Extracto
A pesar de c-Abl se ha convertido cada vez más como un actor clave en la respuesta al daño del ADN, su papel en este contexto es lejos de ser clara. Se estudió el efecto de la inhibición de la actividad de la quinasa c-Abl por imatinib con medicamentos de quimioterapia y encontramos una notable diferencia en la supervivencia celular después de mitoxantrona combinada (MX) y el tratamiento con imatinib en comparación con un grupo de otros medicamentos de quimioterapia. El tratamiento combinatorio indujo apoptosis en células HeLa y otras líneas celulares de cáncer pero no en los fibroblastos primarios. La diferencia en MX y la doxorubicina se relaciona con el aumento significativo de daño del ADN. Transcripcionalmente activa p53 acumula en células en las que el virus del papiloma humano E6 normalmente degrada p53. El tratamiento de combinación dio lugar a la activación de caspasas y apoptosis, pero este efecto no depende ni de la actividad de p73 p53 o. Pese al aumento de la actividad de p53, las células detenidas en la fase G2 ser defectuosas en este puesto de control, lo que permite la progresión del ciclo celular. El efecto después del tratamiento MX dependía en parte de c-Abl: Corto interferir ARN desmontables de células HeLa c-Abl prestados menos sensibles a MX. El efecto de imatinib se redujo en c-Abl siRNA que sugiere un papel para catalíticamente inactiva c-Abl en la cascada de muerte. Estos resultados indican que MX tiene un efecto citotóxico única cuando se inhibe la actividad quinasa de c-Abl. Los resultados del tratamiento en el aumento de daño en el ADN y la apoptosis c-Abl-dependiente, que puede ofrecer nuevas posibilidades para la potenciación de la quimioterapia del cáncer
Visto: Alpay. K, Farshchian H, J Tuomela, Sandholm J, K Aittokallio, Siljamäki E, et al. (2014) La inhibición de la quinasa c-Abl actividad hace que las células de cáncer altamente sensible a la mitoxantrona. PLoS ONE 9 (8): e105526. doi: 10.1371 /journal.pone.0105526
Editor: Stephan Neil Witt, Louisiana State University Health Sciences Center, Estados Unidos de América
Recibido: 9 de diciembre de 2013; Aceptado: July 24, 2014; Publicado: 22 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Alpay y cols. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por subvenciones del finés Sociedad médica, la Fundación de la Universidad de Turku y la Sociedad del cáncer del suroeste de Finlandia, la Academia de Finlandia (proyectos 137687 y 268360), la Fundación de Investigación de cáncer de Finlandia, la Fundación Sigrid Juselius, beca de la Universidad de Turku hospital de EVO (proyecto 13336). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la quimioterapia en el tratamiento del tumor trabaja principalmente a través de causar daños en el ADN que induce una compleja red de respuestas celulares que conducen en última instancia a la muerte de las células cancerosas. En el núcleo de la respuesta son las vías que reconocen el daño, detener el ciclo celular, y promulgar la cascada de muerte. En la terapia del cáncer, la radioterapia y la mayoría de los agentes de quimioterapia funcionar al dañar directamente el ADN o interfiriendo con la replicación del ADN. La respuesta al daño del ADN de las células malignas y normales determina la eficacia y los efectos secundarios del tratamiento. El destino de la célula reside en las complejas vías de reparación del ADN evocadas por numerosos tipos de daño en el ADN que pueden surgir después del tratamiento genotóxico [1]. El éxito de la reparación es crítico para el tejido normal para superar los efectos secundarios de la terapia, pero en el tumor puede resultar en la resistencia al tratamiento. Las células cancerosas por lo general han acumulado mutaciones en genes implicados en la reparación del ADN, que ofrece una variedad de oportunidades terapéuticas para los agentes que modulan las restantes vías de reparación funcionales. Después de ADN tratamiento dañino, bases dañadas, desajustes, o aductos de ADN son toleradas por lo general hasta un cierto umbral cuantitativo, pero pueden dar lugar a mutaciones si permanezca sin reparar [2].
c-Abl inhibición se ha propuesto recientemente para dar lugar a una respuesta al daño del ADN alterado [3]. c-Abl es una tirosina quinasa no receptor que juega un papel en la diferenciación, la adhesión, la división celular, la muerte, y las respuestas al estrés y se une a varias proteínas implicadas en vías de la apoptosis [4]. Los cambios en c-Abl conformación de proteínas varían, y las parejas de unión en consecuencia difieren [4] - [6]. Varias proteínas, tales como ATM, DNA-PK, BRCA1, y los factores de transcripción p73 y RFX1 interactuar con c-Abl [5]. En particular, c-Abl ha informado de interactuar con la proteína homóloga recombinación de reparación de Rad51, elevar [7] su expresión a nivel del gen, y que se active por fosforilación. Activo c-Abl puede ser inhibida por la pequeña imatinib fármaco de molécula (Gleevec; STI-571), que fue desarrollado contra la proteína aberrante fusión BCR /ABL que se encuentra en la leucemia mieloide crónica (CML) [8]. En células CML, el primer exón de c-Abl se sustituye por la secuencia del gen BCR, lo que resulta en la expresión de c-Abl constitutivamente activa. estos resultados de la actividad quinasa aberrante en la proliferación mejorada, que puede ser inhibida con imatinib. Imatinib es un ATP-inhibidor competitivo de estabilización inactivo conformación c-Abl [8]. La actividad quinasa de c-Abl se incrementa después de daño en el ADN y luego aumenta la actividad de Atm y Atr [9]. El tratamiento con imatinib disminuye el nivel de RAD51 elevado implicada en la reparación de doble filamento romper (OSD) y sensibiliza varios tipos de células a la quimioterapia [10] - [13]. La interacción directa también se ha demostrado entre c-Abl y DNA-PK, que regula de extremos no homólogos de unión [14].
El desarrollo del cáncer cervical uterino es un proceso de múltiples etapas que implica la transformación de células de la mucosa cervical por oncogénico virus del papiloma humano (VPH proteínas) E6 y E7. E7 inactiva el regulador de pRb del ciclo celular, la inhibición de la detención del ciclo celular, mientras que E6 inactiva la proteína p53 supresora de tumores, el regulador clave de la apoptosis y la respuesta al estrés genotóxico [15]. Dado que las células de cáncer cervical casi siempre llevan p53 de tipo salvaje, que se degrada por VPH de alto riesgo, p53 era anteriormente considerado como completamente no funcional en células de cáncer de cuello uterino. Sin embargo, el trabajo de varios grupos recientemente ha hecho evidente que la inactivación de p53 puede ser revertido en las células portadoras del VPH E6 y que la condición de p53 en células de cáncer de cuello uterino no es igual a la de las células de cáncer con un gen p53 mutado [16]. Hemos observado anteriormente que la quimiorradioterapia reactiva p53 en células de cáncer cervical y promueve la muerte celular de manera sinérgica. Sin embargo, cuando se analizan en detalle, la proteína p53 puede mejorar o inhibir la citotoxicidad del fármaco de quimioterapia [17], [18]. Fibroblastos embrionarios de ratón nulo para c-Abl son defectuosos en la fosforilación de p53 y resistentes a la muerte después de un daño genotóxico. La inhibición de la c-Abl por imatinib disminuye la fosforilación de p53 hidroxiurea inducida por [9]. La hipótesis de que la p53 activa puede mejorar la reparación del ADN y por lo tanto quería estudiar el efecto sobre la muerte celular de la modulación de reparación. c-Abl se cree generalmente que el relé de señalización pro-apoptótica de ATM y ATR de p53 y p73, entre otros objetivos [3]. Estudiamos aquí el efecto de la inhibición de c-Abl en la actividad de p53 en las células positivas para el VPH y cómo se relaciona con el daño y muerte respuestas.
Un panel completo de medicamentos que representan los agentes alquilantes, los fármacos de platino, y la topoisomerasa I e inhibidores II se estudió junto con imatinib en células de cáncer cervical por VPH y que llevan en líneas de células VPH-negativas. Presentamos aquí que la inhibición de c-Abl por imatinib en combinación con MX resultados del tratamiento genotóxico en deterioro de la reparación del ADN, España
Materiales y Métodos
Las líneas celulares abrogación del puesto de control de la fase G2, y la apoptosis masiva. y ensayos de citotoxicidad
Las líneas celulares de cáncer de cuello uterino humanos SiHa (HPV 16+), CaSki (HPV 16+), y HeLa (HPV 18+), línea celular de cáncer de mama MCF7 y A431 línea celular de cáncer de vulva se obtuvieron a partir la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA, EE.UU.). Los fibroblastos humanos primarios se han descrito antes [19]. Las células se cultivaron como monocapas en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, aminoácidos no esenciales (Euroclone, Wetherby, Reino Unido), y 50 mg /ml de gentamicina (Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU. ). La línea celular HeLa reportero p53, p53 que lleva el plásmido reportero ptkGC3p53-luc, se ha descrito anteriormente [18]. A pesar de la presencia de HPV E6, incluso las líneas de células positivas para el VPH muestran alguna actividad de p53 después de estrés genotóxico, pero la actividad pueden ser degradados por p53 dominante negativo (DDp53) o ectópico E6 dirigido por un promotor fuerte. El SiHa DDp53, SiHa CMV, HeLa DDp53, HeLa CMV (vector vacío), y SiHa E6 líneas celulares también se han descrito anteriormente [18].
El dominante negativo línea celular HeLa que expresa p53 (HeLa DD ) se derivó por transfección de la línea celular parental con un plásmido que expresa una p53 truncado ratón que contiene residuos de aminoácidos 1-14 y 302-390 bajo el control del promotor de CMV. Los transfectantes estables se seleccionaron con G418 0,8 mg /ml.
En los ensayos de viabilidad celular a corto plazo, 1-2 × 10
4 células por pocillo (dependiendo de la línea celular) fueron sembradas en placas de 96 pocillos , y el medio se reemplazó con fármacos diluidos con medio. La viabilidad celular se midió por WST-1 agente (Roche, Mannheim, Alemania) o agente de MTT (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, EE.UU.), y la absorbancia se midió a 450 nm (Multiskan microreader placa; Labsystems, Finlandia) a 570 nm o multi-lector de placas (Tecan;. Tecan, Suiza), respectivamente
Para los ensayos de crecimiento clonogénico, las células SiHa y HeLa fueron sembradas en placas de 6 pocillos 48 horas antes del tratamiento. Las células se expusieron al tratamiento durante 6 horas y luego se trataron con tripsina y se suspendieron en medio fresco y se sembraron en placas de 6 pocillos con 3 M imatinib. Se incubaron las células SiHa durante 14 días y las células HeLa durante 7 días. Después de la incubación, las células se fijaron con acetona 01:01-metanol y se tiñeron con Giemsa (Merck, Whitehouse Station, NJ, EE.UU.). A continuación, los clones fueron ya sea manualmente o contadas analizaron como se describe anteriormente [20]. Caspasa 3/7 actividad de las células sometidas a la apoptosis se determinó usando el Apo-ONE caspasa-3/7 ensayo de caspasa homogénea (Promega).
Reactivos, drogas y anticuerpos
La quimioterapia compuestos mitoxantrona (MX) (Wyeth-Lederle, Finlandia), doxorrubicina (DXR) (Nycomed, Roskilde, Dinamarca), ciclofosfamida (Orion Pharma, Espoo, Finlandia), topotecan (GlaxoSmithKline, Uxbridge, Middlesex, Reino Unido), etopósido (Pfizer), cisplatino (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, EE.UU.), docetaxel (Aventis), y carboplatino (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, EE.UU.) se almacenaron y prepararon como se describe [17]. Imatinib fue un regalo de Novartis Pharmaceuticals (Basilea, Suiza). La solución madre de imatinib en 200 mM se preparó disolviendo el compuesto en DMSO. El c-kit y PDGF-α y β bloqueador del receptor de AG1296 se adquirió de Calbiochem (cat.. No 658551). PDGF-BB se adquirió de Sigma-Aldrich. Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para el Western Blot: mouse monoclonal DO-1 para p53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), policlonal de conejo anti-GADD45α (.. Señalización Celular, gato sin 3518), policlonal de conejo anti-fosfo -PDGF receptor β (Cell Signaling, nº de cat 3161..), ratón monoclonal anti-RAD51 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU., cat. Nº 35-6500), monoclonal de ratón anti-ciclina B1 (BD Biosciences, cat. no. 554178) y el anticuerpo monoclonal anti-p73 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.). El ARN se aisló utilizando el kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania).
ARN corto de interferencia y transfecciones
El c-Abl ARN corto de interferencia (siRNAs) fueron obtenidos de Invitrogen (sigilo, Carlsbad, CA, EE.UU.;.... cat no 1299003), y no la orientación siRNA (Qiagen, nº de catálogo 1027281) se utilizó como control. La transfección de las células se realizó con 75 nM de tres siRNAs individuales de orientación c-Abl y controlar siRNA usando el reactivo lípido siLentFect (Bio-Rad).
reportero p53 ensayo
Stable ptkGC3p53luc-bsd líneas celulares SiHa, CaSki, y HeLa, así como la composición de la p53 reportero plásmido ptkGC3p53-luc se han descrito anteriormente [17]. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (10
4 células /pocillo). Después de permitir que para la fijación celular durante 24 horas, los tratamientos se iniciaron para las duraciones indicadas. Las células vivas en cada pocillo se determinó colorimétricamente con el ensayo WST-1. Posteriormente, las células se enjuagaron con PBS y se cubrieron con 100 l de una mezcla que contiene 50% de PBS y 50% Glo Bright-reactivo de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.). La actividad luciferasa se cuantificó con la ayuda de un luminómetro de captura de híbridos (Digene, Gaithersburg, MD, EE.UU.). lecturas de luciferasa se dividieron por WST-1 valor para obtener la actividad del indicador normalizado.
Western Blot
Las células se recogieron usando 200 l de 1 x tampón de muestra SDS estándar. Los extractos de células enteras resultantes se hirvieron y después separados por 10% SDS-PAGE y se transfirieron a Immobilon-P membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Las membranas se sondearon con los anticuerpos primarios indicados y la detección secundaria se realizó con rábano picante anti-ratón peroxidasa (HRP) (GE Healthcare, NJ, EE.UU.), HRP anti-conejo (DAKO, Glostrup, DK) y ECL (GE Healthcare , NJ, EE.UU.). Beta-actina se utilizó como control de carga. Las películas de Western blot se digitalizaron con un ChemiDoc MP plataforma de análisis en gel (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). y se analizaron con Fiji (ImageJ) ver 1.47q (Wayne Rasband, NIH, EE.UU.) utilizando la opción de geles.
La citometría de flujo
El análisis del ciclo celular se realizó por citometría de flujo. Las células se recogieron con tripsina junto con flotante células no viables. Las células se lavaron una vez con PBS y se suspendieron en tampón de citrato de sodio (40 mM citrato de Na, 0,3% de Triton X-100, 0,05 mg /ml de yoduro de propidio, PBS) 20 minutos antes del análisis. El análisis del ciclo celular se realizó mediante FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, EE.UU.) y el software Pro CellQuest (Becton Dickinson). Los análisis del ciclo celular y la apoptosis se realizaron con ModFit LT (Verity Software House, Inc., Topsham, ME, EE.UU.) y fluye versión de software. 2.5 (Sr. Perttu Terho, Centro de Biotecnología de Turku, Finlandia, www.flowingsoftware.com), respectivamente. A fin de analizar la inducción de la apoptosis después de las células HeLa de tratamiento con imatinib MX y MX + se cultivaron en placas de 6 pocillos y se trataron con fármacos indicados por 24 y 48 horas. Medio y las células se recogieron y las muestras se tiñeron con el kit de anexina-V-FITC (ab14085; Abcam, Cambridge, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. Los datos fueron adquiridos con un citómetro de flujo FACSCalibur, y se analizaron con un chorro de software.
En tiempo real de transcripción inversa cuantitativa PCR
El método RT-PCR se ha descrito antes [18]. Los cebadores fueron VPH 18 E6, adelante, 5'-TGGCGCGCTTTGAGGA-3 ', e inverso, 5'-TGTTCAGTTCCGTGCACAGATC-3'; y EF1α, adelante, 5'-CTGAACCATCCAGGCCAAAT-3 ', y marcha atrás, 5'-GCCGTGTGGCAATCCAAT-3'. Las cantidades de VPH 18 E6 transcripciones se normalizaron en contra de las lecturas para EF1α.
ensayo cometa
daño en el ADN se estudió con un solo kit de electroforesis en gel de células (Trivigen, Gaithersburg, MD, EE.UU.). El ensayo se realizó en condiciones alcalinas para detectar daños en el ADN tanto de simple y de doble cadena. Se realizó la electroforesis en gel de una sola célula de ADN como se describe por el fabricante. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus BX60 (Zeiss Axiovert 200 M) a 20 × magnificación.
Time-lapse microscopía
Las imágenes fueron capturadas en intervalos de una hora durante 72 horas con IncuCyte ZOOM cinética sistema de imagen (Essen Bioscience, Michigan, EE.UU.). Se seleccionaron los pozos representativos y las películas se construyeron con ImageJ ver 1.47d (Wayne Rasband, NIH, EE.UU.). Barra representa 200 micras.
Estadísticas
Para evaluar las diferencias entre grupos, se utilizaron pruebas t de Student. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Resultados
La inhibición de la c-Abl por imatinib potencia el efecto citotóxico de mitoxantrona en las células cancerosas pero no en fibroblastos primarios
La potencia de imatinib en el aumento de la citotoxicidad se proyectó en un gran grupo de fármacos de quimioterapia. En los ensayos de citotoxicidad a corto plazo, imatinib por sí sola no fue citotóxica para cualquiera de las líneas celulares a 3 M a 10 M. Cuando las células HeLa, CaSki y SiHa fueron tratados con el inhibidores de topoisomerasa I (topotecán y etopósido), análogos de nucleósidos (gemcitabina, fluorouracilo, y citarabina), agentes alquilantes (ciclofosfamida y dacarbazina), o cisplatino, imatinib no aumentó la citotoxicidad (datos no mostrada). Tampoco afecta a antraciclinas (doxorrubicina, DXR) células tratadas (Figura 1A). El efecto de carboplatino se mejoró dos veces mediante la adición de imatinib durante 48 horas (datos no mostrados). En contraste con todos los otros medicamentos de quimioterapia ensayados, imatinib mostró un efecto dramático junto con mitoxantrona (MX), un inhibidor de la topoisomerasa II (Figura 1A). El efecto de imatinib fue igual entre 3 micras y 10 mu M que indica que la actividad de la quinasa se bloquea en las líneas celulares estudiadas incluso a 3 M.
células (A) cáncer de cuello uterino humano (HeLa) fueron tratados con MX ( 0,6 M), DXR (0,8 M), imatinib (10 M) o sus combinaciones. ensayo de viabilidad celular WST se realizó a las 12 h, 24 hy 48 h. Los resultados se normalizaron con el número de células en los pozos que contienen solamente medio. *** P & lt; 0,001 muestras independientes t-test. línea (B) Tanto A-431 carcinoma vulvar célula que tiene una mutación sin sentido en el gen p53 y la línea celular de cáncer de mama MCF-7 que tiene un gen p53 de tipo salvaje muestran un mayor efecto cuando MX y imatinib se combinan. Imatinib no aumenta la citotoxicidad de MX en los fibroblastos primarios. Las mediciones se realizaron a las 48 h utilizando ensayo de viabilidad celular WST. ** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 muestras independientes t-test. (C) de ensayo clonogénico. Imatinib aumenta la citotoxicidad tanto en MX en la línea celular HeLa CMV con p53 de tipo salvaje y el vector vacío y la línea celular HeLa DDp53 que lleva una p53 negativo dominante. Las células se trataron con cada fármaco durante 12 h. A continuación, el medio se reemplazó con medio fresco sin drogas. La concentración de imatinib fue de 3 M mientras MX fue usado en diferentes concentraciones que variaban de 1 nM a 40 nM. Los clones se contaron bajo el microscopio. El experimento se realizó por triplicado, con una media ± desviación estándar. *** P & lt;. 0.001
El efecto mejorada también se observó en las células SiHa y CaSki aunque en menor medida (Figura S1). Las líneas celulares que queríamos principalmente a la prueba fueron derivadas de cáncer cervical por VPH-positivo. Sin embargo, el efecto parece no se han limitado a estas células. Las drogas fueron probados con dos líneas celulares de cáncer de diferente origen: La línea celular A431 de carcinoma de la vulva tiene una mutación sin sentido en el gen p53, y la línea celular de cáncer de mama MCF7 tiene una p53 de tipo salvaje. La supervivencia fue sorprendentemente similar a las líneas de células VPH positivas (Figura 1B). Por el contrario, los fibroblastos no transformados primarios fueron no más sensible cuando se añadió imatinib al tratamiento MX (Figura 1B). Este resultado indica que el efecto observado no está restringida a las células cancerosas positivas para el VPH pero puede ocurrir más ampliamente independientemente del estado de p53. Sin embargo, las células no transformadas pueden exhibir resistencia a este tratamiento
.
El efecto mejorado de imatinib también se observó en nativo y modificado de manera diferente HeLa y células SiHa de una manera independiente de cualquiera de p53 o E6 (Figura S2). MX se estudió adicionalmente en ensayos de crecimiento clonogénico para controlar la capacidad de recuperación a largo plazo de las células. concentraciones MX tan bajas como 1 nM junto con 3 imatinib mu M inhibió el crecimiento clonal de células HeLa por completo, tanto de las células por vectores que lleva p53 nula y vacíos (Figura 1C). En líneas celulares SiHa, 3 M imatinib solo no afectó el crecimiento clonal. La sensibilidad de las células CaSki para la adición de imatinib fue entre la de las células SiHa y HeLa (Figura S3).
mitoxantrona induce la caspasa 3/7, que se ve reforzada por el bloqueo de c-Abl con imatinib
el tratamiento con MX aumenta la liberación de caspasa 3 y 7 de la mitocondria indicativos de apoptosis. Imatinib por sí sola no es capaz de alterar estos niveles (Figura 2). Las células tratadas con 0,6 M y 0,8 M MX DXR aumentó la actividad de caspasa 2,5 veces, mientras que el tratamiento de combinación con imatinib MX + aumentó el pliegue actividad 4. Imatinib no aumentó la actividad inducida por DXR solo.
Células
HeLa fueron tratados con fármacos indicados durante 48 h. Entonces, medio fresco fue sustituido y se midió la actividad de la caspasa 3/7 usando el ensayo ELISA. El experimento se realizó por triplicado, con una media ± desviación estándar. *** P & lt; 0,001 T-test
La inhibición de la actividad de la quinasa c-Abl aumenta el daño del ADN en las células tratadas con MX
Adición de imatinib a MX aumento del tizón del cometa en células HeLa. mientras que el imatinib solo no tuvieron ningún efecto (Figura 3A). Imatinib no indujo tizón en las células tratadas con DXR. La cantidad de proteína GADD45α aumentó ligeramente incluso en los extractos celulares totales con MX + imatinib (5 veces, Figura 3B). Este aumento parece estar regulada a nivel transcripcional porque también hemos observado un marcado incremento en los niveles de transcripción GADD45α después de la terapia de combinación en los análisis de microarrays de ARN (datos no publicados). Al igual que la acumulación de proteína p53 en el estrés celular, GADD45α de transcripción aumenta bajo el estrés, entre ellos con daños en el ADN. Tanto DXR y MX aumentaron los niveles de RAD51 (10 veces), y el tratamiento previo imatinib inhibieron el aumento igualmente (20%), pero mejoraron la acumulación de p53 cuando se añade a MX (13 veces, Figura 4)
.
(A) daño del ADN en las células HeLa se estudió usando un ensayo de cometa después del tratamiento con MX (0,6 M), DXR (0,8 M) e imatinib (5 mM), o sus combinaciones. Cometting (colas) indica daño en el ADN. (B) combinado con Imatinib MX aumenta el nivel de GADD45α. transferencia de Western de los niveles de proteína GADD45α a partir de lisados de células enteras. Las células HeLa fueron tratados con MX (0,6 M), DXR (0,8 M), imatinib (5 M), o sus combinaciones durante 30 h.
Western blot de p53 y RAD 51 en células HeLa. Imatinib combinado con MX aumenta los niveles de proteína p53 en las células HeLa. nivel RAD51 se redujo ligeramente en células tratadas con imatinib y MX. Las células fueron tratadas con MX (0,6 M), DXR (0,8 M), imatinib (5 M) o sus combinaciones durante 30 horas.
activación de p53 inducida por mitoxantrona se mejora mediante la inhibición de c-Abl quinasa actividad
los medicamentos de quimioterapia utilizados en este estudio inducen diversas formas de daño en el ADN, que p53 en los sentidos células diana. p53 se activa en las células del cuello del útero a pesar de la actividad de degradación de E6 [16], [19]. Se midió la actividad de reportero de p53 en las líneas celulares HeLa, CaSki y SiHa con DXR, MX, y cisplatino. Cuando se compararon los fármacos, cisplatino induce el reportero más de MX en células HeLa y CaSki, pero de manera similar en las células SiHa, y 0,6 M MX por sí solo no activar el reportero en absoluto en las células HeLa a las 48 horas. DXR indujo el reportero más de cisplatino y MX en todas las líneas celulares (Tabla 1). Imatinib solo no alteró significativamente la actividad en cualquiera de las líneas celulares. La adición de imatinib al cisplatino reducido ligeramente la actividad, pero no hubo un efecto de DXR. Por el contrario, la adición de imatinib a 0,6 M MX aumentó la actividad en todas las líneas celulares, por 50% en células SiHa, pero cuatro veces en las células HeLa y ocho veces en las células CaSki. La limitación de este enfoque es que una comparación directa entre las líneas celulares no se puede hacer debido a las diferentes cantidades de plásmido informador integrado. En consonancia con los ensayos de reportero, el nivel de proteína p53 también se incrementó significativamente en los análisis de Western blot (Figura 4). No vimos ninguna disminución en el nivel de p53 con imatinib solo, los resultados que eran de acuerdo con los resultados de análisis de reportero.
p73 es un miembro de la familia de proteínas p53 e interactúa con c-Abl directamente y puede también inducir la apoptosis. Los niveles de proteína p73 no cambiaron después de los tratamientos (Figura S4).
Imatinib no altera los niveles de VPH E6
La mayoría de los medicamentos de quimioterapia reducen la cantidad de mRNA de E6 [17]. Quisimos saber si imatinib causa una reducción en la expresión de E6 en células HeLa, ya sea solos o combinados con MX. Se encontró que 1 M MX reduce los niveles de ARNm de E6 en células HeLa en aproximadamente 50% y que 5 M imatinib sola no reduce el nivel de ARNm de E6 en estas células. Una combinación de 5 imatinib mu M y 1 M MX no redujo el nivel de mRNA de E6 en células HeLa más de 1 M MX solo.
Imatinib abroga la detención de la fase S causada por MX y aumenta la apoptosis
en las células HeLa tratadas con imatinib solo, a las 24 horas, la distribución del ciclo celular fue la misma que en las células con medio solo, pero no fueron ligeramente más células en la fase S después de 48 horas (figura 5A). A las 24 horas y en especial de 48 horas, las células DXR acumula en la fase G2. La adición de imatinib produjo la detención de la fase S en el análisis de software; sin embargo, a las 48 horas con DXR + imatinib, parecía que había una pequeña población G2 que el software de análisis no pudo detectar. las células tratadas con MX progresaron a las 24 horas a S y G2, pero la incubación prolongada después de 48 horas mostraron una clara detención en G2. La adición de imatinib a MX mostró a las 24 horas una población que evolucionan hacia el G1, lo que indica la supresión de la detención. A las 48 horas, no había células más allá de la fase S, pero también todavía una población G1 clara. Este hallazgo sugiere que las células habían entrado prematuramente directamente de la fase S de la mitosis y que el imatinib condujo este efecto. Alternativamente, MX + imatinib puede inducir un retraso de G1 /S de G2. Sin embargo, se detectaron varias mitosis sin éxito en el vídeo de lapso de tiempo de las células tratados con imatinib MX + prioridad a la interpretación de que la detención del ciclo celular fue abrogada (Video S1). También determinamos los niveles de ciclina B1, un marcador mitótico bien reconocido-, en las poblaciones de células tratadas con fármaco para recoger una prueba más de la noción de que las células co-tratado MX + imatinib son capaces de proceder en ciclo celular y la fase M de entrar. Se encontró que el tratamiento de células HeLa con DXR, DXR + imatinib, MX y MX + imatinib conduce a la acumulación de la ciclina B1. El nivel de proteína de las células tratadas con imatinib estaba bajo nivel de detección de manera similar a los controles no tratados que presentan nivel de expresión de ciclina B1 basal (Figura S5).
Las células (A) fueron tratados con MX (0,6 M), DXR (0,8 M), imatinib (5 M) o sus combinaciones para las 24 y 48 horas. Después del tratamiento, se recogieron las células y se tiñeron con yoduro de propidio para cuantificar el contenido de ADN mediante citometría de flujo. Los histogramas muestran las distribuciones del ciclo celular. (B) Anexina-V (eje X) frente a PI (eje Y) tinción de células HeLa tratadas con fármacos indicados para 48 h. Los porcentajes indican el temprano (cuadrante inferior derecho) y tardía (cuadrante superior derecho) fracción apoptótica. MX e imatinib muestran un claro efecto sinérgico en la inducción de la apoptosis. Los espectros de emisión de PI y DXR coinciden en el canal FL2, por lo que es imposible distinguir la población apoptótica temprana de la población apoptótica tarde en las células tratadas con DXR. Sin embargo, cuando se añadieron los cuadrantes derechos juntos, no había diferencia entre DXR y DXR + poblaciones imatinib.
Imatinib aumentó los acontecimientos G1 sub en las células HeLa tratadas con MX, en parte indicativo de apoptosis. La población sub G1 fue el mayor (38,6%) en el grupo de imatinib MX + a las 48 horas. Imatinib también aumentó DXR inducida sub G1 pero en menor medida (17,8%) a las 48 horas (Tabla S1). A fin de analizar la posible apoptosis las células teñidas con anexina V, que es un marcador de apoptosis temprana. Se encontró que el imatinib aumenta significativamente la proporción de células apoptóticas en las células tratadas con MX, pero no detectaron ningún aumento cuando se añadió imatinib a DXR (Figura 5B) Citometría de flujo resultados están en línea con el experimento de la caspasa que apoya la idea de que el imatinib con MX es más potente inductor de la muerte celular que con DXR. El imatinib se ha informado anteriormente para causar la interrupción de G1 en líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello [21] mientras que MX y DXR detención G2 causa [22]. Vimos ninguna detención G1 con imatinib solo.
regulación a la baja de c-Abl con siRNA impide la citotoxicidad de MX + imatinib
Imatinib y MX mostraron un efecto aditivo en la reducción del número de control de siRNA HeLa Células. Cuando c-Abl fue derribado con siRNA, se encontró que la proliferación de las células no tratadas se redujo en un 30 a 50% en experimentos repetidos (Figura 6, Video S2). Tanto las curvas de crecimiento y los datos de microscopía de lapso de tiempo muestran una ligera inhibición del crecimiento de células c-Abl siRNA HeLa. Sin embargo, ni el control de ARNsi ni c-Abl siRNA solo indujo la muerte celular. Este resultado sugiere que se requiere c-Abl para la proliferación normal de estas células. La orientación de c-Abl en células HeLa de siRNA prestados a las células menos sensibles a MX. células CaSki también eran menos sensibles a MX cuando c-Abl se downregulated con siRNA, pero no se observó inhibición de la proliferación. Estas células eran más difíciles de transfectar con siRNA y fue alcanzado sólo el 40% de eficacia. Esto también puede explicar por qué la proliferación no fue inhibida en estas células. Además, el efecto combinatorio de imatinib se redujo significativamente, lo que implica c-Abl como el objetivo fundamental de imatinib en este resultado. El último hallazgo también está en consonancia con los experimentos con otros objetivos de imatinib, PDGF y c-Kit. AG1296 es conocida para inhibir potentemente la señalización de α- PDGF humano y beta-receptores, así como del factor de células madre del receptor de c-Kit relacionada, a 1 micras y 5 micras concentraciones, respectivamente. AG1296 no podía imitar la acción de imatinib con MX (Figura 7A). Además MX no tiene ningún efecto sobre la fosforilación del receptor de PDGF (Figura 7B). Además, el experimento siRNA a entender que la quinasa activa c-Abl es responsable de la supervivencia celular después de un daño MX. De importancia, este experimento apunta a diferentes roles para quinasa-quinasa-activo y inactivo c-Abl. aparece quinasa-inactivo c-Abl que se requiere para apoptosis con MX, pero quinasa activa c-Abl es un jugador clave para la reparación de daños en el ADN después de MX en células HeLa.
Las células (A) HeLa y CaSki fueron transfectadas con la orientación o no-c-Abl siRNA (75 nM). Se realizó análisis de transferencia Western para examinar el efecto de siRNA. Nivel de c-Abl se cuantificó y se corrigió para el nivel de β-actina. Los valores son proporcionados a los niveles de control de siRNA para cada línea celular. células CasKi (B) HeLa, y (C) se transfectaron con el control o c-Abl siRNA. Después las células se trataron con treansfection MX (0,6 M), imatinib (5 M) y su combinación para 48 h. La cantidad relativa de células supervivientes se determinó por WST-1 de ensayo. Los resultados son de dos experimentos independientes por triplicado. Los datos se muestran como media ± DE. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001. Wang et al. Chen et al.