primaria
Extracto
Antecedentes
La evidencia reciente vincula la activación aberrante de Hedgehog (Hh) de señalización con la patogénesis de varias cánceres incluyendo meduloblastoma, de células basales, células pequeñas de pulmón, de páncreas, de próstata y de ovario. Esta investigación fue diseñado para determinar si la inhibición de esta vía podría inhibir el crecimiento de cáncer de ovario seroso.
Metodología
utiliza un
in vivo
modelo de pre-clínica de cáncer de ovario seroso para caracterizar la actividad anti-tumor de Hh inhibidores de la vía ciclopamina y un derivado clínicamente aplicable, IPI-926. tejido tumoral primaria humana seroso de ovario se utilizó para generar los xenoinjertos tumorales en ratones que fueron tratados posteriormente con ciclopamina o IPI-926.
Principales conclusiones
Ambos compuestos demostraron una actividad antitumoral significativa como agentes únicos . Cuando se utilizó IPI-926 en combinación con paclitaxel y carboplatino (T /C), no se observó efecto sinérgico, aunque el tratamiento sostenido con IPI-926 después de la interrupción de T /C continuó suprimir el crecimiento tumoral. actividad de la vía Hh se analizó por RT-PCR para evaluar los cambios en
Gli1
los niveles de transcripción. Una sola dosis de IPI-926 inhibe estromal ratón
Gli1
los niveles de transcripción a las 24 horas con sin cambios intra-tumoral humano
Gli1
niveles. terapia IPI-926 crónica durante 21 días, sin embargo, inhibe la señalización de Hh en tanto estromal ratón y células tumorales humanas. Expresión de datos desde el estroma micro-disecados en los tumores ováricos serosos humanos confirmaron la presencia de
Gli1 Versión taquigráfica y una asociación significativa entre el
Gli1
elevados niveles de transcripción y empeoró la supervivencia.
conclusiones /Importancia
tratamiento IPI-926 inhibe el crecimiento del tumor seroso que sugiere la vía de señalización Hh contribuye a la patogénesis del cáncer de ovario y puede ser prometedora como una nueva diana terapéutica, especialmente en el punto de estabilidad.
Visto: McCann CK, Growdon WB, Kulkarni-K Datar, Curley MD, Friel AM, Proctor JL, et al. (2011) La inhibición de la señalización de Hedgehog antagoniza seroso de ovario el crecimiento del cáncer en un modelo de xenoinjerto de Primaria. PLoS ONE 6 (11): e28077. doi: 10.1371 /journal.pone.0028077
Editor: Sandra Oršulić, el Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Junio, 2011; Aceptado: 31 Octubre 2011; Publicado: 29 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 McCann et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue financiado por subvenciones del Fondo de Investigación del cáncer de Ovario (BRR), Advanced Medical Research Foundation (BRR), y los Fondos de Investigación Memorial Vicente (BRR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Jennifer L. Proctor, Hana Sheikh, Igor Deyneko, Jeanne A. Ferguson, y John R. MacDougall son empleados de Infinity farmacéuticos. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
En los Estados Unidos, se estima que el cáncer de ovario para afligir a aproximadamente 22.000 mujeres y causar casi 14.000 muertes al año. El riesgo de desarrollar cáncer de ovario es de 1 en 70 y es el quinto cáncer más letal en las mujeres [1]. La mayoría de los pacientes con cáncer de ovario presentan con enfermedad en etapa tardía que se trata con una cirugía de citorreducción y quimioterapia basada en platino. A pesar de que el 70-80% de las mujeres logran una respuesta clínica completa, una mayoría de los pacientes desarrollan enfermedad recurrente que es con frecuencia quimioresistente. Nuevos enfoques de tratamiento que utiliza terapias citotóxicas convencionales en combinación con terapias dirigidas molecularmente dirigidos contra las vías de señalización específicas necesarias para el desarrollo y progresión del tumor potencialmente prometedor, ya que las estrategias para el tratamiento duradero de cáncer de ovario primario y recurrente [2].
El erizo (Hh) vía de transducción de señales comprende una familia de proteínas altamente conservadas que actúan principalmente durante la embriogénesis para regular el destino de células madre y la organogénesis, y promover la proliferación, la regeneración y la diferenciación de tejidos somáticos en el adulto [3]. Patched 1 (Ptch1), un receptor de membrana, normalmente inhibe la proteína de membrana Smoothened (Smo) a partir de la activación de Gli1. La unión del ligando Hh (Sonic, indio o del desierto) para Ptch1 anula sus efectos represivos sobre SMO lo que permite la translocación de Gli1 al núcleo donde induce la expresión de genes diana [4], [5]. la activación aberrante de la ruta de Hh en la edad adulta se ha asociado con el desarrollo de la transformación maligna en una variedad de cánceres humanos [4], [6], [7], [8], [9], [10], [11] , [12]. Además, las células iniciadoras del tumor en algunos tipos de cáncer han demostrado ser dependientes de la señalización de Hh inducida sostenido y la posterior activación de Gli1 resultante de ligando sobre-expresión o activación mutacional de la vía de Hh [6], [13]. Los regímenes de tratamiento con antagonistas de la vía Hh en combinación con terapias moleculares y citotóxicos convencionales han demostrado
in vitro
y
in vivo
actividad contra la proliferación en el meduloblastoma, células basales, de mama, de pulmón de células pequeñas, de próstata y modelos de cáncer de páncreas [10], [11], [12], [14], [15], [16], [17]. Estos antagonistas se encuentran actualmente en fase I y II de los ensayos clínicos de fase.
La activación de la vía Hh ha sido documentada en el cáncer de ovario como un posible mecanismo implicado en la neoplasia. gen alterado y la expresión de la proteína de los miembros Hh vía Gli1, SMO, Ptch1, Desert hedgehog (Dhh) y Sonic hedgehog (Shh) en el cáncer de ovario se ha informado, aunque sigue siendo [18], [19 por aclarar la prevalencia exacta y el patrón ], [20], [21]. Mientras que muchos estudios sugieren que el 50-60% de los tumores de ovario invasivos manifiesto activación de la vía Hh, otros investigadores han argumentado que la activación significativa a través de la expresión alterada de múltiples proteínas de la vía se produce en menos de 20% de las muestras clínicas a prueba [19], [20]. Mientras que una correlación directa entre la expresión de Dhh y el estadio clínico, el subtipo histológico o la supervivencia se ha informado, es claro si la expresión del ligando de Dhh se asocia con una disminución de la supervivencia [20]. Otros análisis de muestras de carcinoma de ovario han sugerido que la expresión elevada de proteínas Gli1 es un factor independiente asociado con la disminución de la supervivencia al ajustar por edad, estadio, grado y tipo histológico [18].
in vitro
y limitados
in vivo
estudios proporcionan pruebas que sugieren que la vía de señalización Hh juega un papel importante en la proliferación de células de cáncer de ovario. Shh se detectó en un número de líneas celulares de cáncer de ovario y la adición de un anticuerpo monoclonal contra Shh resultó en una disminución dependiente de la dosis en la proliferación celular [21]. Del mismo modo, se ha encontrado el tratamiento de células de cáncer de ovario cultivadas con el inhibidor de la ciclopamina Smo para inducir la detención del ciclo celular en G1 y promover la apoptosis [20]. Por otra parte, la expresión ectópica de Gli1 en células de cáncer de ovario consecuencia un aumento de la proliferación celular, la movilidad y propiedades invasivas [18]. xenoinjertos derivados de la línea celular de carcinoma de ovario también son susceptibles a la inhibición vía Hh como su crecimiento se deteriora notablemente después del tratamiento con ciclopamina [21]. La mayoría de los datos disponibles sugieren que una cascada de señalización Hh activado puede ser un posible motor de la neoplasia en una proporción significativa de los cánceres ováricos epiteliales por lo que es un objetivo atractivo para la inhibición terapéutica.
Hemos explorado esta posibilidad mediante el Hh inhibidor de la vía IPI-926, un derivado de la ciclopamina con un aumento de la biodisponibilidad oral y una vida media más larga [22]. IPI-926 antagoniza la vía Hh mediante la inhibición de Smo. IPI-926 induce una reducción dependiente de la dosis en
Gli1
la expresión del ARNm y la remisión del tumor duradera en un modelo murino meduloblastoma [22]. Aunque IPI-926 no tuvo ningún efecto como agente único en un modelo de ratón de cáncer de pulmón de células pequeñas antes de la quimioterapia, los animales tratados con IPI-926 después de la quimioterapia mostraron una inhibición dramático en nuevo crecimiento tumoral [22]. Teniendo en cuenta estos datos preclínicos, hemos tratado de determinar si la inhibición de la vía de Hh por ciclopamina o IPI-926 tuvo un efecto sobre el crecimiento de xenoinjertos papilares serosos de ovario humano de cáncer derivadas de tejido humano primario obtenido en el momento de la cirugía inicial. Luego se evaluó la actividad antitumoral de IPI-926 en nuestro modelo de xenoinjerto en combinación con paclitaxel y carboplatino y como un solo agente de la terapia de mantenimiento. Por último, se determinó el efecto de una sola dosis y el tratamiento prolongado IPI-926 en actividad de la vía Hh tanto en las poblaciones de células del estroma y del tumor. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que la vía de señalización Hh contribuye a la patogénesis del cáncer de ovario seroso y la inhibición de esta vía puede tener un beneficio terapéutico.
Materiales y Métodos
El análisis inmunohistoquímico
Un microarray de tejido de cáncer de ovario (T8235725, Biochain, Hayward, CA) que comprende 64 tumores de ovario humano benignos y malignos se utilizó para el análisis inmunohistoquímico de la expresión de la proteína Shh. La recuperación del antígeno se llevó a cabo en tampón de recuperación objetivo citrato, usando una olla a presión durante 40 minutos y las secciones se trataron con peróxido de hidrógeno al 3% y se incubó en fondo Sniper (Biocare, Concord, CA) para bloquear cualquier unión no específica. La incubación de las secciones con el ab53281 anticuerpo monoclonal anti-Shh (Abcam, Cambridge, MA) diluido en diluyente de 1:2000 DaVinci Green (Biocare médico, Concord, CA) se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 90 minutos. Las secciones fueron incubadas con conejo en el sistema de polímero de roedores (Biocare médico, Concord, CA) durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se trataron a continuación con 3, 3 'cromógeno diaminobencidina (DAB) durante 5 minutos para la visualización. Las secciones fueron contrateñidas con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron. El total de IgG de conejo sustituido por los anticuerpos primarios sirvió como control negativo.
colección y propagación del tumor
in vivo
El exceso de muestras tumorales de ascitis o humanos se obtuvieron a través de un aprobado por el IRB infraestructura bancaria centralizada en el hospital general de Massachusetts (MGH). consentimiento informado por escrito se recibe de todos los participantes. No hubo muestras derivadas de los menores en este estudio. El protocolo repositorio de tejido MGH Gyn (07-049) fue revisado y aprobado por el Centro de Cáncer Dana-Farber de Harvard (DFHCC). Además, hemos utilizado muestras archivadas derivados de patología MGH bajo un protocolo aprobado institucional (2008P001695).
suspensiones de células individuales de cualquiera enzimático procesado de tejido de tumor sólido o ascitis fueron entonces agotados de los componentes hematológicas como se describe [23]. Un número determinado de células se suspendieron en PBS:Matrigel® (01:01) y se inyecta por vía subcutánea (s.c.) en 6-8 semanas de edad NOD hembra /ratones SCID (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Los animales fueron controlados regularmente para determinar la formación de tumores y sacrificados cuando se convirtió moribundos o tenía la carga tumoral excesiva. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Hospital General de Massachusetts Subcomité de Investigación y Cuidado de Animales (número de protocolo 2005N000273). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Para la propagación continuada en ratones, se extirparon los tumores de xenoinjertos y enzimático procesado a una suspensión de células individuales. La suspensión se agota de ratón
d + células utilizando MACS perlas H-2K (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemania) y las células derivadas de tumores restantes fueron re-inyecta por vía subcutánea en ratones NOD nuevo receptor /SCID. Todos los tumores papilares serosos de ovario humanos primarios utilizados en este estudio se habían sometido a 4-5 pasajes
in vivo
y la histología serosa de cada uno se mantuvo durante todo el proceso de trasplante de serie. Los animales fueron alojados y mantenidos de acuerdo con las directrices institucionales.
El tratamiento de ratones con inhibidores de la vía Hh
ciclopamina.
Los ratones portadores de tumores de tamaño emparejados (300-600 mm
3) de la serosa muestra de cáncer de ovario humano SOC11 fueron asignados al azar en dos grupos de seis ratones. Cada cohorte recibió ya sea 25 mg /kg ciclopamina o vehículo (30% (w /v) 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPBCD) en tampón de fosfato citrato de sodio 0,1 M, pH 3,0) por alimentación forzada oral diaria. El período de tratamiento se extendió por 13 días. medidas de los tumores y los pesos de los animales se evaluaron cada 4 días. Los tumores se midieron semanalmente con calibradores y el volumen del tumor (mm
3) se determinó utilizando la fórmula [longitud (mm) x anchura (mm) x anchura (mm)] /2. pesos de los ratones se evaluaron cada 4-7 días para monitorizar la toxicidad potencial asociada con cada tratamiento. Al final del periodo de tratamiento los animales fueron sacrificados y los tumores se recogieron para su posterior análisis
IPI-926:.
Veinticuatro ratones portadores de tumores de xenoinjertos SOC12, SOC13 o SOC14 fueron aleatorizados en cuatro cohortes con volúmenes tumorales emparejados (300-600 mm
3). El paclitaxel /carboplatino (T /C) por sí sola cohorte recibió inyección semanal intraperitoneal (ip) de 15 mg /paclitaxel kg y 50 mg /kg carboplatino y de la IPI-926 vehículo 5% (w /v) (HPBCD) administrada cada dos días por sonda oral. El IPI-926 solo cohorte recibió 40 mg /kg IPI-926 cada dos días por sonda oral y Cremophor:ethanol (01:01, vehículo paclitaxel) y solución salina (vehículo carboplatino) por vía intraperitoneal semanal inyección. Los ratones en el /C + IPI-926 cohorte T recibió paclitaxel semanal (15 mg /kg, i.p.) y carboplatino (50 mg /kg, i.p.) y 40 mg /kg IPI-926 (cada dos días, sonda oral). El grupo de control recibió el paclitaxel, carboplatino y el IPI-926 vehículos en el horario de dosificación apropiada para cada uno. volúmenes de los tumores y los pesos de ratón se evaluaron cada 4-7 días como se describió anteriormente.
La última dosis de la cohorte de T /C se administró en el día 14. Después de 21 días, los ratones en el control y IPI-926 solo cohortes fueron sacrificados y se recogieron sus tumores. Las porciones de cada tumor se congelaron para análisis de ARN y embebidos en parafina para el análisis histológico.
Tras la finalización del tratamiento T /C, los ratones en el T /C sola y T /C + IPI-926 cohortes continuaron para recibir ya sea vehículo IPI-926 (T /C solo grupo) o 40 mg /kg IPI-926 (T /C + grupo IPI-926) cada dos días por sonda oral. Este tratamiento se llevó a cabo el mantenimiento de 18-30 días. Al final del período de mantenimiento, los animales fueron sacrificados y los tumores se recogieron y se procesaron para RNA y análisis histológico tal como se describe anteriormente.
El tratamiento agudo IPI-926
Ratones que albergan xenoinjertos (3-600 m
3) derivados de SOC12, SOC13 o SOC14 fueron tratados con 40 mg /kg, IPI-926 o IPI-926 vehículos por sonda oral. Después de 24 horas se sacrificaron los animales. Sus tumores se cosecharon y porciones de cada se congelaron rápidamente para el análisis de RNA y embebidos en parafina.
análisis RT-PCR
RNA fue aislado de tejido tumoral congelado usando el GenElute ™ kit de extracción de ARN de mamífero (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) siguiendo las instrucciones del fabricante. Dos microgramos de RNA aislado se utilizaron para sintetizar ADNc utilizando el kit de Invitrogen Superíndice ™ VILO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los cebadores y sondas para ratón
Gli1
fueron adquiridos de Applied Biosystems Inc. (Carlsbad, CA, número de catálogo Mm00494645_m1). Los cebadores y sondas para humanos
Gli1
fueron diseñados en la empresa: hacia adelante: 5'-CTTTCATCAACTCGCGATGC-3 '; inversa: 5'-GCTCATGGTGCCAATGGAG-3 '; sonda: 5'FAM-CATCTCCAGGAGGCTCCTACGGTCA TC-TAMRA-3 '. Los cebadores fueron diseñados para abarcar exón-exón cruces para evitar la detección de ADN genómico. Los niveles de expresión del ser humano y el ratón
Gli1
genes se normalizaron a GAPDH y cuantificado como se describe por Applied Biosystems Inc.
Además de
Gli1
ARNm, se analizaron
SHH
,
SMO
,
y Ptch1
niveles de mRNA en las 4 muestras de pacientes utilizados para generar explantes tumorales para probar la inhibición de la vía Hhog. Los cebadores y sondas para humanos
SHH gratis (número de catálogo Hs00179843_m1),
SMO gratis (número de catálogo Hs00170665_m1), y
Ptch1 gratis (número de catálogo Hs00970980_m1) fueron adquiridos de Applied Biosystems Inc. . (Carlsbad, CA).
los niveles de expresión del ser humano
SHH
,
SMO
,
y Ptch1
genes se normalizaron a GAPDH y se cuantificaron como se describe por Applied Biosystems Inc.
Análisis de
Gli1
expresión en el estroma del tumor de ovario humano
última etapa de serosas primarias ejemplares tumores de ovario de alto grado se obtuvieron antes de la quimioterapia de 19 pacientes con cáncer de ovario hospitalizados en el hospital Brigham y de Mujeres, entre 1990 y 2000. la clasificación se determina de acuerdo con la Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia normas. Todas las muestras y su correspondiente información clínica se obtuvieron en los protocolos aprobados por el IRB. Se realizó la microdisección y aislamiento de ARN como se describe anteriormente [24]. Brevemente, los fibroblastos de 7 micras secciones congeladas se microdissected usando un microscopio MD LMD microdissecting láser (Leica, Wetzlar, Alemania) y se lisaron en tampón de lisis RLT (Qiagen, Valencia, CA). Se extrajo el ARN y se purificó usando el kit RNeasy Micro (Qiagen, Valencia, CA). muestras de ARN totales se cuantificaron y comprueba su calidad con un sistema Bioanalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, CA) y luego se amplifican como se describe anteriormente [24]. Cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) se realizó en 50 ng de producto de doble amplificado a partir de las 19 muestras utilizando conjuntos de cebadores específicos para
Gli1 gratis (ACCCCCTGGACTCTCTTGAT hacia adelante, GACACTCATGTTGCCCACAG inversa). Se utilizó un Sistema de PCR de detección (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) iCycler iQ en tiempo real junto con el superíndice III Platinum SYBR Green One-Step QRT-PCR kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. rango suma pruebas Wilcoxan Análisis FODA
estadística
no paramétricas para muestras no apareadas se utilizaron para comparar el tamaño del tumor en la ciclopamina y experimentos de tratamiento IPI-926. Se utilizaron pruebas t de Student para determinar la significación estadística de los resultados obtenidos en el experimento el tratamiento agudo y prolongado, IPI-926. Significación se fijó en p = 0.05. STATA (College Station, TX) se utilizó el software v10. El análisis de supervivencia se realizó utilizando GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU.).
Resultados
Shh y Gli1 expresión en tumores de ovario humano
Recientes estudios han puesto de relieve el papel de la vía de señalización Hh en el desarrollo y la progresión de tumores sólidos [25]. Se evaluó la expresión relativa de los miembros Hh vía de Shh y Gli1 en un subconjunto de tumores de ovario. Como se muestra en la Figura 1A, el análisis inmunohistoquímico diferencial de la expresión de Shh en un microarray de tejido que comprende tumores benignos y malignos determinado que 47% de los tumores de ovario epiteliales malignos evaluados tenían niveles detectables de expresión de Shh. En comparación, se detectó la expresión de Shh en solamente 1 de 5 tumores de ovario no epiteliales. Como lo demuestran los ejemplos que se muestran en la Figura 1A, el nivel y la distribución de la expresión de Shh varió ampliamente entre los tumores analizados. A continuación, examinó la expresión de
Gli1
ARNm en los tumores humanos primarios individuales papilares serosos de ovario SOC1-SOC10 (ver Tabla S1 para los datos del paciente) por RT-PCR. Se ha observado una amplia gama de
Gli1
la expresión del ARNm en todos los tumores analizados (Figura 1B). Además, se analizaron
SHH
,
SMO
,
Ptch1
,
y Gli1
niveles de mRNA en las 4 muestras de pacientes individuales que usamos para generar tumores xenoinjertos para analizar el efecto de la inhibición de la vía Hh en el crecimiento del tumor de ovario
in vivo gratis (Figura 2). En cada uno de los tumores,
Gli1
y
SMO
se expresaron con mayor abundancia relativa de
Ptch1
. Hubo poca o ninguna
SHH
ARNm expresado en estas muestras. Tomados en conjunto, estos análisis de expresión sugieren que la vía de señalización Hh se activa en un subconjunto de tumores de ovario humanos Como se informó anteriormente.
A. El análisis inmunohistoquímico de la expresión de Shh se llevó a cabo en una micromatriz de tejido que lleva 64 tumores de ovario primarios individuales para evaluar tanto la frecuencia y el nivel de expresión de Shh en el cáncer de ovario humano. Se muestra la tinción de Shh en un cystadenocarcinoma serosa pobremente diferenciado (panel superior izquierdo), una cystadenocarcinoma mucinoso pobremente diferenciado (panel superior derecho), un cystadenocarcinoma bien diferenciado (panel inferior izquierdo), y un adenocarcinoma pobremente diferenciado (panel inferior derecho). La tabla resume la frecuencia de tinción Shh en los tumores benignos y tumores malignos no epiteliales y epiteliales presentes en el microarray tumor de ovario. B. en tiempo real Q-PCR se realizó para el análisis de
Gli1
los niveles de ARNm en 10 tumores de cáncer primarios humanos papilares serosos de ovario. Primers específicos para el consumo humano
Gli1
y
GAPDH
fueron utilizados. Para cada muestra, el nivel de
Gli1
ARNm en relación con el nivel de
se muestra GAPDH ARNm
.
La expresión de
Gli1
,
Ptch1
,
SHH
y
SMO
se analizó por RT-qPCR en 4 tumores primarios humanos seroso de ovario (SOC11-SOC14) establecidos como xenoinjertos en ratones NOD /SCID .
GADPH
se utilizaron primers específicos para cada gen humano y humanos. Para cada tumor, los niveles de cada gen en relación a
GADPH
ARNm se muestran.
La inhibición de la señalización de Hh bloquea el crecimiento de xenoinjertos de tumores de ovario seroso humanos
para evaluar la importancia funcional de la vía Hh en la progresión del cáncer de ovario, se trataron ratones que albergaban xenoinjertos de tumor de ovario seroso humanos generados a partir del platino SOC11 tumor sensible, ya sea con la ciclopamina Hh inhibidor de la vía o vehículo y se evaluó periódicamente el efecto de cada tratamiento sobre el volumen del tumor. En los ratones tratados con ciclopamina, el crecimiento del tumor se impide durante el período de tratamiento de trece días resulta en una significativa (p & lt; 0,004) se redujo el volumen del tumor en el día 13 con relación a la observada en los animales tratados con vehículo (Figura 3). toxicidad mínima se observó en los animales tratados con ciclopamina sin observadas estadísticamente diferentes cambios en el peso del ratón (Figura S1).
ratones portadores de xenoinjertos de tumores humanos de ovario seroso papilar de la muestra SOC11 fueron distribuidos aleatoriamente en 2 cohortes con volúmenes tumorales emparejados y tratados con vehículo o con ciclopamina. Los volúmenes tumorales fueron evaluados con regularidad. Cambio en el volumen del tumor se muestra en relación con el volumen tumoral al comienzo del experimento. Las barras de error representan el error estándar de la media (S.E.M.). La significación se determinó mediante una prueba de suma de rangos de Wilcoxon.
Nuestro análisis del efecto de ciclopamina en el crecimiento de tumores de xenoinjertos sugiere que la inhibición de la señalización de Hh puede ser un método eficaz para controlar la progresión del tumor de ovario. Estamos próximos a cabo experimentos similares utilizando el químicamente más potente y clínicamente aplicable inhibidor de la vía Hh IPI-926 actualmente en Fase I /II de ensayos clínicos en tumores sólidos no ováricos. IPI-926 se deriva de la ciclopamina y ha mejorado las propiedades farmacéuticas que incluyen una mayor potencia, una vida media más larga y una mayor biodisponibilidad. Estamos especialmente interesados en examinar la utilidad potencial de IPI-926 en combinación con la quimioterapia estándar de primera línea. Hemos llevado a cabo tres experimentos separados que utilizan tumores primarios humanos independientes serosos de ovario de xenoinjerto (SOC12, SOC13, y SOC14) para analizar la actividad anti-tumor de IPI-926 solo o en combinación con paclitaxel y carboplatino (T /C). Los xenoinjertos de tumores se derivaron de 2 pacientes con enfermedad de platino resistente (SOC12, SOC13) y 1 paciente con enfermedad sensible platino (SOC14) y los resultados de esos análisis se muestran en la Figura 4. Los ratones portadores de xenoinjertos de tumores primarios humanos serosos de ovario fueron aleatorizados en cuatro grupos de tratamiento que recibieron el control del vehículo, IPI-926 solo, T /C solo o IPI-926 y T /C. Durante el período de tratamiento inicial (día 0-21), el volumen del tumor en los ratones tratados con el control del vehículo aumentaron dramáticamente (Figuras 4A, 4B, 4C). Tratamiento de xenoinjertos de SOC12, SOC13 y SOC14 con T /C solo resultó en una disminución significativa en el volumen del tumor (p & lt; 0,05; p & lt; 0,007; p & lt; 0,001, respectivamente) en relación con el tratamiento control. Al igual que la ciclopamina, IPI-926 como agente único tenía un efecto estadísticamente significativo inhibidor sobre el crecimiento del tumor en relación con el control del vehículo, tanto para SOC13 (Figura 4B, p & lt; 0,007) y SOC14 (Figura 4C, p & lt; 0,01). La combinación de IPI-926 y T /C no demostró actividad antitumoral mayor que T /C solo para todos los tumores ensayados. En estos análisis, se observó ninguna pérdida significativa de peso en los animales tratados con IPI-926 como agente único en comparación con los animales tratados con vehículo (Figura S2).
Los ratones portadores de tumores derivados de pacientes con diagnóstico de cáncer de ovario seroso se asignaron al azar en 4 cohortes (n = 4-6 animales por cohorte de tratamiento) con volúmenes de tumor emparejados y se sometieron a los regímenes de tratamiento indicados. Tres papilares serosos muestras de cáncer de ovario independientes, SOC12 (A), SOC13 (B) y SOC14 (C) se utilizaron como réplicas biológicas. Las cohortes se trataron inicialmente con vehículo solo (control), paclitaxel y carboplatino (T /C) por sí sola, IPI-926 solo o T /C + IPI-926 como se indica. La última dosis de T /C fue entregado el día 14 (indicado por la línea de puntos). El porcentaje de cambio en el volumen del tumor representa el cambio en el volumen del tumor en relación con el volumen tumoral al comienzo del experimento. Las barras de error representan el error estándar de la media (S.E.M.). La significación se determinó a través de una prueba de suma de rangos de Wilcoxon.
A continuación examinó la actividad antitumoral del IPI-926 tras la interrupción del tratamiento T /C. Para estos análisis, los ratones que recibieron T /C solo o en combinación con IPI-926 se administraron su dosis semanal tercera y última de T /C en el día 14 del régimen de tratamiento (línea de puntos, la Figura 4). Los animales se mantuvieron en vehículo (T /C cohorte solo tratado) o IPI-926 (T /C + IPI-926 cohorte tratada) y volúmenes de los tumores se evaluaron a intervalos regulares. Como se muestra en las Figuras 4A, 4B y 4C, la administración continuada de IPI-926 tras la finalización del tratamiento mantenido la regresión del tumor T /C, y en un caso (SOC13, la Figura 4B), resultó en una disminución adicional en el volumen del tumor a niveles que eran prácticamente indetectable. En contraste, se observó el continuo crecimiento de tumores en los ratones tratados con vehículo tras el cese de la administración de T /C. De este modo, continuó el tratamiento IPI-926 dio lugar a una disminución significativa (p & lt; 0,02). Diferencia en el volumen del tumor con relación a la observada en los ratones tratados con vehículo para los tres tumores primarios individuales
IPI-926 inhibe la actividad de la vía Hh en tanto el estroma y tumor
los datos recientes han sugerido que se requiere la señalización de Hh en el estroma para el desarrollo de tumores en modelos de xenoinjerto de ratón de páncreas y cáncer de colon (25). Para evaluar el sitio de acción de IPI-926 en nuestro sistema, se analizaron
Gli1
la expresión de ARNm tanto en estroma de ratón y células tumorales humanas ya sea después de tratamiento agudo o prolongado con IPI-926. Para los estudios agudos, los ratones que albergaban xenoinjertos generados a partir de SOC12, SOC13 y SOC14 se trataron con vehículo o IPI-926 durante 24 horas. Después de la cosecha del tumor, la expresión relativa de ratón y humano
Gli1
se evaluó mediante RT-PCR utilizando cebadores específicos de especie. El tratamiento agudo de IPI-926 dio lugar a una rápida disminución significativa en el ratón
Gli1
sin inhibición de la humana
Gli1
expresión (Figura 5, panel superior). Se analizaron también estromal y tumor específico
Gli1
expresión en los xenoinjertos SOC12, SOC13 y SOC14 cosechadas de los ratones tratados con vehículo o IPI-926 durante 21 días en los estudios que se muestran en la Figura 4. Al igual que en la aguda ajuste, prolongado tratamiento IPI-926 dio lugar a una inhibición significativa de la
Gli1
la expresión de ARNm en el estroma (p & lt; 0,05) compartimento (Figura 5, panel inferior). En contraste con lo que también se observó en la fase aguda, moderada inhibición de
se observó Gli1
la expresión del ARNm en el tumor (p & lt; 0,03). Después de un tratamiento prolongado
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niveles de expresión de mRNA en tumores de xenoinjertos derivados de SOC12, SOC13, y SOC14 se analizaron por PCR en tiempo real cuantitativa tras el tratamiento de ratones con IPI-926 durante 24 horas (panel superior) o 21 días (panel inferior). Los niveles relativos de humano (panel izquierdo) y el ratón (panel derecho)
Gli1
expresión del ARNm se analizaron utilizando cebadores específicos de especie. Las barras de error representan el error estándar de la media (S.E.M.). La significación (p≤0.03 #, * p = 0,05, ** p≤0.001) se determinó usando la prueba t de Student.
Alta
Gli1
expresión en el estroma de los humanos tumores ováricos serosos papilares se correlaciona con la supervivencia de los pobres
con el fin de validar que
Gli1
ARNm se expresa en el estroma de los tumores ováricos serosos humanos, hemos examinado la expresión relativa de
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en el estroma microdissected de una segunda cohorte de 19 tumores humanos primarios de ovario seroso (Tabla S2). El estroma micro-disecados de estos tumores demostró una gama completa de
Gli1
la expresión de ARNm (datos no mostrados). análisis de supervivencia univariante puso de manifiesto que la alta
Gli1
mRNA expresión en el estroma correlaciona con una empeorado significativamente la supervivencia (Figura 6).
Los datos obtenidos para el análisis de supervivencia
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en la expresión del ARNm muestras de estroma microdissected de 19 pacientes utilizando la validación de QRT-PCR. Superior
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la expresión del ARNm correlaciona con una menor supervivencia (log-rank test, p & lt; 0,015), con una supervivencia media de 26.50 meses para los pacientes con baja
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la expresión de ARNm frente a 16 meses para los pacientes que tenían tumores con mayor
Gli1
la expresión del ARNm en el estroma.
Discusión
Numerosos investigadores han documentado el papel de la vía de señalización Hh en el desarrollo y mantenimiento de tumores sólidos [4], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12]. La evidencia reciente sugiere que la activación de esta vía está involucrada en la patogénesis del cáncer de ovario (18, 20, 21). En nuestro estudio, el enfoque terapéutico de esta vía condujo a la inhibición del crecimiento del tumor seroso papilar humano.