Extracto
El inhibidor del proteasoma bortezomib (Velcade) es un nuevo agente prometedor para el cáncer de vejiga terapia, pero los mecanismos citoprotectores inducibles pueden limitar su posible eficacia. Se utilizó toda la expresión de ARNm genoma de perfiles para estudiar los efectos de bortezomib sobre la expresión génica inducida por estrés en un panel de líneas celulares de cáncer de vejiga humana. Bortezomib inducida fuerte regulación al alza de la Hsp70 inducible isoformas HSPA1A y HSPA1B isoformas de Hsp72 en 253J BV y SW780 (HSPA1A
alto) las células, pero sólo induce la isoforma HSPA1B en UM-UC10 y UM-UC13 (HSPA1A
bajo) Células. Bortezomib estimula la unión de factor de choque térmico-1 (HSF1) al promotor HSPA1A en 253JB-V, pero no en las células UM-UC13. Metilación específica de PCR reveló que el promotor HSPA1A fue metilado en el HSPA1A
líneas de bajo de células (UM-UC10 y UC13-UM), y la exposición al agente de desmetilación cromatina 5-aza-2'- desoxicitidina restaurados expresión HSPA1A. La sobreexpresión de Hsp72 promovido bortezomib resistencia en las células UM-UC10 y UM-UC13, mientras que caída transitoria de HSPA1B sensibilizó a estas células al bortezomib, y la exposición a la sensibilidad bortezomib promovido inhibidor HSF1 química KNK-437 en las células 253J B-V. Por último, shRNA mediada desmontables estable de Hsp72 en 253J-B V promueve la sensibilidad a bortezomib
in vitro Opiniones y xenoinjertos de tumores en
in vivo
. En conjunto, nuestros resultados proporcionan una prueba de concepto para el uso de inhibidores de Hsp72 para promover la sensibilidad bortezomib en los cánceres de vejiga y sugieren que la orientación selectiva de HSPA1B podría producir letalidad sintética en los tumores que muestran promotor metilación HSPA1A
Visto:. Qi W , White MC, Choi W, Guo C, Dinney C, McConkey DJ, et al. (2013) La inhibición de la proteína de choque térmico inducible-70 (Hsp72) Mejora inducida por bortezomib muerte celular en células del cáncer de vejiga humana. PLoS ONE 8 (7): e69509. doi: 10.1371 /journal.pone.0069509
Editor: Kevin Robert Kozak, Universidad de Wisconsin Escuela de Medicina y Salud Pública, Estados Unidos de América
Recibido: December 11, 2012; Aceptado: June 10, 2013; Publicado: 18 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Qi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de la espora MD Anderson en cáncer genitourinario (P50 CA091846), del Centro del cáncer de Apoyo Grant (CA016672), y la inhibición del proteosoma y ER estrés (R01 CA127494). Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o perparation del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los estudios recientes han establecido que el aumento de la síntesis de proteínas (traducción) es crucial para la transformación neoplásica. Como consecuencia de este aumento, las células cancerosas parecen ser particularmente vulnerables a los agentes inhibidores de la eliminación de agregados de proteínas mal plegadas o producidos como un subproducto normal de la síntesis de proteínas. El proteasoma desempeña un papel central en el aclaramiento de proteínas dañadas, y los inhibidores del proteasoma inducen la muerte de células tumorales en gran parte a través de la agregación de proteínas y proteotoxicity. Sin embargo, los mecanismos citoprotectores están regulados por incremento de la inhibición del proteasoma, lo que limita el impacto sobre la muerte de las células del cáncer [1], [2], [3]. Por lo tanto, es posible que los tumores que poseen defecto (s) en estos mecanismos citoprotectores ser especialmente sensibles a los inhibidores del proteasoma. Si se pueden identificar los mecanismos citoprotectores pertinentes, puede ser posible identificar estos tumores de forma prospectiva. Alternativamente, puede ser posible desarrollar enfoques terapéuticos que interrumpen estos mecanismos citoprotectores promoviendo así la sensibilidad inhibidor del proteasoma en tumores que de otro modo serían resistentes a esta clase de fármacos.
choque térmico también induce la agregación de proteínas y proteotoxicity con choque térmico proteínas (HSPs) que promueven la tolerancia al calor mediante la prevención inapropiado estrés inducido por la agregación de proteínas, ayudando en el replegamiento apropiado de proteínas desnaturalizadas, y, si fuera necesario, promoviendo su degradación [4], [5], [6]. Los miembros de la familia Hsp70 se encuentran entre las proteínas más altamente conservadas en la evolución y desempeñan papeles críticos en estos procesos [7]. El principal elemento inducible por estrés de la familia chaperona Hsp70 se conoce como Hsp72 y está codificada por dos genes, HSPA1A y HSPA1B, que producen isoformas de Hsp72 que comparten todos menos dos aminoácidos, y se cree que son funcionalmente redundantes [8]. expresión de Hsp72 se controla a través de la activación rápida de factor de choque térmico-1 (HSF1), un factor de transcripción que se une a varios elementos de respuesta específicos localizados dentro de los promotores de isoformas de Hsp72 y los promotores de otros chaperones citoprotectores inducidas por el calor [9]. Hsp72 es altamente homóloga a la proteína 78 regulada por la glucosa kDa (HSPA5, GRP78 /BIP) que juega un papel central en la coordinación de la activación de la respuesta de la proteína desplegada (UPR) y también es inducida por los inhibidores del proteasoma [10]. Hsp72 se expresa constitutivamente a niveles altos en los tumores malignos de diversos orígenes [11], [12], la promoción de la supervivencia de células de cáncer [13], [14]. Es importante destacar que, Hsp72 también es inducida con firmeza por los inhibidores del proteasoma [15], [16].
En un estudio previo se informó de que aproximadamente la mitad de las células del cáncer de vejiga humanos son resistentes a los efectos citotóxicos de bortezomib
In
vitro [17]. Aquí, utilizamos perfiles de expresión génica para examinar los mecanismos citoprotectores que contribuyen a la resistencia a bortezomib, y encontramos que la Hsp72 es uno de los genes más fuertemente inducidos a nivel de ARNm después de la exposición bortezomib. Sin embargo, se encontró que la expresión de Hsp72 es isoforma-específicos en un subconjunto de células de cáncer de vejiga (UM-UC10 y UC13 UM-) como resultado de la metilación del promotor de la isoforma HSPA1A. Estas células presentan una mayor expresión de la isoforma HSPA1B tal que basal y los niveles de proteína Hsp72 bortezomib inducida son similares a las que se encuentran en las líneas celulares que expresan tanto A1A y A1B isoformas (253JB-V y SW780). Informamos además, que la supresión de la inducción de Hsp72 mejorado la muerte celular inducida por bortezomib en tanto 235JB-V y UM-UC10, y la sobreexpresión de Hsp72 protegidos UM-UC10 y las células UM-UC13 de citotoxicidad inducida por bortezomib. En general, independientemente de la isoforma de la proteína Hsp72 genera la expresión, nuestros datos muestran que la supresión de la inducción de Hsp72 mejora bortezomib sensibilidad y apoyo para la consolidación de los inhibidores de HSF1 y Hsp72 para aumentar la sensibilidad bortezomib en los cánceres de vejiga.
Materiales y Métodos
las líneas celulares y reactivos
líneas celulares de cáncer de vejiga se obtuvieron a partir de la línea celular de cáncer de vejiga MD Anderson SPORE repositorio y se mantuvieron en MEM suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) (Omega Scientific, Tarzana, CA). La autenticidad de todas las líneas celulares se confirmó en depósito por la huella de ADN, y su identidad se confirmó rutinariamente durante la experimentación en el MD Anderson Caracterizado línea celular de núcleo [18]. línea celular 253-JB-V, [19] UMUC-10, [20] y UMUC-13 [20] fueron aisladas de pacientes con cáncer urotelial. SW780 se compró a la American Type Culture Collection (ATCC) en Biocompare.com. Bortezomib fue adquirido de ChemieTek (IN, EE.UU.). Para
in vitro
experimentos, bortezomib se disolvió en DMSO a una concentración madre de 10 mM, se esteriliza por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras, con alícuotas almacenadas a -20 ° C hasta su uso. Antes del uso, la madre se diluyó en medio a las concentraciones deseadas. Para la inyección de los ratones, el bortezomib se disolvió en solución salina que contiene 10 mg /ml de manitol justo antes del tratamiento.
Ensayos de viabilidad celular
Las células fueron expuestas al bortezomib, recogido en los puntos de tiempo indicados por tripsinización, y se resuspendieron en 500 l de PBS. Cincuenta l de PBS, pH 7,4, que contiene 100 mg /ml de yoduro de propidio (PI) se añadió a las células resuspendidas y la captación de PI (indicativo de la muerte celular), se analizó inmediatamente por citometría de flujo (FACS) en un Cytomics FC 500 con software CXP (Beckman Coulter, Fullerton, CA.
Para la exclusión de azul de tripano, las células se recogieron por tratamiento con tripsina, se tiñeron con 0,4% de azul de tripano (Invitrogen), y las células se contaron usando un hemocitómetro. se llevó a cabo el experimento por triplicado.
los análisis de microarrays
Microarray experimentos se realizaron como se describe anteriormente [21], con modificaciones menores. se aisló ARN de las células utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island, NY ), seguido de la limpieza con RNeasy Mini kits (Qiagen, Germantown, MD). el ARN se utiliza para la síntesis de cRNA marcado con biotina, que se preparó utilizando el kit de amplificación de ARN Illumina (Ambion /Life Technologies), y luego se hibridan a Illumina Human-HT12 (Illumina, Inc., Hayward, CA) fichas. virutas lavadas se escanea con BeadStation 500x (iluminación) y las intensidades de las señales cuantificadas con BeadStudio (iluminación). El mapa de calor se realiza mediante Cluster 3.0 y Java Treeview del laboratorio Eisen (http://www.eisenlab.org/eisen/). El conjunto de datos de microarrays se puede encontrar en la expresión de genes de Omnibus, número de acceso GSE46132.
ARNm Extracción, transcripción inversa y cuantitativa en tiempo real PCR
extracción de ARNm y la transcripción inversa se realizaron como se describe anteriormente [22 ]. Se aisló ARN de células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen), y la síntesis de ADNc se realizó utilizando superíndices III First-Strand Synthesis System para RT-PCR (Invitrogen). PCR en tiempo real para HSPA1A, HSPA8, HSPB1, DNAJB1, y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) se realizó con un sistema de PCR en tiempo real StepOne (Applied Biosystems /Life Technologies). Los conjuntos de cebadores TaqMan para HSPA1A (Hs00359163_s1), HSPA1B (Hs00271244_s1), pan-HSPA1A & amp; HSPA1B (Hs00271229_s1), HSPA8 (Hs03045200_g1), HSPB1 (Hs03044127_g1), DNAJB1 (Hs00428680_m1), y para GAPDH (4333764F) se compraron de Applied Biosystems. El protocolo de amplificación consistió en un ciclo a 50 ° C durante 2 min, un ciclo a 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 60 s, y los niveles de transcripción se cuantificaron utilizando el comparativo C
T método. Los datos resultantes se analizaron con el software StepOne y se expresaron como la media de los coeficientes de (expresión relativa de controlar) ± SE, y GAPDH sirvió como control de carga interno.
tratamiento de células con 5-aza-2' desoxicitidina (5-AzdC) guía
Las células se cultivaron en placas a baja densidad (~ 5 × 10
4 células /pocillo) en placas de 6 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. Las células se expusieron a 5 M 5-AzdC disuelto en ácido acético al 50% durante 5 días. Bortezomib (30 nM) se añadió a los pocillos apropiados de 6 horas antes de la recolección en el día 5, y se recogieron las células para el aislamiento de ARN. 5-AzdC se obtuvo de Sigma.
metilación del ADN Análisis
ADN genómico se aisló utilizando un kit de aislamiento de ADN genómico (Qiagen). ADN (1 g) se convirtió con bisulfito de sodio usando el Kit bisulfito EpiTect (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. A continuación, la bisulfite modificados de ADN se sometió a PCR específica de metilación (MSP). Los cebadores utilizados para MSP fueron diseñados utilizando Methprimer. El conjunto de cebadores de ADN metilado fue convertida 5'-TGTTTTTTTTATTCGGATTAGTTAAC-3 '(hacia delante) y 5'-CCACCTACTCGCTAAAACTACGTA-3' (hacia atrás); El conjunto de cebadores de ADN metilado fue convertida 5'TTTTTTTTATTTGGATTAGTTAATGT -3 '(hacia delante) y 5'-CCCACCTACTCACTAAAACTACATA -3' (inverso). El protocolo de PCR incluía una incubación inicial a 95 ° C durante 10 min, seguido de 35 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 49 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 40 s, seguido de un ciclo de 72 ° C durante 10 minutos. productos MSP PCR se separaron en geles de agarosa al 2% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Totalmente ADN de control metilado y no metilado ADN de control se utilizaron como controles.
Immunoblotting
Las células se recogieron por tripsinización y se lisaron en tampón que contiene 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 150 mM, 1 Na mM
EGTA 2EDTA, 1 mM, 1% de Triton, pirofosfato de sodio 2,5 mM, 1 mM de beta-glicerofosfato, mM Na 1
3VO4, 1 mg /ml de leupeptina y 1 mM PMSF. extractos de células enteras (20 mg de proteína total) se sometieron a electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida sulfato de-10% (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA). Membranas se probaron primero con un anticuerpo monoclonal específico para la Hsp72 (SPA-810, StressGen /Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY), HSF1 (SPA-901, Stressgen /Enzo) o beta-actina humana (Sigma, St. Louis , MO), y después con segundos anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano picante apropiadas (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX). La inmunodetección se realizó utilizando ECL (Amersham, Piscataway, NJ) según las instrucciones del fabricante.
Inmunoprecipitación de cromatina
Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se realizó con el kit de chip-IT ™ expreso enzimática, y chip Kit de control -IT ™ (Active Motif) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células de control y tratados con bortezomib 253JB-V y UM-UC13 (1,5 × 10
7 cada uno) fueron fijadas durante 8 minutos a temperatura ambiente y esquilada por digestión enzimática durante 10 minutos. La cromatina esquilada produjo bandas entre 200 a 1.500 pares de bases como se visualiza por electroforesis en gel de agarosa. ADN unido a HSF1 se precipitó con un anticuerpo anti-HSF1 (Stressgen /Enzo, SPA-901). Para amplificar el promotor HSPA1A unido a HSF1, el ADN precipitado se sometió a PCR en tiempo real utilizando la expresión génica TaqMan® Master Mix con Custom TaqMan® Gene cebadores ensayo de expresión (ABI) correspondiente a la región de unión a HSF1 del promotor HSPA1A ( -10 a -180) [23], [24]. PCR en tiempo real se realizó a través de ABI StepOne con las condiciones siguientes: 5 minutos a 50 ° C; 10 minutos a 95 ° C; luego 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, 60ºC durante 60 segundos. Los datos presentados representan los resultados de tres experimentos chip separado y se normalizaron a reacciones llevadas a cabo con 1% de la entrada. También se llevaron a cabo las reacciones finales de PCR como se describe anteriormente [25] para confirmar los resultados en tiempo real PCR. anticuerpo IgG normal se utilizó como control.
modulación molecular de Hsp72 Expresión
El TRCN0000008762 lentiviral construcciones basadas en pLKO.1 y TRCN0000008757 dirigido específicamente el gen Hsp72 fueron adquiridos de Abrir Biosystems, Inc. El vector pLKO.1 vacío se utilizó como control. Los virus recombinantes se producen por transfección con fosfato de calcio de las células HEK293T utilizando protocolos estándar. Al día 2-3 post-cultivo, las células 253J-BV se incubaron con shRNAs y polibreno (6 g /ml) para 16~24 horas, y se seleccionaron las células transducidas en 1 g puromicina /ml. Para silenciamiento transitorio de Hsp72 en células UM-UC10, se incubaron las células en 6 o placas de 24 pocillos durante 72 horas con o bien no la orientación (D-001206-14-20), siHSPA1A (L-005168-00), o HSPA1B (L-003501-00) siRNA construye de Dharmacon /Thermo Scientific, Waltham, MA. Se utilizó Lipofectamina RNAiMAX transfectionreagent (Invitrogen) para mejorar la entrega de ARNsi de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la sobreexpresión de Hsp72, el control RFP Precision LentiORF (OHS5832) y Precision LentiORF clon individual para HSPA1A (OHS5897-100998480) fueron adquiridos de Abrir Biosystems, Inc. Se seleccionaron las células transducidas en 5 mg /ml blasticidin y FACS clasificación de células GFP positivas .
lisosomales Integrity Ensayos
Las células (~1-2 × 10
5) se sembraron en placas de 6 pocillos y se dejó que se unieran durante la noche. Las células fueron entonces expuestos a bortezomib para 24 h. Después de los tratamientos farmacológicos, 100 nM LysoTracker Red DND-99 (Molecular Probes /Life Technologies, Grand Island, NY) se añadió a las células durante 30 minutos antes de la cosecha. Las células se tripsinizaron, se lavaron una vez con PBS, y se resuspendieron en PBS fresco, y la fluorescencia se midió usando un flujo de Beckman Coulter FC500 citómetro.
xenoinjerto Estudios
Femenino ratones desnudos atímicos se adquirieron de Cáncer Nacional Institute (NCI-Frederick). Los ratones fueron alojados y mantenidos en condiciones libres de patógenos específicos en instalaciones aprobadas por la Asociación Americana para la Acreditación de Laboratorio Animal Care y de acuerdo con las regulaciones y normas del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos actuales. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center de Cuidado de Animales y el empleo Comisión (Protocolo ACUF#11-00-12734). Los ratones son monitoreados diariamente, incluyendo fines de semana y días festivos, con la eutanasia a cabo utilizando CO2 en el caso de cualquiera de los siguientes: tumor mayor de 1,5 cm, & gt; 20% de pérdida de peso, letargo, incapacidad para obtener alimentos y /o agua, trabajosa la respiración, postura encorvada, distensión abdominal, equivalente a un ratón embarazadas, o incapacitado como consecuencia del crecimiento del tumor.
ratones Nude (NIH, 6 semanas de edad) fueron inoculados por vía subcutánea (sc) con 2 × 10
6 253J BV células transducidas con el constructo HSPA1A shRNA (253JB-V.KDHsp72) o una orientación no construcción de control (253JB-V.NT) (10 ratones /grupo). Cuando los tumores se hicieron palpables (5~7 días), los ratones se asignaron aleatoriamente a controlar o grupos de tratamiento. Los ratones se trataron i.v. (A través de la vena de la cola) cada dos semanas con 1 mg /kg bortezomib formulado en solución salina que contiene 10 mg /ml de manitol en un volumen de 100 l o con solución salina 100 l que contiene 10 mg /ml de manitol como un control del vehículo. mediciones de calibre de los diámetros tumorales perpendiculares más largos se realizaron dos veces por semana después del inicio del tratamiento, y los volúmenes de los tumores se calcularon utilizando la fórmula: W * W * L /2 (donde W y L representa diámetro transversal, y el más largo longitudinal) . Para H & amp;. E análisis, los tumores fueron recogidos de los ratones 24 horas después del segundo tratamiento de drogas y luego fijadas en OCT y el 10% de formalina
UCSC Genome Browser
La UCSC Genome Browser [26] se utilizó para identificar la presencia de una isla CpG que rodea la región del promotor HSPA1A, dentro del navegador Genoma, se utilizó la enciclopedia de elementos de ADN consorcio base de datos (ENCODE) [27] para identificar la presencia de metilación en otros tipos de células. La UCSC Genome Browser está disponible públicamente en la siguiente dirección:. Http://genome.ucsc.edu/
Estadísticas
Las estadísticas se generan utilizando
t
test de Student funciones disponibles en el software GraphPad Prism 5 y Microsoft Excel. P-valores de & lt; 0,05 se consideraron significativos
Resultados
Diferencial Inducción de HSPA1A en células de cáncer de vejiga
Se seleccionaron cuatro líneas celulares de cáncer de vejiga humanos representativos (. 253J BV, SW780, UM-UC10, UC13 y UM-) para la caracterización de los mecanismos biológicos moleculares que determinan la capacidad de respuesta celular a la bortezomib inhibidor del proteasoma. En primer lugar confirmó que las líneas celulares fueron heterogéneos con respecto a sus sensibilidades a la muerte celular bortezomib inducida como se determina mediante la tinción de yoduro de propidio y análisis de FACS (PI-FACS) para medir la pérdida de integridad de la membrana plasmática (Fig. 1A). A continuación, utiliza todo el perfil de expresión de ARNm genoma (plataforma Illumina) para identificar los patrones de expresión de genes asociados con la sensibilidad a los fármacos y /o resistencia. Bortezomib indujo una fuerte regulación positiva del ARNm que codifica la principal isoforma inducible de Hsp72 (HSPA1A) en la línea celular más bortezomib resistente (253J B-V), pero no en la línea más sensible a los fármacos (UM-UC13) (Fig. S1). Se confirmó estos resultados utilizando cuantitativa en tiempo real RT-PCR, lo que demuestra que HSPA1A mRNA fue fuertemente inducida por bortezomib en células 253JB-V y SW780 (~25-60 veces sobre los niveles no tratados), mientras que la expresión aumentó sólo ligeramente inducido (~2- 4 veces en los niveles no tratados) en UM-UC10 y UC13 células UM-(fig. 1B). También hay que destacar muy baja expresión basal HSPA1A mRNA en UM-UC10 y UC13 células UM-(~50-250 veces más bajos que 253JB-V y SW780) y estas diferencias se exacerbaron con la exposición de tal manera que el bortezomib HSPA1A niveles de expresión eran ~1000-3000 veces menor en las células UM-UC13 UM-UC10 y que en 253JB-V y SW780 (Fig. 1B). Sin embargo, la inmunotransferencia reveló niveles comparables de proteína Hsp72 en las 4 líneas celulares (Fig. 1C).
A. Efectos del bortezomib sobre la muerte celular. líneas celulares de cáncer de vejiga (253JB-V, SW780, UM-UC10, UC13 UM-) se incubaron con o sin 100 nM bortezomib durante 24 horas y PI /FACS se utilizó para cuantificar la muerte celular. Media ± SEM, n = 3. B. Efectos de bortezomib en la expresión del ARNm de Hsp72 isoforma HSPA1A. Las células se expusieron a 30 nM bortezomib durante 6 h y HSPA1A se midió mediante RT-PCR cuantitativa. RQ = cantidad relativa (a GAPDH). Los valores representan la media ± SEM (N≥3) C. Efectos de bortezomib en los niveles de proteína Hsp72. Las células se incubaron durante 16 a 18 h con 30 nM de bortezomib (nM), y los niveles de Hsp72 se midieron en lisados de células enteras por inmunotransferencia. Las transferencias son representativos de dos experimentos independientes.
HSPA1B isoforma compensa la pérdida de HSPA1A Expresión en UM-UC10 y UC13-UM células
Hsp72 es codificada por dos loci genéticos independientes (HSPA1A y HSPA1B) que producen productos de proteína altamente homólogas. Por lo tanto, hemos caracterizado la expresión HSPA1B en los HSPA1A
células bajas. Se utilizó cebadores específicos para las dos isoformas de Hsp72, HSPA1A y HSPA1B, así como un cebador que reconoce ambas isoformas (PAN) para la comparación. Nuestros datos revelaron que los HSPA1A
células bajas (UM-UC10, UC13-UM) tenían una mayor expresión de la isoforma HSPA1B al inicio que lo hicieron los HSPA1A-altos células (253JB-V, SW780) (Fig. 2A). Además, la expresión se indujo HSPA1B más robustamente después de la exposición bortezomib en los HSPA1A
bajos líneas de células que carecían de la isoforma A1A (Fig. 2B). Es importante destacar que la expresión medida por el pan-imprimación fue similar en las cuatro líneas celulares, lo que corrobora los datos de inmunotransferencia (Fig. 1C). Estos datos sugieren que el aumento de expresión HSPA1B compensado por la falta de HSPA1A y representó la expresión de la proteína Hsp72 en las células UM-UC10 y UC13 UM-.
A. La expresión basal de HSPA1A y HSPA1B isoformas en las cuatro líneas celulares. expresión de HSPA1A y HSPA1B B. Bortezomib inducida a través de las cuatro líneas celulares. cebadores específicos para cada isoforma, así como un pan-cebador que reconoce ambas isoformas, se utilizaron para medir la expresión por RT-PCR cuantitativa. Los valores representan la media ± SE (n = 2). RQ = cantidad relativa (a GAPDH).
La falta de HSPA1A inducibilidad en UM-UC10 y UC13 células UM-se debe a la metilación del promotor
Heat shock factor 1 (HSF1) la activación controla la regulación al alza mundial inducida por el estrés y la respuesta de choque térmico de Hsp72 [28]. Para probar si la expresión HSF1 estaba influyendo en diferencias en la expresión HSPA1A entre nuestras líneas celulares, que mide HSF1 ARNm y los niveles de proteína en el 253JB-V (HSPA1A
alto) y las células UM-UC13 (HSPA1A
Menor). Se observaron diferencias modestas en basales e inducidos-BZ niveles de mRNA HSF1 entre las células UM-UC13 253JB-V y; específicamente, 253JB-V mostró un aumento de 2 veces en los niveles de HSF1 sobre la exposición al fármaco, mientras que UM-UC13 sólo mostró ~1.3 veces mayor, pero tenía 2 veces más alta expresión de mRNA HSF1 al inicio que hizo 253JB-V (Fig. 3A, panel izquierdo). Sin embargo, los niveles de proteína aparecieron esencialmente igual entre ambos tipos de células (3A. Fig, panel derecho). Además, otros objetivos HSF1 fueron fuertemente inducidos, incluyendo el HSPA1B mencionado (Fig. 2) y DNAJB1 (Hsp40) (Fig. S2) en las células UM-UC10 y UM-UC13 lo que sugiere que no hubo defecto generalizado en la activación de HSF1 endógeno en estas células. Por lo tanto, razonó que las células UM-UC10 y UC13 UM-pudieran poseer defecto específico (s) en la activación mediada por HSF1 del promotor HSPA1A. De acuerdo con esta idea, immunoprecipiation cromatina (ChIP) reveló que las células 253J BV poseían niveles más altos de HSF1 de unión al promotor HSPA1A al inicio del estudio y después de la exposición bortezomib que hizo UM-UC13 (~ 2 veces y ~ 5 veces mayores, respectivamente) (Fig. 3B). El pliegue de la inducción de HSF1 vinculante por el bortezomib fue vs ~ 9 ~ 4 veces veces en 253JB-V y UM-UC13, respectivamente. Análisis del promotor HSPA1A usando la UCSC Genome Browser reveló que se encuentra dentro de una isla CpG que está metilado en otras líneas celulares de cáncer (Fig. S3). El uso de la PCR específica de metilación, se confirmó que el promotor HSPA1A fue fuertemente metiladas en la UM-UC10 y UM-UC13, pero no en los 253J B-V o SW780 células (Fig. 3C), que posiblemente representaban para la inducción HSPA1A bortezomib inducida defectuoso. Directamente a prueba esta posibilidad, se examinaron los efectos de la histona metiltransferasa inhibidor de la 5-aza-2'- desoxicitidina en niveles basales y HSPA1A ARNm bortezomib inducida en el UM-UC10 y las células UM-UC13. El inhibidor indujo grandes incrementos en tanto basal como del proteasoma inducida por inhibidores de niveles HSPA1A en ambas líneas celulares bortezomib sensible (Fig. 3D). En conjunto, estos resultados demuestran que la metilación de la cromatina es responsable de la inducción HSPA1A defectuosa observada en las células UM-UC10 y UC13 UM-.
A. Expresión de HSF1. 253J B-V y las líneas celulares de cáncer de vejiga UM-UC13 fueron expuestos a bortezomib durante 12 h y mRNA HSF1 (panel izquierdo) y los niveles de proteína (panel derecho) se midieron por RT-PCR cuantitativa e inmunotransferencia, respectivamente. Los valores representan la media ± SE (n = 2); Las transferencias son representativos de al menos dos experimentos independientes. B. inmunoprecipitación de cromatina (CHIP), análisis de HSF1 vinculante para el promotor HSPA1A. Tenga en cuenta que basal y bortezomib inducida HSF1 unión se redujo en gran medida en las células UM-UC13 bortezomib y minúsculas. Media ± SEM, n = 3. * P & lt; 0,05 C. metilación selectiva del promotor HSPA1A en células de cáncer de vejiga humano bortezomib y minúsculas. Se utilizó PCR específica de metilación para evaluar la metilación de la cromatina en sensible a los fármacos (UM-UC10, UC13 UM-) y líneas de células resistentes a los medicamentos (253J-B V, SW780) como se describe en Materiales y Métodos. m, metilado; u, no metilado. proporciones m /u se calcularon utilizando densitometría. Los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes. D. El ADN metiltransferasa inhibidor de 5-aza-2 'desoxicitidina restaura la expresión en las células HSPA1A bortezomib y minúsculas. Las células se incubaron con 5 mM 5-AzdC durante 5 días y después se incubaron con o sin bortezomib 30 nM durante 6 h, y la expresión se midió por HSPA1A cuantitativa en tiempo real PCR. Los valores representan la media ± SEM, n = 3. RQ = cantidad relativa (a GAPDH).
La modulación de HSPA1A y HSPA1B Expresión en el HSPA1A
Las células bajas
Desde UM -UC10 y UM-UC13 carecían de expresión HSPA1A, examinamos si la sustitución de la isoforma HSPA1A promovería bortezomib resistencia. Para hacer frente a esto, de forma estable overexpressed HSPA1A tanto en UM-UC10 y -UC13 células utilizando un vector lentiviral. HSPA1A expresión de ARNm se confirmó usando proteína Hsp72 total aumenta por inmunotransferencia (Fig. 4A) QRT-PCR y. HSPA1A células que sobreexpresan y células transducidas vector vacío se expusieron a bortezomib y descubrieron que la sobreexpresión redujo significativamente la muerte celular bortezomib inducida (Fig. 4B). A la inversa, porque UM-UC10 y -UC13 células parecían estar confiar únicamente en HSPA1B ARNm para expresión de la proteína Hsp72, la hipótesis de que estas células pueden ser particularmente susceptibles a la orientación de HSPA1B. Para probar esto, hemos utilizado siRNA para silenciar transitoriamente HSPA1B en las células UM-UC10. Análisis de la eficiencia desmontables reveló que el siRNAs disponible en el mercado no puede dirigirse específicamente a las isoformas individuales (es decir, siHSPA1A silenciada HSPA1B) (Fig. 4C). Sin embargo, una combinación de secuencias siHSPA1A y siHSPA1B dio la mejor (aunque no completa) caída general de la isoforma A1B tanto en el ARN y la proteína de nivel (Fig. 4C). Con esta estrategia, se confirmó que el bloqueo de la inducción HSPA1B sensibiliza las células UM-UC10 al bortezomib (Fig. 4D).
A. Efectos de la sobreexpresión HSPA1A forzada en HSPA1A mRNA y los niveles de proteína total de Hsp72 en UM-UC10 y las células UM-UC13. Las células fueron transducidas de forma estable con una construcción de expresión lentiviral HSPA1A, y los niveles de HSPA1A se midieron por RT-PCR cuantitativa. La media ± SEM, n = 3. RQ = cantidad relativa (a GAPDH). Los niveles de proteína se midieron mediante inmunotransferencia. Blots son representativos de dos experimentos independientes. B. Efectos de la sobreexpresión HSPA1A sobre la muerte celular inducida por bortezomib. Las células transducidas con el vector vacío (NT) o con la construcción de expresión HSPA1A fueron expuestos a 30 bortezomib nM durante 24 h y la integridad de la membrana plasmática se midió mediante la captación de azul de tripano. (La presencia de RFP en el constructo de expresión ha impedido el uso del ensayo de la muerte celular /FACS PI.) Media ± SEM, n = 3. *, P & lt; 0,02. C. Desmontables de HSPA1B en las células UM-UC10. Panel izquierdo, eficiencia desmontables de siRNA contra HSPA1A, HSPA1B, o ambas isoformas, medida por RT-PCR cuantitativa después de la exposición a 30 nm bortezomib durante 6 h. RQ = cantidad relativa (a GAPDH). Panel derecho, correspondiente caída de los niveles de proteína Hsp72 por las secuencias de siRNA de diferencia tras la exposición a 30 nM BZ para 14 h. Los datos son representativos de dos experimentos independientes. D. Efecto de HSPA1B caída sobre la muerte celular inducida por bortezomib en las células UM-UC10. Después de 72 h desmontables, las células fueron expuestas a 30 nM bortezomib durante 24 h y la muerte celular medidos por análisis de PI /FACS. Los valores representan la media ± SE (n = 3). * P & lt;. 0,01
celular inducida por bortezomib inhibe la inducción de muerte Hsp72
Para determinar si el bortezomib más directamente inducida por la regulación positiva de Hsp72 promovido la resistencia, que de forma estable derribado Hsp72 en 253JB-V bortezomib células resistentes utilizando un vector lentiviral shRNA (Fig. 5A). los niveles de referencia HSPA1A mRNA se redujeron en más de 75% en las células, pero la supresión de HSPA1A mRNA (Fig. 5A. panel superior) y de la proteína Hsp72 shRNA-mediadas (Fig. 5A, panel inferior) fue menos impresionante tras la exposición a bortezomib, presumiblemente porque el inhibidor del proteasoma produce una fuerte regulación por incremento de Hsp72 tal. No obstante, estable knockdown Hsp72 aumentó significativamente la pérdida inducida por bortezomib de integridad de la membrana de plasma, medida por la captación de yoduro de propidio (Fig. 5B). Estudios anteriores concluyeron que la inducción de Hsp72 tiene una función citoprotectora en la respuesta al estrés integrado (ISR) por los lisosomas de estabilización [29]. Como tal, se compararon los efectos del bortezomib sobre la integridad de los lisosomas en las células 253JB-V transducidas con el vector de control (253JB V-NT) o el constructo shRNA KD9 HSPA1A-específica. Bortezomib tenía poco o ningún efecto sobre la integridad de los lisosomas en las células 253JB V-NT, pero indujo una fuerte pérdida, dependiente de la concentración de la integridad de los lisosomas en las células 253JB-V-KD9 (Figura 5C).