Extracto
Antecedentes
La metástasis ósea es la forma más letal de varios tipos de cáncer. La β2-microglobulina (β2-M) /hemocromatosis (HFE) complejo desempeña un papel importante en el desarrollo del cáncer y la metástasis ósea. Hemos demostrado anteriormente que la sobreexpresión de β2-M en la próstata, de mama, de pulmón y cáncer renal conduce a un aumento de la metástasis ósea en modelos de ratón. Por lo tanto, la hipótesis de que la β2-M es un objetivo racional para el tratamiento de la próstata metástasis ósea del cáncer.
Resultados
En este estudio, hemos demostrado el papel de β2-M y su pareja de unión, HFE , en la modulación de sensibilidad a la radiación y la quimioterapia sensibilidad del cáncer de próstata. Por la eliminación genética de β2-M o HFE o el uso de un anticuerpo anti-β2-M (Ab), se demuestra que las células de cáncer de próstata son sensibles a la radiación
in vitro
y
in vivo
. La inhibición de la β2-M o HFE sensibiliza las células de cáncer de próstata a la radiación mediante el aumento de hierro y especies reactivas de oxígeno y la disminución de la reparación del ADN y de las proteínas de respuesta al estrés. Utilizando el modelo de ratón con xenoinjerto, se demuestra que el anti-β2-M Ab sensibiliza a las células de cáncer de próstata con el tratamiento de radiación. Además, anti-β2-M Ab fue capaz de prevenir el crecimiento tumoral en un modelo de ratón de cáncer de próstata espontáneo inmunocompetente. Desde la metástasis ósea es letal, se utilizó un modelo de xenoinjerto de hueso para probar la capacidad de anti-β2-M Ab y la radiación para bloquear el crecimiento del tumor en el hueso. El tratamiento de combinación impedido significativamente el crecimiento del tumor en el modelo de xenoinjerto de hueso mediante la inhibición de β2-M y la inducción de la sobrecarga de hierro. Además de los efectos sensibles a la radiación, la inhibición de β2-M sensibiliza las células de cáncer de próstata a los agentes quimioterapéuticos.
Conclusión
Dado que los pacientes metastásicos del hueso del cáncer de próstata tienen alta β2-M en el tejido tumoral y, en la forma secretada, dirigidas β2-M con anti-β2-M Ab es un agente terapéutico prometedor. Además, la inhibición de β2-M sensibiliza a las células cancerosas a los tratamientos utilizados clínicamente como la radiación mediante la inducción de la sobrecarga de hierro y la disminución de las enzimas de reparación del ADN
Visto:. Josson S, Matsuoka Y, Gururajan M, Nomura T, Huang WC, Yang X, et al. (2013) La inhibición de la β2-microglobulina /Hemocromatosis mejora la sensibilidad a la radiación por inducción de la sobrecarga de hierro en las células del cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (7): e68366. doi: 10.1371 /journal.pone.0068366
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Abril, 2013; Aceptado: 16-may de 2013; Publicado: 10 de julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Josson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo está apoyado en parte por subvenciones de investigación y PO1CA098912 RO1CA122602 de los Institutos nacionales de la Salud Instituto de cáncer /Nacional (LWK Chung). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
metástasis ósea del cáncer de próstata es letal. Más de 70% de pacientes con cáncer de próstata tienen metástasis ósea en la autopsia [1]. La tasa de supervivencia media de 5 años es sólo el 31% de los pacientes metastásicos. pacientes con cáncer de próstata con metástasis ósea se ha demostrado que tienen una alta expresión de β2-microglobulina (β2-M) en las células del cáncer [2]. β2-M es una proteína de membrana de la célula que forma complejos a la clase 1 MHC familia. β2-M es elevada en varios tumores sólidos y líquidos agresivos. Es un factor pleotropic que media en varios procesos, tales como el desarrollo del cáncer [3], la metástasis del cáncer [4], y osteomimicry [2]. Estudios anteriores demuestran que la orientación β2-M con el anticuerpo anti-β2-M (Ab) es una estrategia terapéutica prometedora en la próstata, tumores renales y líquidos [5] - [7]. Estudios anteriores demuestran que β2-M interactúa con la proteína de la hemocromatosis (HFE), que es un no clásico MHC clase 1 miembro [8]. β2-M /complejo HFE interactúa con el receptor de transferrina (TFRC1), y disminuye la afinidad de unión a transferrina TFRC1 [9]. Por lo tanto, β2-M /HFE impide la absorción excesiva de hierro. Los ratones que carecen β2-M o HFE desarrollan sobrecarga de hierro más adelante en la vida y enfermedades relacionados con el hierro [10], [11]. En este estudio hemos demostrado que la inhibición de β2-M usando un anticuerpo o la eliminación genética de β2-M o HFE en células de cáncer causa la sobrecarga de hierro y sensibiliza a las células de cáncer de próstata a la radiación
in vitro
y
in vivo Opiniones y agentes quimioterapéuticos
in vitro
.
Materiales y Métodos
Declaración Bioética
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el IACUC de la Universidad de Emory y las Cedars-Sinai Medical Center y realizado de conformidad con las directrices institucionales.
Cell Cultura y
ARCAP
M, ARCAP
e [12], C4-2, y C4 2B [13] las células de cáncer de próstata se obtuvieron en nuestro laboratorio como se describe anteriormente, y p69 (células no tumorigénicas), LNCaP, PC-3, DU145, TRAMP C1 y C2 TRAMP células de cáncer de próstata se adquirieron de ATCC. Las células fueron cultivadas en T-medio (GibcoBRL, Grand Island, NY) suplementado con 5% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS) (Bio-Whittaker, Walkersville, MD), 50 UI /ml de penicilina y 50 mg /ml de estreptomicina (GibcoBRL ) y se mantuvo en 5% de CO
2 a 37 ° C. Se ensayaron todas las células de micoplasma cada seis meses y fueron negativos (kit de detección de Mycoplasma, R & amp; D systems)
Ensayos de viabilidad celular
Clongenic ensayo se realizó como se ha mencionado anteriormente [14].. La viabilidad celular se determinó con un CellTiter 96 Una solución acuosa Ensayo de proliferación celular (ensayo MTS) (Promega, Madison, WI).
estudios de radiación
haz externo radioterapia fue entregado en un Varian 600 acelerador lineal con un haz de fotones de 6 MV para
in vitro
y
in vivo
experimentos (subcutánea e intra-tibial).
Análisis de inmunotransferencia
Western se realizó un análisis como [2] se describe anteriormente. Las membranas se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón contra β2-M, HFE, HSP27, HSP70 (Santa Cruz Biotechnology), NUDT1 y MPG (un regalo del doctor yugo Wah Kow), EF-1α (Upstate), y β-actina ( Sigma), respectivamente, a 4 ° C durante la noche.
anti-β2-M Ab Estudios
El anticuerpo utilizado en las figuras 1, 2 y 5 es de Santa Cruz Biotechnology. Dado que la solución de anticuerpo tenía concentración 0,005% final de azida de sodio y la gelatina, hemos probado si la azida de sodio o gelatina era tóxico para estas células. ARCAP
células de cáncer de próstata M no fueron afectados por dosis elevadas (0,1%) de azida de sodio o gelatina (Figura S1). El anticuerpo utilizado en la Figura 3 y 4 es de los ratones producidos a partir de ascitis BBM.1 de hibridoma (ATCC). El anticuerpo IgG se purificó usando un kit de purificación de IgG gel Melon (Fisher Scientific) y los niveles de anticuerpos se cuantificaron utilizando NanoDrop (Thermo Scientific). Hierro tinción de las células tratadas con IgG y anti-β2-M Ab se realizó con un kit de tinción de hierro (Sigma). Se utilizaron células de cáncer de LNCaP y C4-2 para detectar las proteínas de reparación del ADN en respuesta a anti-β2-M Ab. Las células fueron tratadas con anti-β2-M Ab (10 mg /ml) durante 24 h. Ratón TRAMP (C1 y C2), las células de cáncer de próstata se ensayaron con concentraciones crecientes de se examinó anti-β2-M Ab (0-10 g /ml) y su viabilidad celular.
A. sensibilidad a la radiación de ARCAP
E y ARCAP
M células de cáncer de próstata mediante el ensayo de clongenic. (** P & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001, prueba de t de Student). B. ARCAP
M células se sensibilizan a la radiación en presencia de anticuerpos anti-β2-M Ab utilizando el ensayo clongenic. (* P & lt; 0,03, *** p & lt; 0,008, ANOVA). C. Efecto de anti-β2-M Ab (0,8 mg /kg) y la radiación (15 Gy) en el crecimiento del tumor en subcutánea ARCAP
M modelo de xenoinjerto de ratones desnudos. (** P & lt; 0,01, prueba de la t de Student)
A.. tinción de hierro en el control y anti-β2-M Ab (5 g /ml) células tratadas utilizando kit de tinción de hierro en ARCAP
M próstata líneas celulares de cáncer. B. mitocondrial niveles de superóxido en respuesta al tratamiento anti-β2-M Ab en un tiempo y manera dependiente de la dosis en i. ARCAP
M, ii. líneas ARCAP
E celulares de cáncer de próstata (*** p & lt; 0,001, prueba de la t de Student) y iii. p69 inmortalizado células epiteliales de la próstata utilizando un tinte MitoSOX. C. dismutasa mitocondrial en ARCAP
M, KD
HFE1 y KD
HFE3 usando MitoSOX colorante (* p & lt; 0,05, prueba de la t de Student). D. Expresión de proteínas de respuesta al estrés y las enzimas de reparación del ADN en el control C4-2B Neo y líneas celulares knockdown β2-M. expresión de la proteína i.β2-M, ii. HSP27 y HSP70 expresión de la proteína y iii. expresión de la proteína NUDT1 y MPG. NUDT1 y MPG expresión de proteínas en respuesta al tratamiento anti-β2-M Ab en células de cáncer de próstata LNCaP y C4-2.
A. La viabilidad celular de las células de cáncer de próstata TRAMP C1 y C2 TRAMP en respuesta a anti-β2-M Ab. (*** P & lt; 0,001, de la t de Student). B. Fusionado imagen de infrarrojos y de rayos X del abdomen de los ratones TRAMP tratados con el control de IgG y anti-β2-M Ab cerca (n = 4). ratones parental Representante utilizó como control adicional (ratones C57BL /6). El tumorigenecity de grupo de anticuerpos IgG de control fue de 100% (n = 4) y el tumorigenecity de grupo tratado anti-β2-M Ab era 25% (n = 4). C. H & amp; E imágenes de próstatas de los ratones de control y de IgG anti-β2-M Ab ratones tratados (10x). D. célula inmune (células T y B) el número de ratones de tipo salvaje, los ratones de control de IgG y anti-β2-M Ab ratones medidos por citometría de flujo tratada. E. pesos corporales de los ratones TRAMP tratados con IgG o anti-β2-M Ab
incidencia de tumores en ratones se analizaron las tibias de H & amp;. E imágenes y escáneres de rayos x. El tumorigenecity de grupo de control fue de 94% (n = 18 tibias) y la tumorigenecity de anti-β2-M Ab + irradiación (IR) grupo tratado fue del 67% (n = 18 tibias). A. La progresión tumoral en el control y tratamiento de combinación (anti-β2-M Ab y la irradiación) se analizaron por los niveles de PSA (ng /ml). (*** P & lt; 0,006, de la t de Student). B. La tinción inmunohistoquímica de la tibia en el grupo control y el tratamiento de combinación manchado para H & amp; E, proteína β2-M, la tinción de hierro, p-CREB y p-histona H3 (10X) guía empresas
A.. La viabilidad celular de las células control C4-2B Neo y KD
células β2-M en respuesta a: taxotere (0,3 mM), cisplatino (10 M) y PS341 (1 M). (*** P & lt; 0,001, de la prueba t de Student) B. La viabilidad celular de las células de cáncer de próstata DU154 en respuesta a la combinación de anti-β2-M Ab (0,5 g /ml) y cisplatino (100 M) /doxorrubicina (100 M) . (*** P & lt; 0,001, de la t de Student). C. La viabilidad celular de células PC-3 de cáncer de próstata en respuesta a la combinación de anti-β2-M Ab (1 mg /ml) y cisplatino (100 M). (*** P & lt; 0,001, de la t de Student)..
experimentos in vivo en animales
xenoinjerto subcutáneo Estudio
Cuatro semanas de edad ratones desnudos masculinos ((NCRNU, Taconic) se inyectaron por vía subcutánea con 2 × 10
6 ARCAP
células de cáncer de próstata M con matrigel (01:01) en el flanco. Cuando el tumor alcanzó 4 mm
3, los ratones fueron tratados con IgG o anti-β2-M Ab en gelform®. El gelform® se sumergió en anticuerpo (0,8 mg /kg) y implanta quirúrgicamente adyacente a los tumores. Veinticuatro horas más tarde los tumores se irradiaron con 15 Gy. Cada grupo tenía cinco ratones . el volumen del tumor se midió semanalmente.
vagabundo los ratones del estudio.
TRAMP ratones se obtuvieron de la facilidad de la base del ratón de Emory. C57BL /6 ratones parentales también se utilizaron como controles. estudios previos demostraron anti- β2-M Ab era tóxico para las células de cáncer de próstata TRAMP
in vitro
. Los ratones 21-26 semanas de edad fueron emparejados por edad sabia y separados en un grupo control de IgG y anti-β2-M Ab. a partir de 21 /26 semanas a 32/37 semanas los ratones recibieron IgG Ab o anti-β2-M Ab (8 mg /kg) cada tres días para un total de 11 semanas. Los pesos corporales se midieron semanalmente. desarrollo tumoral se controló utilizando el colorante de infrarrojo cercano (NIR) IR-783 15 utilizando una máquina de MM estación de formación de imágenes Kodak 4000. Las imágenes de rayos X se tomaron simultáneamente y superponen para determinar la localización del tumor. Los ratones fueron sacrificados a las 33/38 semanas y fueron retirados de la próstata, se fijaron y seccionaron, y H & amp; E se llevó a cabo 4.
Intra-tibial Estudio
desnudo masculino de cuatro semanas de edad. ratones (NCRNU) (Taconic) se inyectaron con células de cáncer de próstata C4-2 (1 × 10
6 células) en suspensión en 10 l de PBS estéril en ambas tibias (n = 18). Una semana después de la inyección, se inyectó anti-β2-M Ab (8 mg /kg) intra-peritonially una vez cada 3 días para el resto del estudio. La progresión tumoral se determinó dos veces por semana, usando la detección de marcadores específicos de antígeno prostático (PSA). PSA en suero se midió por ELISA de microplacas usando una máquina de Abbott IMx (Abbott Park, IL). Nueve semanas después de la inyección del tumor, las tibias se irradiaron con 4 Gy en tres días consecutivos, de recibir un total de 12 Gy. se le dio un tratamiento anti-β2-M Ab antes del tratamiento de irradiación en los tres días. El tratamiento anti-β2-M Ab se continuó cada 3 días después de que el tratamiento de irradiación hasta la semana 11. A esquemática del protocolo de tratamiento se incluye en la Figura S2. En la semana 12 los ratones fueron sacrificados y las tibias fueron enviados a la patología. Tibias se recogieron y H & amp; E se llevó a cabo y la tinción de hierro (kit de tinción de hierro, Sigma). Tinción inmunohistoquímica para β2-M (Santa Cruz Biotechnology), se realizaron p-CREB (Cell Signaling Technology), y H3 (Millipore) p-histona como se describe anteriormente 2.
estudio de células inmunes: Los esplenocitos se prepararon aplastamiento bazos. Las células se lavaron y se incubaron con anticuerpos específicos tal como se describe anteriormente 16. Los anticuerpos utilizados fueron PE-Cy5 anti-CD45R /B220 (RA3-6B2), CD3-APC, CD4-PE y CD8-FITC obtuvo de eBiosciences. Los análisis se llevaron a cabo en un citómetro de flujo láser dual (FACSCalibur) 16.
reactivas del oxígeno Especies Estudios
dismutasa mitocondrial se detectó utilizando MitoSOX (Molecular Probes, Eugene, OR). Las muestras se incubaron durante un mínimo de 40 minutos a 37 ° C en la oscuridad en un rotador y se midió la fluorescencia.
Desmontables estable de β2-M y HFE En Arcap
células M
control y β2-M siRNA se transfectaron con retrovirus en ARCAP
células M. desmontables células Β2-M se indican como KDI y KDII. Lentiviral transducción se realizó para inhibir HFE, según las instrucciones (Sigma, St. Louis, MO). Las células fueron seleccionados utilizando puromicina (4 mg /ml) como se informó anteriormente 4. Las células de control negativo que no han recibido las partículas virales murieron en 3-5 días. Las células transducidas HFE shRNA fueron caracterizados por niveles de HFE 7-10 días después de la transducción. desmontables células C4-2B (NEO) de control y C4-2B β2-M (KD
β2-M) se generaron con anterioridad 2.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado al menos dos veces independientes. Los valores se expresan como media ± desviación estándar. El análisis estadístico se realizó utilizando de Student
t-test o ANOVA
. Los valores de p & lt;. 0,05 se consideraron estadísticamente significativa
Resultados
anti-β2-M Ab sensibiliza a las células del cáncer de próstata a la radiación
En Vivo
estudios anteriores demuestran que β2-M y HFE juegan un papel importante en la progresión del cáncer 4. la inhibición de la β2-M, usando anti-β2-M Ab se ha demostrado que induce la muerte celular en varios tipos de cáncer incluyendo el cáncer de próstata. Más de 50% de los pacientes de cáncer sometidos a terapia de radiación invariablemente durante el curso de progresión de la enfermedad. Sin embargo, el tratamiento con radiación tiene efectos adversos. Las terapias dirigidas que incluyen anticuerpos terapéuticos potencialmente podrían actuar como agentes radiosensibilizadores. Para probar la hipótesis de que el tratamiento con anti-β2-M Ab será sensibilizar a las células de cáncer de próstata a la radiación, se utilizó el modelo de cáncer de próstata ARCAP bien caracterizado que hace metástasis al hueso en modelos de xenoinjerto de ratón. ARCAP
línea celular E es de tipo epitelial y tiene una baja propensión a la metástasis y también expresa bajos niveles de β2-M y el
línea celular ARCAP M, es mesenquimales-como y por el contrario, es altamente metastásico al hueso y expresa altos niveles de β2-M 4. La sensibilidad a la radiación se determinó usando el ensayo clonogénico. Demostramos que ARCAP
células M son más resistentes a la radiación en comparación con ARCAP
células E (Figura 1A). Para determinar si β2-M está implicado en resistencia a la radiación, generamos ß2-M caída estable ARCAP
células de cáncer de próstata M (clones KDII y KDI). Se realizó un ensayo clonogénico para determinar su sensibilidad a la radiación. Tanto KDI y KDII fueron más sensibles al tratamiento con radiación en comparación con ARCAP
control de las células M (Figura S3A). Además del enfoque genético, se utilizó anti-β2-M Ab para inhibir β2-M antes de la terapia de radiación. El tratamiento de combinación de anti-β2-M Ab (3 mg /ml) y la radiación tuvo un efecto sinérgico sobre la muerte celular de cáncer de próstata in vitro (Figura 1B). La sinergia se analizaron por ANOVA, y anti-β2-M Ab y la radiación tenido un efecto sinérgico en 4 Gy y 6 dosis de Gy de radiación. Desde β2-M interactúa con HFE para mediar en sus procesos celulares 4, derribaron HFE en ARCAP
M células de cáncer de próstata utilizando partículas de lentivirus shRNA. HFE expresión se redujo en las células HFE desmontables (KD clones
HFE1 y KD
HFE3) comparado con el control ARCAP
células M (Figura S3B). La inhibición de la HFE también disminuyó la expresión de β2-M, y por lo tanto los complejos de HFE β2-M /. La respuesta a la radiación de KD
HFE1 y KD
células HFE3 se determinó usando un ensayo clonogénico. KD
HFE1 y KD
células HFE3 eran más sensibles a la radiación comparación con el control ARCAP
células de cáncer de próstata M.
Para determinar si el anti-β2-M Ab y la irradiación Synergize
in vivo, inyectamos ARCAP
M células por vía subcutánea en los costados de ratones desnudos. Una vez que los tumores alcanzaron un tamaño de 4 mm
3 los xenoinjertos fueron implantados quirúrgicamente con anti-β2-M Ab IgG (0,8 mg /kg) en gelform®. Veinticuatro horas más tarde los tumores se irradiaron con 15 Gy. Cada grupo tenía cinco tumores y el volumen del tumor se midió semanalmente. Anti-β2-M Ab y la radiación se redujeron solo parcialmente el crecimiento del tumor. Sin embargo, en el grupo de tratamiento de combinación, ninguno de los tumores crecieron en los ratones (Figura 1C). Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-β2-M Ab es un agente eficaz para el tratamiento del cáncer de próstata, y el tratamiento de combinación con anti-β2-M Ab y la radiación es significativamente más eficaz que el anticuerpo única o radiación único tratamiento.
Inhibición de β2-M aumenta la sobrecarga de hierro, especies reactivas de oxígeno y disminuye las enzimas de reparación del ADN y el estrés respuesta proteínas
Los ratones transgénicos que carecen de β2-M o HFE han aumentado la sobrecarga de hierro 11. β2-M formulario /HFE un complejo e interactuar con el receptor de transferrina (TFRC1) 8,9. El /complejo HFE β2-M inhibe la formación de complejos de transferrina-TFRC1. Por lo tanto, se evita que el hierro que se une a la transferrina de entrar en la célula y por lo tanto los ratones que carecen β2-M de HFE han aumentado la sobrecarga de hierro. Hemos probado si anti-β2-M Ab podría inducir la sobrecarga de hierro y especies de oxígeno reactivas (ROS) en células de cáncer de próstata. ARCAP
M células fueron tratadas con se determinó el contenido anti-β2-M Ab (5 mg /ml durante 24 h) y el hierro mediante la tinción de hierro azul de Prusia. Se observó un aumento oscuro tinción con azul-negro de hierro en las células tratadas anti-ß2-M Ab comparación con el control de isotipo tratada ARCAP
células de cáncer de próstata M (Figura 2A). Para determinar si el anti-β2-M Ab aumento de las especies reactivas de oxígeno inducidas (ROS) como resultado del incremento de la sobrecarga de hierro, la prueba de los niveles de superóxido mitocondrial utilizando MitoSOX. Dos células de cáncer de próstata (ARCAP
M y ARCAP
E) y p69 inmortalizados se usaron células epiteliales de próstata normales para probar esta hipótesis. Se observó un aumento de la superóxido mitocondrial, una especie reactiva de oxígeno, en las células de cáncer de próstata y no en las células normales en una dosis y manera dependiente del tiempo en respuesta a la anti-β2-M Ab (Figura 2B). Estudios anteriores demuestran que las células HFE desmontables han aumentado hierro basal 4. Hemos probado si la inhibición de la HFE en células de cáncer de próstata podría alterar los niveles de superóxido mitocondrial. El nivel basal de dismutasa mitocondrial se midió utilizando MitoSOX y encontramos que los niveles basales se incrementaron en los clones desmontables HFE (KD
HFE1 y KD
HFE3) en comparación con el control (Figura 2C). resistencia a la radiación se incrementa por las enzimas de reparación del ADN elevadas y proteínas de respuesta al estrés. A continuación, hemos tratado de determinar cambios en las proteínas de respuesta al estrés en las células del cáncer de próstata caída β2-M. El uso del control C4-2B y las células de cáncer de próstata caída β2-M (KD
β2-M) que probamos los niveles de proteínas de respuesta al estrés, tales como la proteína de choque térmico 27 (HSP27) 17 y proteína de choque térmico 70 (HSP70) y 18 enzimas de reparación del ADN, tales como N-glicosilasa metilpurina-ADN (MPG) 19 y NUDIX (nucleósido difosfato radical unido a X) con motivos de tipo 1 (NUDT1) 20. Curiosamente, las proteínas de respuesta al estrés y el choque térmico fueron regulados a la baja en los clones desmontables β2-M KD
β2-M (Figura 2D). Además, las células de cáncer de próstata fueron tratados con se examinaron anti-β2-M Ab (10 mg /ml) durante 24 h y los niveles de proteína de las enzimas de reparación del ADN MPG y NUDT1. Anti-β2-M Ab disminuyó moderadamente los niveles de proteínas MPG y NUDT1. Estos estudios demuestran que los anticuerpos anti-β2-M Ab induce varios efectos citotóxicos, tales como la sobrecarga de hierro, aumento de los niveles de radicales libres, disminución de las enzimas de reparación del ADN y de las proteínas de respuesta al estrés en células de cáncer de próstata y por lo tanto sensibilizar a las células de cáncer de próstata a la radiación.
anti-β2-M Ab impide el crecimiento tumoral en un espontáneo inmuno-competentes transgénico adenocarcinoma de próstata de ratón (vagabundo) Ratones modelo
tRAMP C1 y C2 tRAMP células de cáncer de próstata 21 son líneas celulares derivadas de modelo de ratón espontánea adenocarcinoma. Se realizó en estudios in vitro para probar el efecto de anti-β2-M Ab en las líneas de células TRAMP. Tanto TRAMP C1 y C2 TRAMP células de cáncer de próstata murino se someten a muerte de las células con concentraciones crecientes de anti-β2-M Ab (Figura 3A). A continuación, hemos probado los efectos del anticuerpo
in vivo
. ratones TRAMP (edad 21 a 26 semanas) se emparejaron y se trataron o bien con una IgG de control o grupo anti-β2-M Ab (n = 4). ratones de los padres (ratones C57BL /6) se mantuvieron hasta el final del experimento. A partir de 21/26 semanas, los ratones recibieron 8 mg /kg de IgG Ab o anti-β2-M Ab cada tres días hasta que los ratones alcanzó 32/37 semanas y fueron sacrificados una semana más tarde. Los pesos corporales de los ratones se determinaron semanalmente. desarrollo tumoral se controló usando cerca de colorante infrarrojo (IR-783) 15 cada dos semanas. Imágenes se realizó con infrarrojos de imágenes y las imágenes de rayos X con una máquina de imágenes Kodak. Después se sacrificaron los ratones las próstatas se diseccionaron y se tiñeron mediante H & amp; E. Se encontró que tres de cada cuatro ratones en el grupo de control IgG desarrollado tumores y uno tenía hiperplasia, como se confirmó por H & amp; E y de imágenes por infrarrojos (Figura 3B, 3C). Curiosamente, tres de cada cuatro ratones no tenían tumor y uno ratones desarrollaron hiperplasia en el grupo tratado anti-β2-M Ab, como se confirmó por H & amp; E y de infrarrojos de formación de imágenes (Figura 3B, 3C). Así, el tumorigenecity del grupo de control fue del 100% y del anti-β2-M Ab era 25%. Desde β2-M se expresa por las células del sistema inmune, que mide la posible inmunotoxicidad de tratamiento continuo con anti-β2-M Ab. Se demuestra que el tratamiento con anti-β2-M Ab no afectó el número de células inmunes (CD8 + y células T CD4 + y células B) y el peso corporal de los ratones. el número de células T y B no se vieron afectados por el tratamiento anti-β2-M Ab en comparación con IgG o ratones parental (Figura 3D). Los pesos corporales también no se vieron afectadas cuando se administró anti-β2-M Ab continuamente cada tres días durante 11 semanas (Figura 3E). Estos estudios demuestran que el tratamiento anti-β2-M Ab no compromete el sistema inmune y el peso corporal de los ratones y que impide el desarrollo de tumores en modelos de ratón de próstata espontáneas de cáncer de próstata.
tratamiento de combinación con anti β2-M Ab y la irradiación reduce el crecimiento del cáncer de próstata en el hueso microambiente
el segundo sitio más frecuente de metástasis ósea del cáncer de próstata es el hueso. Actualmente no hay buenos tratamientos para el crecimiento del cáncer de próstata en el hueso. Por lo tanto, hemos probado la eficacia de anti-β2-M Ab y la irradiación sobre el crecimiento del cáncer de próstata en el hueso. Para probar esto, inyectamos andrógeno independiente células de cáncer de próstata C4-2 intra-tibially en ratones desnudos. Una semana después de la inoculación del tumor en el hueso, los ratones se les administró anti-ß2-M Ab (8 mg /kg) (n = 9 ratones) por vía intraperitoneal cada tres días durante 11 semanas o solución salina tamponada con fosfato (n = 9 ratones). antígeno específico de próstata (PSA) los niveles en el suero de los ratones y el peso corporal de los ratones se midieron dos veces por semana. A las 9 semanas, el grupo de tratamiento anti-β2-M Ab se le dio 4 irradiación Gy durante tres días consecutivos (12 Gy en total) (Figura S2). Antes de la radiación, los ratones se les dio una dosis de anti-β2-M Ab (8 mg /kg). Los ratones se mantuvieron hasta 12 semanas después de la inyección del tumor y se sacrificaron. La presencia de células tumorales se determinó mediante H & amp; E tinción. Anti-β2-M Ab impidió la formación de tumores en el 33% de las tibias inoculados con las células tumorales. Los ratones de control tenían 94% de incidencia de tumor y el anti-β2-M Ab más irradiación grupo tratado tenía la incidencia de tumores 67%. El tratamiento con el desarrollo de tumores anti-β2-M Ab también retrasado, que era evidente por una disminución en los niveles de PSA en estos ratones. La mayoría (7/9) de los ratones de control tenía PSA detectable a las 3 semanas después de la inyección intra-tibial, mientras que el grupo tratado con anti-β2-M Ab había retrasado la formación de tumores y los niveles de PSA menos detectables (3/9 a 3 semanas después de la inyección del tumor). A las 9 semanas después de la radiación, se produjo una disminución significativa en el nivel de PSA de los ratones tratados con anticuerpos en comparación con los ratones de control (p & lt; 0,006) (Figura 4A). El uso de inmunohistoquímica que demuestran disminuimos tinción β2-M en el grupo tratado irradiación anti-β2-M Ab + en comparación con el grupo control (Figura 4B). Por otra parte, el anti-β2-M Ab y grupo tratado con irradiación habían aumentado significativamente la tinción de hierro en el hueso (42%) en comparación con los ratones control (6%) (Figura 4B), lo que sugiere la sobrecarga de hierro en el grupo tratado con el anticuerpo. También nos fijamos en las vías descendentes dirigidos por el anti-β2-M Ab y encontramos que hay una disminución en los niveles de estos objetivos (p-CREB) en la tibia del anticuerpo y los ratones tratados con radiación en comparación con el control 2. Además, anti-β2-M Ab y grupo tratado radiación habían disminuido mitosis, indicado por el marcador mitótico, p-histona H3 (Figura 4B). El tratamiento prolongado con anti-β2-M Ab no era tóxico para los ratones como el peso corporal de los ratones era estable (Figura S4). Tomados en conjunto, estos estudios demuestran que un anti-β2-M Ab y el tratamiento combinado de irradiación pueden reducir significativamente tumorigenecity y retrasar y /o inhibir el crecimiento de células de cáncer de próstata en el hueso.
Inhibición de β2-M sensibiliza próstata Las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos
Dado que la inhibición de los resultados de β2-M en la sobrecarga de hierro, aumento de especies reactivas de oxígeno y disminuye el estrés en proteínas de respuesta
in vitro
, hemos probado si el tratamiento con anti-β2 -M Ab podría sensibilizar a las células de cáncer de próstata a los agentes quimioterapéuticos utilizados clínicamente. Utilizando C4-2B y C4-2B β2-M las células del cáncer de próstata desmontables (KD
β2-M) 2, hemos probado si las células desmontables β2-M eran más sensibles a taxotere, cisplatino y PS341. β2-M expresión fue baja en KD
células β2-M en comparación con las células Neo (control) (Figura 2D). La inhibición de la β2-M sensibilizado significativamente las células de cáncer de próstata a taxotere (0,3 mM), cisplatino (10 M) y PS341 (1 M) (Figura 5A). Anti-β2-M Ab sensibilizado células DU145 a cisplatino y doxorrubicina (Figura 5B) y las células PC-3 con el cisplatino (figura 5C). Utilizando el análisis de la independencia dicha se observó una interacción sinérgica en las células DU145 tratadas con anti-β2-M Ab y doxorrubicina y en células PC-3 tratados con anti-β2-M Ab y cisplatino.
Estos estudios demuestran que el anti -β2-M Ab es un agente prometedor para la terapia de combinación con los tratamientos usados comúnmente en el cáncer tales como la radiación y la quimioterapia. Desde la metástasis ósea del cáncer de próstata es difícil de tratar, la combinación de tratamientos con anti-β2-M Ab tal vez más eficaz en la reducción de la carga tumoral.
Discusión
El cáncer de próstata es la segunda causa principal de muerte entre las hombres en América del Norte. expresión β2-M elevada se asocia con la progresión del cáncer de próstata humano 22, el cáncer de mama 23, cáncer renal 24, cáncer de pulmón 25, cáncer de colon 26 y un número de tumores líquidos tales como mieloma múltiple, linfoma y leucemia 3. β2-M media la transición epitelial a mesenquimal, y la metástasis del cáncer a los huesos y otros tejidos blandos 4. Por lo tanto los niveles elevados de tejido β2-M indica mal pronóstico. Por lo tanto, es importante apuntar β2-M en pacientes con cáncer de próstata para evitar la metástasis. Previamente, nosotros y otros demostraron que el tratamiento con anti-β2-M Ab muerte de células cancerosas inducida en ambos tumores sólidos y líquidos 3,6,27. Dado que la inhibición de β2-M conduce a la disminución de la respuesta al estrés, la hipótesis de que un tratamiento de combinación de anti-β2-M Ab con radiación o quimioterapia puede mejorar la muerte de células de cáncer (radiosensibilización y quimiosensibilización). La inhibición de cualquiera de β2-M o HFE en células de cáncer de próstata conduce a su radiosensibilización (Figura 1B, la Figura S3A, S3B). Utilizando el modelo TRAMP tumor de cáncer de próstata espontáneo, también demuestran que el anti-β2-M solo Ab, previene o crecimiento retrasos tumor sin efectos secundarios tóxicos (Figura 3). El uso de un modelo de xenoinjerto de ratón subcutánea y un modelo de ratón ósea intra-tibial se demuestra que el tratamiento de combinación de anti-β2-M Ab y la radiación es más eficaz para el tratamiento de tumor en comparación con el anticuerpo o la radiación solamente enfoque de tratamiento (Figura 1C, Figura 4) . De este modo, se demuestra que el anti-β2-M Ab en combinación con irradiación inhibe significativamente el crecimiento del tumor
in vitro
y
in vivo
y en inmunodeficientes y en ratones inmunocompetentes. Los tratamientos actuales no se dirigen específicamente a las células cancerosas en el microambiente de la médula. Por lo tanto, proponemos que el anti-β2-M Ab es un agente prometedor en pacientes con metástasis óseas del cáncer de próstata agresivo y por lo tanto el tratamiento de combinación con el anticuerpo y la radiación reducirá la carga tumoral en estos pacientes.
β2-M ha sido previamente demostrado para activar varias vías en las células cancerosas tales como la proteína quinasa a 28, factor de crecimiento endotelial vascular 29, receptor de andrógenos 7, ácido graso sintasa 7 y balsa de lípidos vías de señalización 3. en este estudio hemos demostrado que β2-M regula el equilibrio celular de hierro y especies reactivas de oxígeno (figura 2, 4b). Además, β2-M también regula la expresión de las proteínas de respuesta al estrés, tales como HSP27 y HSP70 y enzimas de reparación del ADN NUDT1 y MPG (Figura 2). Por lo tanto, la disminución de las proteínas de respuesta al estrés hacen que las células cancerosas susceptibles a daño celular.