en el establecimiento de nuevas terapias contra diversos tumores sólidos, incluyendo PDAC [17]
.
CS-E se expresa tanto en las células tumorales y las células del estroma que rodean al tumor en los tejidos de pacientes PDAC [17, 18]. Teniendo en cuenta el patrón de distribución de CS-E, la participación de múltiples etapas y multicelular de CS-E en la progresión del PDAC se ha considerado. Por lo tanto, es necesaria una investigación paso a paso para revelar los mecanismos precisos de CS-E en las características malignas subyacentes de la PDAC. Sin embargo, la participación de CS-E en la progresión preliminar PDAC aún no se ha explorado. En este estudio, para investigar si las funciones de CS-E directamente en la proliferación de PDAC o no, llevamos a cabo experimentos de bloqueo utilizando pequeños ARN de interferencia diseñado para inhibir la expresión de CHST15 (CHST15 siRNA) que inhiben selectivamente la biosíntesis de CS-E. En sencilla
in vitro
y
in vivo de xenoinjertos
experimentos, se demuestra el efecto de CHST15 siRNA sobre la proliferación de PDAC y se discute el potencial de la CS-E como una diana terapéutica para el PDAC.
Materiales y Métodos
Materiales y reactivos
CHST15 siRNA fue adquirido de Ambion, Inc. (Texas, EE.UU.). CS-E se obtuvo de SEIKAGAKU CORPORATION (Tokio, Japón), reconstituida en solución salina tamponada con fosfato, se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C. WST-1 se obtuvo de Roche Diagnostic GmbH (Mannheim, Alemania). Lipofectamina
™ RNAiMAX Reactivo y Invivofectamine
® 2.0 Reactivo se compraron de Invitrogen (CA, EE.UU.).
Las líneas celulares y ratones
PANC-1, MIA Paca-2, Capan-1 y Capan-2, las líneas celulares de cáncer de páncreas, se adquirieron de la ATCC (Rockville, MA, EE.UU.). Después de comprobar que las células estaban libres de infección por micoplasma usando el kit Mycoplasma PCR ELISA (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), PANC-1 y MIA PaCa-2, las células se cultivaron en DMEM (Sigma-Aldrich, CA) que contiene suero de ternera fetal 10% (FCS) y 1% de antibióticos. células Capan-1 y Capan-2 se cultivaron en IMDM (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón) y medio 5A de McCoy modificado (Sigma-Aldrich, CA) que contiene 10% de FCS y 1% de antibióticos, respectivamente. Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 /aire
La transfección de siRNA
ARN de interferencia (RNAi) se realizó mediante el método de transfección inversa:. Antes de la célula de recubrimiento , siRNA (50 nmol), Lipofectamine 2000 y Opti-MEM (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) los medios de comunicación se mezclaron y se incubó según las instrucciones del fabricante. Después de la transfección durante 48 h, se recogieron y se utilizan para los demás análisis.
tiempo real semi-cuantitativos RT-PCR
El ARN total fue extraído utilizando el sistema de aislamiento de ARN total SV (Promega células, WI, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. rendimiento de ARN y la pureza se determinaron por espectrofotometría. La transcripción inversa se realizó con el virus de leucemia murina de Moloney de la Transcriptasa Inversa (Invitrogen) y hexámeros aleatorios (Promega, WI). Real-time RT-PCR se realizó utilizando SYBR Green usando el termociclador DADOS acuerdo con las instrucciones del fabricante (TAKARA BIO INC., Otsu, Japón). Todos los cebadores de PCR se diseñaron y sintetizaron por TAKARA BIO INC. Niveles de expresión génica se normalizaron a deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) y presentada como unidades arbitrarias. Los cebadores sentido y antisentido utilizados se muestran en la Tabla 1. Y el primer secuencias se enumeran en la Tabla 2. Los experimentos independientes se repitieron tres veces para cada muestra, y se analizaron los niveles de expresión relativa de los genes.
WST-1 proliferación de las células de ensayo
Para el ensayo de proliferación celular, PANC-1, MIA Paca-2, Capan-1 y las células Capan-2 transfectadas con siRNA CHST15 o negativo de control de siRNA se sembraron en una placa de 96 pocillos a una concentración de 1 x 10
4 células /pocillo. La proliferación celular se examinó después de 60 minutos desde el inicio de la incubación con el reactivo de proliferación celular WST-1 (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania).
Ensayo de proliferación celular con HGF y CS-E
PANC-1 en las células (1.000 células) se sembraron en medio de cultivo en una placa de 96 pocillos el día antes de la estimulación HGF. Las células se estimularon con 5 ng /ml de HGF con o sin 100 mg /ml CS-E, y la proliferación celular se determinó usando el ensayo de WST-1 durante 120 minutos a 37 ° C.
tratamiento CHST15 siRNA en un modelo de xenoinjerto PANC-1 |
BALB /c ratones nude (6 a 9 semanas de edad) fueron adquiridos de CLEA-Japón (Tokio, Japón) y se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética del Experimentación Animal de la Facultad de Medicina de la Universidad de Jikei (Número de Permiso: 25-067). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento. células PANC-1 (1 × 10
7 células) en 100 l de BD Matrigel
™ Matrix (BD, NJ) se inyectaron por vía subcutánea en ambos flancos de ratones nude [19]. La inyección intratumoral de cualquiera de 100 l de 250 nM de control de siRNA o CHST15 siRNA complejo con Invivofectamine
® 2.0 reactivos (Life Technologies, CA) se llevó a cabo 7 días después de la inoculación. El tamaño del tumor se midió cada dos días. En el día 9 y el día 14, los ratones se sacrificaron, y se aislaron los tumores, se pesaron y se utilizan para la expresión de genes o análisis histológicos.
El análisis histológico
Los tejidos tumorales se fijaron en 10% de fosfato formol -buffered. Después de la fijación, los tejidos se incluyeron en parafina, y se cortaron láminas fueron utilizados para hematoxilina-eosina (HE) Tinción y tinción inmunohistoquímica tal como se describe anteriormente [20] para CHST15 utilizando un anticuerpo CHST15 anti-humano (Sigma-Aldrich) a una dilución de 01:25. Como anticuerpo secundario, Dako EnVision
™ reactivo de detección FLEX /HRP (Dako, Dinamarca) se utilizó. No se detectó señal positiva cuando se omite primer anticuerpo, el apoyo a la especificidad de la tinción (datos no mostrados).
El análisis estadístico
Todos los datos se presentan como la media ± desviación estándar (SD). Los análisis estadísticos se realizaron mediante ANOVA de una vía seguido de la corrección de Bonferroni o la prueba t de Student. Un
p valor Red de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
Meta-siRNA inducida por caída CHST15 en la línea celular de cáncer de páncreas
en primer lugar confirmó la expresión abundante de CHST15 ARNm en las líneas celulares de cáncer de páncreas PANC-1, MIA Paca-2, Capan-1 y Capan-2 utilizando RT-PCR. A continuación, estas cuatro células fueron transfectadas con cualquiera de dúplex específicos diana siRNA (siRNA CHST15) o un control de siRNA no específica (control siRNA). el silenciamiento de genes se midió en tiempo real de RT-PCR, y la expresión CHST15 se redujo en las células PANC-1 en un 1%, 85% y 87% en las muestras tratadas con siRNA específico de la diana durante 24 h, 48 hy 72 h, respectivamente . A las 48 h después de la transfección, se observó una supresión dependiente de la dosis de los niveles de expresión de ARNm CHST15 (datos no mostrados). Por lo tanto, en los estudios sucesivos, se investigó el efecto de siRNA CHST15 48 h después de la transfección de siRNA. expresión CHST15 se redujo en MIA PaCa-2, Capan-1 y las células en un 75%, 42% y 36% en las muestras tratadas con siRNA específico de la diana durante 48 h, respectivamente 2 Capan-.
Inhibición de páncreas proliferación de células cancerosas inducida por CHST15 siRNA
Para evaluar el efecto de CHST15 desmontables (Fig 1A), la proliferación celular se examinó 48 h después del inicio de la transfección siRNA usando el ensayo de WST-1. Los resultados mostraron el efecto supresor significativo de CHST15 siRNA sobre la proliferación celular en PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 y Capan-2 (Fig 1B). Un aumento en los niveles de expresión de genes p21 se detectó en células tratadas con ARNsi CHST15 comparación con las células tratadas con ARNsi de control en PANC-1 y Capan-2 (Fig 1C)
.
(A) las cantidades relativas de mRNA en CHST15 control de siRNA tratada y CHST15 siRNA tratada PANC-1, MIA PaCa-2, células Capan-1 y Capan-2 (n = 3 en cada uno) se muestra después de la normalización usando GAPDH como control interno. En cada uno de las líneas celulares, se observaron diferencias significativas acerca de la reducción de la expresión CHST15 en las muestras tratadas con siRNA específico de la diana durante 48 h. Asteriscos (**, ***) p & lt; 0,01, P & lt; 0,001, respectivamente entre el control de siRNA y CHST15 siRNA. (B) un ensayo de WST-1. El nivel medio de la proliferación en las células tratadas con ARNsi de control (columna negro) se expresó como un estándar (1,0) y los datos se muestra con relación a la norma como un índice de proliferación. Media ± SD (n = 3). No se observaron efectos supresores significativas de CHST15 siRNA sobre la proliferación celular en PANC-1, MIA PaCa-2, Capan-1 y Capan-2. Los asteriscos (*, **) p & lt; 0,05, P & lt; 0,01, respectivamente entre el control de siRNA y CHST15 siRNA. (C) las cantidades relativas de ARNm de p21 en el control de siRNA tratar y CHST15 siRNA células tratadas PANC-1 (n = 3 a 5 en cada uno). Había un ligero aumento y un aumento significativo del ARNm de p21 en CHST15 siRNA células tratadas PANC-1 y Capan-2 células en comparación con el control de siRNA, respectivamente. El asterisco (*) p & lt; 0,05 entre CHST15 siRNA y control de siRNA
Efecto de siRNA CHST15 en el crecimiento del tumor de páncreas en un modelo de xenoinjerto
Después de confirmar PANC-1 de crecimiento de células en el. ratones desnudos en el día 7 después de la inoculación, se investigó el efecto supresor de CHST15 siRNA en PANC-1 proliferación celular
in vivo gratis (figura 2). Después de la inyección de células PANC-1 en ambos costados de ratones desnudos, se administró CHST15 ARNsi en cada tumor en el día 7. El efecto antiproliferativo de CHST15 siRNA se identificó en contra del control de siRNA tras día 9. células PANC-1 tratados con siRNA crecieron CHST15 más lentamente que el control de las células tratadas con siRNA y las células no tratadas (Fig 2A). Estos resultados indican que la proliferación de las células PANC-1 fue suprimido después de la caída de CHST15. en tiempo real RT-PCR se realizó para evaluar el efecto del gen supresor, pero no hubo diferencia significativa en la expresión de genes entre CHST15 siRNA tratada y los ratones de control siRNA tratados ya sea en día 9 (datos no mostrados) o el día 14 (Fig 2B ).
(A) El cambio de volumen del tumor. Los datos se expresan como media ± desviación estándar (no tratada; n = 6, Control de siRNA: n = 12, CHST15 siRNA; n = 10). Los asteriscos (*, ***) p & lt; 0,05, P & lt; 0,001, respectivamente entre el control de siRNA y CHST15 siRNA. (B) las cantidades relativas de ARNm en CHST15 sin tratar, control de siRNA tratada y CHST15 siRNA xenoinjertos tratados en el día 14. Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (no tratada; n = 6, ARNip de control: n = 12, CHST15 siRNA; n = 10 ).
el examen patológico del tumor pancreático por hematoxilina y eosina e inmunohistoquímica
con el fin de demostrar la eficacia de CHST15 siRNA, los tumores pancreáticos en los ratones desnudos fueron analizados por sE tinción y CHST15 tinción inmunohistoquímica (Fig 3). En la tinción HE, se observó necrosis generalizada en el grupo CHST15 siRNA (Figura 3A) en comparación con el grupo de control siRNA (Figura 3B). La localización de CHST15 en el xenoinjerto se evaluó mediante inmunotinción contra la proteína CHST15 humano. CHST15 fue altamente expresado por las células tumorales localizadas en el frente invasivo (Fig 3A y 3C). Strong CHST15-tinción se detectó en el citoplasma de las células con morfología mesenquimal similar (Fig 3E). En el centro del tumor, la expresión de CHST15 fue relativamente menor en comparación con el frente invasivo (Fig 3A y 3C). localización débil de CHST15 era detectable en las células de la estructura similar a un cordón (Fig 3F). Por el contrario, se reveló una clara pérdida de tinción CHST15 en las regiones del tumor del grupo CHST15 siRNA (Figura 3D y 3G).
(A, B) Los tumores en ratones desnudos en el día 19 se tiñeron con HE ( aumento original x 100). Se muestran imágenes representativas. Las lesiones de necrosis generalizadas fueron prominentes en el CHST15 siRNA ratones tratados (A) en comparación con el control de siRNA ratones tratados (B). (C, D, E, F, G) La tinción inmunohistoquímica de CHST15 (× 100 para C, D, E x400 para, F, G, marrones aumentos originales) en xenoinjertos en el día 19. Las imágenes representativas se muestran. Aunque casi todas las células tumorales en xenoinjertos fueron positivos para CHST15 en el control de siRNA ratones tratados (D), se observó una fuerte señal positiva en el frente invasivo en vez de el centro de tumor. CHST15-altamente positiva células tumorales exhiben morfología mesenquimales-como (E), mientras que CHST15 bajo células positivas tuvieron una morfología similar a un cordón (F), Por el contrario, pequeño número de células tumorales remanentes fue débilmente positivo para CHST15 en los ratones tratados CHST15 siRNA (C ).
CS-E promueve la proliferación de células PANC-1 en presencia de HGF
el efecto de CS-E en la proliferación de células PANC-1 se evaluó
in vitro gratis (figura 4). Aunque HGF es conocido por promover la proliferación de células tumorales, la dosis más baja de HGF utilizado en este estudio no indujo la proliferación de células tumorales significativa. Sin embargo, el índice de proliferación de PANC-1 fue significativamente mayor con la misma dosis de HGF en presencia de CS-E (Fig 4).
Un ensayo de WST-1 se realizó utilizando PANC-1 celular. El nivel medio de la proliferación en las células PANC-1 sin la adición de CS-E y HGF (columna blanca) se expresó como un estándar (1,0) y los datos se muestra con relación a la norma como un índice de proliferación. El índice de proliferación en las células PANC-1 tratados con HGF dosis baja (columna negro) no mostró diferencias estadísticamente significativas en el sistema de cultivo. En contraste, el índice de proliferación en las células tratadas con HGF PANC-1 aumentó significativamente cuando se añade CS-E (columna gris). Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (n = 6 en cada uno).
Discusión
El pronóstico para los pacientes PDAC sigue siendo pésimo, y revolucionario están fuertemente requieren opciones terapéuticas. Se sabe que la alta mortalidad asociada con PDAC se atribuye principalmente a su agresividad sin par debido a su invasión precoz y metástasis a distancia. Estas características malignas se observan en otros tumores como el cáncer de ovario avanzado. En el cáncer de ovario, CS-E se detecta tanto en las células tumorales y estroma y está implicado en la agresividad sin par del cáncer y se correlaciona con mal pronóstico [21]. En base a sus patrones de distribución similares, se cree que tanto derivado de células de tumor, así como células estromales derivadas de CS-E juega un papel vital en las diversas etapas de la progresión del tumor en los tumores avanzados.
Para investigar el papel de CS-e en PDAC, se utilizó CHST15 siRNA, que inhibe selectivamente la expresión del gen CHST15 y la síntesis de CS-e. Elegimos este método debido a que la inhibición selectiva de la CS-E usando una cantidad suficiente de inhibidores químicos o anticuerpos es todavía un reto
in vivo
. Nos hemos centrado en el efecto de CHST15 directamente en el tumor, pero no del estroma, la proliferación celular, un paso de progresión del tumor primario, en la línea celular de cáncer pancreático humano PANC-1. En la proliferación de tumores, se ha informado de GAGs para actuar como co-receptores para factores de crecimiento tumoral solubles. GAGs facilitan la formación de complejos ligando-receptor y la activación de la señalización del receptor
.
Debido a que HGF es uno de los factores solubles clave producidos por las células tumorales así como las células del estroma en PDAC, hemos probado si la actividad de HGF podría aumentarse en presencia de CS-E. Incluso cuando se utiliza una menor concentración de HGF, que no pudo inducir la proliferación de células tumorales, un aumento significativo en la proliferación se confirmó en presencia de CS-E (Fig 4). CS-E sola no indujo la proliferación de células tumorales en las concentraciones indicadas, lo que indica que el CS-E aumenta la señalización del receptor de HGF.
De forma inesperada, CHST15 siRNA solo inhibe directamente la proliferación de células PANC-1
In
vitro. También se propuso un mecanismo distinto de co-receptores. Aunque no examinamos la cinética detalladas durante el cultivo, los niveles de la relacionada con el inhibidor del ciclo celular p21 gen
CIP1 /WAF1 aumenta en las células PANC-1 [22] que mostró una reducción significativa en los niveles CHST15 mRNA a las 48 h, lo que sugiere ese gen CHST15 silenciamiento modificado vías aguas arriba de p21. A este respecto, sobre regulación de p21 se ha informado en algunas condiciones en las células de cáncer de páncreas. Por ejemplo, el bloqueo de la señalización de Hedgehog inducida sobre regulación de p21 [23, 24]. Debido a la interacción GAG-CS-erizo se ha informado a mejorar la señalización de Hedgehog [25], una posibilidad es que el bloqueo de la síntesis de CS-E podría contribuir a la inhibición de la señalización de Hedgehog, lo que llevaría a una sobre regulación de p21. Se necesita más investigación para entender los mecanismos mediados por CHST15 regulación de la proliferación de células de cáncer relacionados con la vía de p21.
También probamos el efecto de siRNA CHST15 sobre el crecimiento tumoral mediante inyección intratumoral en un modelo de xenoinjerto. Después de establecer el tumor, una sola inyección de CHST15 siRNA suprimió significativamente más el crecimiento del tumor (Fig 2A). No se observó reducción significativa de los niveles de ARNm humanos CHST15 una semana después de la inyección CHST15 siRNA, en el momento del sacrificio, en comparación con ARNsi de control negativo. En contraste, el examen histológico del xenoinjerto mostró claramente la reducción de las células tumorales en proteínas positivo CHST15 humano por CHST15 siRNA una semana después de la inyección única, lo que indica que se obtuvo una inhibición exitosa de CHST15. Una posible explicación para el desequilibrio de ARNm-proteína es que el nivel de mRNA CHST15 humano derivado del tumor alcanzó un máximo en puntos de tiempo anteriores y disminuyó después de días 9, después de lo cual la eficacia de mRNA no se pudo detectar suficientemente. Otra posibilidad es que el nivel crítico de CHST15 mRNA no se detecta suficientemente solamente por el método de PCR. Dado que las células tumorales CHST15-altamente expresado sólo pueden ser detectados en el frente invasivo, pero no en el centro de xenoinjerto, se considera que
in vivo
CHST15 siRNA actúa principalmente sobre estas células tumorales localizadas en el frente invasivo. El número de estas células está limitado entre las células tumorales completas y las señales de ARNm no se detectará de manera suficiente por PCR que utiliza toda la muestra de xenoinjerto. Una vez que la iniciación del crecimiento del tumor fue suprimida por la CHST15 siRNA, y, posteriormente, la producción de proteína CHST15 fue inhibido, las señales de crecimiento adicionales proporcionados por los factores de crecimiento mediados por CHST15 podrían haber sido suprimidos con eficacia. Más estudios para evaluar la evolución en el tiempo y /o inyecciones repetidas siRNA podría aclarar el
in vivo
mecanismo que subyace a la relación de ARNm-proteína.
El presente estudio demostró, por primera vez, que CHST15 siRNA podría suprimir el crecimiento tumoral, que se considera como una etapa primaria de la progresión del tumor en el sitio primario. Sin embargo, hay varias limitaciones en el presente estudio. En primer lugar, sólo se utilizaron células PANC-1 in vivo si bien, hemos utilizado tres diferentes líneas celulares in vitro y observaron efectos similares de CHST15 siRNA en la proliferación de células tumorales. En segundo lugar, se utilizó un modelo de xenoinjerto de piel para simplemente examinar el efecto de CHST15 siRNA sobre la proliferación y el crecimiento de las células tumorales. modelos de xenoinjertos ortótropos proporcionarán más información sobre el papel de CHST15 siRNA en la proliferación celular tumoral en un microambiente tumoral. Valdrá la pena intentar aclarar toda la imagen del papel de CHST15 y CS-E en la progresión del PDAC mediante el análisis de las características de células específicas y la etapa-específicas.
La ruta de la entrega de siRNA se limitaba a una inyección intratumoral En el presente estudio. Sin embargo, consideramos que la inyección local tiene algunas ventajas cuando se trata de tumores hipovasculares como en PDAC y de siRNA cuya entrega sistémica sigue siendo un reto. En realidad, la inyección intratumoral de siRNAs es actualmente disponibles en entornos clínicos. Una ecografía endoscópica (EUS) no es sólo una herramienta de diagnóstico, sino también un procedimiento de intervención y terapéutico. La evidencia de que la USE intervencionista es útil para el tratamiento PDAC a través de la terapia de inyección incluyendo siRNAs ha ido acumulando constantemente [26-30]. USE intervencionista será una parte esencial del enfoque multidisciplinario para el tratamiento del cáncer en un futuro próximo. Esta técnica ofrece la posibilidad de tratar PDAC de una manera directa y relativamente mínimamente invasiva, con una incidencia muy baja de complicaciones relacionadas con el procedimiento. Consideramos que la aplicación clínica de CHST15 siRNA utilizando la aguja de inyección EUS-fino para los pacientes PDAC será factible en una clínica real.
En resumen, nuestro estudio demostró que el ARNi mediada baja regulación de CHST15 inhibe eficazmente la la proliferación y el crecimiento de las células tumorales pancreáticas. La vía de señalización CHST15 juega un papel importante en la proliferación y el crecimiento PDAC y puede servir como una posible diana terapéutica para el PDAC. Se necesitan más estudios para aclarar el efecto y el riesgo de CHST15 silenciamiento génico por CHST15 siRNA en el desarrollo PDAC y para permitir su uso en aplicaciones clínicas.
Apoyo a la Información
S1 de base de datos. .-Efecto del gen supresor de CHST15 siRNA en el día 9-tumoral en un modelo de xenoinjerto
cantidades relativas de CHST15 mRNA en el control de siRNA tratada y CHST15 siRNA xenoinjertos tratados en el día 9. Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (Control de siRNA: n = 7, CHST15 siRNA; n = 5)
doi: 10.1371 /journal.pone.0142981.s001 gratis (DOCX)
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