Extracto
La mesotelina, un antígeno de diferenciación presente en una serie de enfermedades malignas como el mesotelioma, ovario, pulmón y cáncer de páncreas, se ha estudiado como un marcador para el diagnóstico y un objetivo para la inmunoterapia. Nosotros, sin embargo, estábamos interesados en la evaluación de los efectos de los ataques directos contra mesotelina sobre la viabilidad de las células de cáncer como el primer paso hacia el desarrollo de una nueva estrategia terapéutica. Presentamos aquí que el silenciamiento de genes específicos para la mesotelina por métodos distintos (siRNA y microRNA) disminuyó la viabilidad de las células cancerosas de diferentes orígenes como el mesotelioma (H2373), el cáncer de ovario (SKOV3 y OVCAR-5) y el cáncer de páncreas (MiaPaca2 y Panc-1 ). Además, la invasividad de las células cancerosas también se redujo significativamente a partir de tal tratamiento. Luego investigó características de señalización pro-oncogénicas de las células sobre la mesotelina-silenciamiento que revelaron una disminución significativa de fosfato ERK1 y PI3K /AKT actividad. El mecanismo molecular de la reducción de la invasividad se conectó a la reducción de la expresión de β-catenina, un importante marcador de EMT (transición epitelio-mesenquimal). Ero1, una proteína implicada en la limpieza de las proteínas no plegadas y un miembro de la ER-Estrés (retículo endoplasmático estrés) vía también se redujo notablemente. Además, mesotelina silenciamiento causó un aumento significativo en la fracción de células cancerosas en la fase S. En la etapa siguiente, el tratamiento de células de cáncer de ovario (OVca429) con un lentivirus que expresan microRNA antimesotelina resultó en una pérdida significativa de viabilidad, invasividad, y alteraciones morfológicas. Por lo tanto, se propone la inhibición de mesotelina como un nuevo potencial estrategia para la orientación tumores malignos humanos
Visto:. Wang K, Bodempudi V, Z Liu, Borrego Díaz-E, F Yamoutpoor, Meyer A, et al. (2012) La inhibición de la mesotelina como una nueva estrategia para atacar a las células cancerosas. PLoS ONE 7 (4): e33214. doi: 10.1371 /journal.pone.0033214
Editor: Zhang Lin, de la Universidad de Pennsylvania School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Septiembre, 2011; Aceptado: 5 Febrero 2012; Publicado: April 2, 2012
Derechos de Autor © 2012 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación en El laboratorio de F. Farassati se apoya en "all-in Cure", "El mesotelioma Fundación de Investigación Aplicada (MARF)", "Marsha Instituto Rivkin para el cáncer ovárico (MRC)" y "asistente de vuelo Instituto de Investigación médica (FAMRI)". Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la mesotelina (MSLN), un antígeno de diferenciación membrana plasmática, se expresa en niveles significativamente más altos en varios cánceres humanos, incluyendo casi todos los mesoteliomas [1] y los adenocarcinomas de páncreas [2], [3] como pozos como de aproximadamente 70 % de los cánceres de ovario [4], [5] y 50% de los adenocarcinomas de pulmón [6], [7]. MSLN se detecta en más del 70% de los aspirados con aguja fina (FNA) de los adenocarcinomas de páncreas [2]. Otro estudio reciente mostró MSLN derrame pleural como un marcador útil para la detección de mesotelioma pleural maligno [8]. MSLN se expresa también en pequeñas cantidades en las células mesoteliales normales.
MSLN
gen codifica un polipéptido de 69 kDa que contiene la secuencia hidrófoba en el extremo carboxilo que se retira y se sustituye por el fosfatidilinositol. gen MSLN contiene 17 exones en el cromosoma 16p13.3 humana y el cDNA MSLN es 2138 pb de largo, con un marco de lectura abierto de 1884 pares de bases.
ratones mutantes con la inactivación de ambas copias del gen MSLN se generaron con el propósito de estudiar la función de esta proteína, aunque no se informó de anomalías detectables de este fenotipo [9] http://clincancerres.aacrjournals.org/cgi/content/full/10/12/3937 - B8#B8. Otro conjunto de estudios han introducido MSLN estar involucrado en la adhesión ya que las células NIH3T3 transfectadas con un vector de expresión MSLN eran más difíciles de eliminar de las placas de cultivo que las células no transfectadas [1]. La posibilidad de un papel para MSLN en la adhesión es apoyada por un estudio que muestra que MSLN se une a CA125 (MUC16), un miembro de la familia de las glicoproteínas de mucina, y que dicha interacción media la adhesión celular [4]. Basándose en estos resultados, los autores sugirieron que puede haber un papel importante para CA125 y MSLN en la propagación metastásica del cáncer [4]. Además, se sugirió la interacción con mesotelina MUC16 para facilitar la metástasis peritoneal [10].
En modelos como el cáncer de ovario, los análisis de correlación entre la expresión MSLN, la variabilidad patológica y los resultados clínicos indicaron que la expresión de alto MSLN se asoció positivamente con quimio-resistencia en pacientes con carcinoma epitelial de ovario y el tiempo de supervivencia de los pacientes corto [12]. MSLN y otro marcador HE4 se han estudiado recientemente por su valor como marcadores para la detección de carcinoma de ovario [5], [11]. De otros tumores malignos del gen homólogo a MSLN, es decir,
Erc
se encontró que era sobreexpresada en carcinoma renal de rata [12], [13]. En pacientes con cáncer gástrico, el grupo positivo MSLN tenía participación significativamente más nodal y significativamente más profunda invasión tumoral que en el grupo negativo MSLN [14]. Curiosamente, se encontró que la tasa de supervivencia a 5 años para ser mayor en el grupo positivo MSLN en este estudio.
Varios estudios han indicado importantes interacciones entre los involucrados en el desarrollo del fenotipo maligno y MSLN señalización. Por ejemplo, MSLN se encontró para inducir la expresión de metaloproteinasas de la matriz 7 (MMP-7) [15] o para mejorar los niveles de expresión de la interleucina 6 (IL-6) [16]. La expresión de la mesotelina también se demanda para conferir resistencia a la apoptosis en respuesta al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) [17]. El gen MSLN es diferencialmente regulada por miembros de la transducción de señales vía Wnt [18]. Además, en las células epiteliales mamarias de ratón C57MG, MSLN fue hasta reguladas por Wnt-1. Curiosamente, los tumores con la activación constitutiva de la vía de señalización Wnt, tales como los cánceres de ovario y de páncreas, tienen una expresión de alto MSLN. Se necesitan estudios adicionales para definir completamente la función MSLN, así como el papel de MSLN en la carcinogénesis. La distribución muy limitada de MSLN sobre los tejidos normales retrata MSLN un candidato adecuado para el tratamiento específico de tumores. Aunque las estrategias como el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra MSLN se han intentado antes [19], [20], [21], [22], [23], [24], el efecto de la inhibición directa de MSLN sobre la viabilidad de cáncer Las células que queda por investigar. Además de las ramificaciones de la traducción de tales investigaciones, la información obtenida es útil para evaluar el papel de MSLN en la biología del cáncer. En este trabajo se estudiaron los efectos de silenciamiento MSLN sobre la viabilidad, la invasividad celular y las vías de señalización en las células cancerosas derivadas de mesotelioma, de páncreas y cáncer de ovario. Además, silenciando MSLN por un lentivirus que expresan microRNA anti-mesotelina (miRNA) también fue encontrado para reducir significativamente la viabilidad y la invasividad de las células de cáncer de ovario. También hemos investigado el resultado de silenciar MSLN en las características de las células del cáncer y la progresión del ciclo celular de señalización con el fin de comprender mejor las vías involucradas en la función biológica de este antígeno celular.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y químicos
BxPC3, células H2373, OVCAR5 y SKOV3 (todos obtenidos de la colección americana de cultivo de tejidos, aparte de www.atcc.gov H2373 que se obtuvo de National Cancer Institute, NCI) se cultivaron en medio RPMI-1640 que fue suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Sigma, St Louis, MO). OVCAR3 se cultiva en medio RPMI-1640 con FBS al 10% con la adición de 2 mM L-glutamina y 10 mg /ml de insulina. NIH3T3, Panc1, Maipaca2 (de ATCC), y OVca429 células [25] se cultivaron en Modificación de Eagle Medium (DMEM) (Sigma) suplementado con 10% FBS de Dulbecco. Las células HUVEC se cultivaron en F-12K medio suplementado con 0,1 mg /ml de heparina, 0,05 mg /suplemento de crecimiento de células endoteliales ml, y 10% de FBS. células HT1080 fueron cultivadas en MEME suplementado con 10% FBS. Los medios anteriores se suplementaron con penicilina (100 UI /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) (Sigma). 293FT células se cultivaron en DMEM (glucosa alta) suplementado con FBS, MEM 0,1 mM de ácido 10% no esencial amino, 1 mM L-glutamina y piruvato de sodio 1 mM MEM. células HT1080, NIH3T3, y HUVEC se adquirieron de ATCC (Manassas, VA). 297FT células fueron adquiridos de Invitrogen (Carlsbad, CA).
siRNA anti-mesotelina se ordenó de Qiagen (Valencia, CA). Fue sintetizado en el formato de doble cadena con Alexa Fluor 488 (AF488) conjugado con el extremo 3 'de su cadena de sentido. El oligo siRNA se volvió a suspender en el tampón proporcionado a una concentración madre final de 20 mM.
ARNsi electroporación
10
7 a 5 × 10
7 células fueron re- en suspensión en 270 l de Opti-MEM y se mezcla con 30 l de 20 mM siRNA solución madre y electroporación (~240 V, un pulso de 20 milisegundos), de modo que la concentración final de ARNsi anti-mesotelina era 2 M. Las células más brillantes, es decir, las células con la mayor cantidad de ARNsi, se seleccionaron sobre la base de la presencia de Alexa Fluor 488 tag en el extremo 3 'de la molécula de siRNA utilizando FACS.
Ensayo de proliferación celular
ensayo de proliferación celular se realizó usando WST-1 kit de Millipore (Billerica, MA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, 2.000 células (según FACS) se sembraron en cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos en un volumen final de 100 l. A continuación se añadió 10 l /pocillo de reactivo WST-1 y la placa se incubó durante 1 hora en condiciones de cultivo estándar. Durante la incubación, las células viables convierten WST-1 reactivo en el tinte de formazán por la deshidrogenasa mitocondrial celular. Después de esta incubación, se midió la absorbancia a 440/600 nm.
invasión de la célula de ensayo
La placa de cámaras de invasión de Matrigel y cultivo de tejidos Falcon compañera se obtuvieron de BD Biosciences (San Jose, CA) . Para el control de siRNA experimentos y las células tratadas con siRNA anti-mesotelina se sembraron (30.000 células /pocillo) en placas de 24 pocillos y se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2. Cuarenta y ocho horas más tarde, las células se fijaron en metanol al 100% y se tiñeron en 0,05% de cristal violeta y se fotografiaron para contar visualmente el número de células invadidas. Para las células de experimentos relacionados con lentivirus fueron pre-tratados con lentivirus durante 3 días y después se introdujo en la cámara de Boyden ensayo de ~21 horas.
Western blot
Las células se lisaron a los 5, 24, y 48 horas después de la electroporación con 1 x tampón de lisis celular. Treinta microgramos de proteínas de cada muestra se cargó en 4-20% de gel de poliacrilamida SDS (Bio-Rad, CA). Las proteínas se transfirieron entonces a una membrana de nitrocelulosa. La membrana se bloqueó, se lava, y se incubaron con los diferentes anticuerpos primarios tales como mesotelina (Abcam, MA y LS Bio, WA) y β-actina (Cell Signaling Technology, MA), seguido por el anticuerpo secundario conjugado con HRP. Después de un lavado a fondo, la transferencia se expuso a ECL (GE Healthcare, NJ) y autorradiografía.
ciclo de la célula de ensayo
ensayo del ciclo celular se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, alrededor del 10
6 células se lavaron dos veces con solución tampón de CycleTEST PLUS (BD Biosciences, Cat. 340242). Las células se resuspendieron en 1 ml del mismo tampón. Para la tinción de las células, se añadieron 250 l de Solución A y Solución B 200 l y se incubaron durante 10 minutos a RT. Se añadió solución fría C (200 l) y se incubó a 4 ° C durante 10 minutos. Las células se filtraron a través de un colador de 35 micras de células y se analizaron mediante FACSort citómetro de flujo.
Construcción del vector de expresión de los genes miARN
hemos diseñado y sintetizado tres imita miARN dirigidas a la longitud completa del gen de mesotelina humana ( gen número de acceso: NM_005823.4). Cada uno diseñado miARN mímica era de 64 nucleótidos de longitud, incluyendo la secuencia de acompañamiento parcial, la horquilla miARN y miARN maduro (en cursiva /subrayado) derivado del gen diana de la siguiente manera: 1-TGCTG
ATAGCAGCAGGTCCAATGGGA
GTTTTGGCCACTGACTGACTCCCATT GCCTGCTGCTAT; 2-TGCTG
TTCATGTTCTGGAAAGCAAGG
GTTTTGGCCACTGACTGACCCTTGCT TCAGAACATGAA; y 3-TGCTG
TTTACTGAGCGCGAGTTCTCT
GTTTTGGCCACTGACTGACAGAGA ACTCGCTCAGTAAA.
Usando el kit de vector de expresión BLOCK-iT Pol II MIR RNAi (Invitrogen, CA), se recoció y se clonaron los oligonucleótidos que codifica la ingeniería pre-miARN en el sitio de clonación (ACGA y CAGG) de vectores pcDNA 6.2 GW /EmGFP-miR que está flanqueada a cada lado para permitir la clonación direccional o adecuado proceso de pre-miARN. El pre-miARN se insertó en el 3'-UTR de EmGFP gen impulsada por los promotores de la pol II. EmGFP permite el seguimiento de la expresión de los genes miARN, proporcionando una fuerte correlación entre EmGFP y la expresión de los genes miARN. Cada plásmido se secuenció para confirmar los oligonucleótidos de doble hebra de miARN insertados. Los plásmidos que expresan se sometieron a electroporación en células OVCAR5 o células SKOV3, y se analizaron por FACS para asegurar la expresión apropiada de los genes miARN en las células de cáncer de ovario.
Generación de partículas lentivirales expresando miRNA
El clon de entrada era generada por la combinación de pMSLNmiR3 con pDONR 221 constructo utilizando la enzima BP Clonase II. El casete de genes miARN se transfirió al pLenti6.3 /TO /vector V5-DEST que contiene sitios attR1-attR2 utilizando LR Clonase II para crear el vector lentiviral final de MSLNmiR3. Además, hemos creado un vector lentiviral que codifica revueltos miARN (control negativo) (TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACCTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCAC GCGCAGTACATTT) (Invitrogen) que no se dirige ni a cualquier gen humano conocido. La expresión de los genes miARN es impulsado por el promotor CMV. Las secuencias insertadas de MIR3 y revueltos miARN fueron confirmados por análisis de secuencias.
Producción, titulación y la infección de las partículas lentiviral
El MSLNmiR3 o del Control Negativo lentivirus se transfectadas con ViraPower mezcla de embalaje (Invitrogen, CA ) en 293FT células humanas utilizando Lipofectamine 2000 en Opti-MEM I medio (Invitrogen, CA) y cultivadas durante la noche. Las células se colocan bajo blasticidin selección (10 g /ml) durante 72 horas. Se recogió el sobrenadante y las partículas lentivirales se concentraron usando Lenti-X Concentrador (Clontech, CA). Stock lentiviral se diluyó en serie de diez veces para infectar las células HT1080. Cuarenta y ocho horas después de la infección, las células se evaluaron mediante FACS y la titulación se calculó utilizando la fórmula [/V FXC] xD, donde "F" es la frecuencia de células positivas para GFP; "C" es el número total de células en el pocillo en el momento de la transducción; "V" es el volumen de inóculo en ml; y "D" es la dilución lentivirus. Ovca429 células se infectaron con partículas de lentivirus en MOI~30 en presencia de polibreno (10 mg /ml) durante la noche. El ensayo de proliferación celular se llevó a cabo después de la infección en los puntos de tiempo indicados.
Citometría de flujo
Las células cultivadas se disociaron con tampón de disociación celular (Sigma-Aldrich, MO) y se lavaron dos veces en tampón MACS (PBS más EDTA y 0,5% de albúmina de suero bovino) (Miltenyi Biotec, CA). Un total de 2 × 10
5 células (100 l) se incubaron con el anticuerpo monoclonal mesotelina (concentración final de 1 mg /ml) (Cat#ab3362, Abcam, MA) en hielo durante 1 hora en la oscuridad. Después, las células se lavaron dos veces con tampón de MACS, se resuspendieron en 100 l de un anticuerpo secundario (dilución 1:200, APC conjugado IgG; BD Biosciences, NJ), y se incubaron en hielo durante 1 hora en la oscuridad. Las células se lavaron dos veces y se analizaron en el analizador LSRII (BD Biosciences, NJ) utilizando la versión 6.1 del software de la diva FACS. Células teñidas con el anticuerpo secundario solo se incluyeron para demostrar la especificidad del anticuerpo.
Resultados y Discusión
decidieron evaluar los efectos de silenciamiento MSLN mediante el uso de ARN corto de interferencia (siRNA). Mecánica, estos 19-21 oligómeros pueden unirse a una secuencia específica coincidente en sus moléculas de ARN mensajero (ARNm) de destino y los de la bandera para su destrucción por un complejo denominado ARN inducida por silenciar complejo (RISC). Para lograr esto, la secuencia de mRNA MSLN se analizó con software especializado (Qiagen, CA) y las secuencias de oligómeros de siRNA se detectaron. Una de estas secuencias (5 'CTGGACGTCCTAAAGCATAAA-3') fue seleccionado debido a su alto grado de especificidad frente MSLN. El oligómero anti-MSLN siRNA se sintetizó (en formato de doble cadena) y conjugado con Alexa Fluor 488 en el extremo 3 'de su cadena de sentido (Qiagen, CA). La Figura 1A muestra la secuencia de ARNm para MSLN humana y el sitio de unión para anti-MSLN siRNA.
(A) siRNA Anti-mesotelina fue diseñado para una posición de la secuencia media en mRNA mesotelina. (B) Una vez a electroporación con siRNA anti-mesotelina, los niveles de expresión de la mesotelina se redujo significativamente en H2373 células. ARNsi de control negativo no causaron dicha reducción. El panel inferior muestra los resultados de banda-densitometría comparación de la intensidad de la expresión de la mesotelina en la electroporación de células H2373 con siRNA. siRNA (C) Anti-mesotelina no afectó a los niveles de expresión de β-actina, una proteína de mantenimiento de la casa, como una evidencia de la especificidad de este siRNA anti-mesotelina por su diana. (D) la tasa de proliferación de las células H2373 es significativamente (p & lt; 0,05) la reducción a las 48 horas después de la electroporación a 40% de los valores para las células tratadas de control negativo. Un rebote a mayores tasas de proliferación se observa debido al despacho de ARNsi a partir de células en puntos de tiempo posteriores en armonía con nuestros estudios anteriores. paneles de texto destacado muestran la densidad de células en cada grupo del estudio a las 48 horas después de la electroporación. las células (E) NIH3T3 son vacío de mesotelina y su tasa de proliferación no se ve afectada por la exposición a siRNA anti-mesotelina (ratón). Paneles de llamada muestran la densidad de las células a las 48 hora después de la electroporación.
Con el fin de investigar los efectos de anti-MSLN siRNA sobre la expresión de MSLN, se utilizó la línea celular humana H2373 mesotelioma. Como se muestra en la figura 1B, una vez a electroporación con el anti-MSLN siRNA, la expresión de MSLN se redujo notablemente tan pronto como 24 a 48 horas después de la electroporación, en comparación con las células tratadas de control negativo. No se observaron cambios en la expresión de β-actina (un producto génico de mantenimiento de la casa) después de la exposición de las células a la lucha contra la MSLN siRNA (Figura 1C).
A continuación, decidimos probar la tasa de proliferación del cáncer células en tales condiciones. Como se ve en la figura 1D, una reducción significativa (p & lt; 0,005) en la proliferación de células del mesotelioma se observó tan pronto como 48 horas después de la electroporación. Es importante observar que la tasa de proliferación de las células tratadas con ARNsi de control en cada punto de tiempo se midió y luego reducido como 100%. La tasa de proliferación de las células tratados con anti-MSLN siRNA se calculó y se escala como una fracción de los valores de control. Los paneles de llamada representan la densidad celular de las poblaciones de prueba y de control tratados en los tiempos indicados después de la electroporación. Es interesante que la tasa de proliferación de las células tratadas con siRNA comenzó a aumentar en 72-96 horas después de la electroporación. Esto es debido a la naturaleza transitoria de la transfección por electroporación, que es el método utilizado en estos experimentos para introducir anti-MSLN siRNA a las células. En otras palabras, a medida que pasa el tiempo, la concentración de siRNA en las células tratadas disminuiría permitiendo un rebote de la proliferación. Hemos observado este fenómeno en nuestros otros estudios con silenciamiento génico específico [26], [27]. Una vez que el mismo procedimiento se aplicó a células NIH3T3 (void de MSLN), se observó cambios estadísticamente significativos en la viabilidad (el siRNA usadas en este experimento se puede unir a MSLN mRNA de ratón) (Figura 1E).
En siguiente paso, decidimos probar los efectos de silenciamiento MSLN en otras células que expresan MSLN incluyendo líneas celulares de cáncer de ovario y de páncreas y comparar estos efectos con nuestros datos sobre las células del mesotelioma. Los niveles de expresión de MSLN en un panel de células de cáncer de páncreas y de ovario se sometieron a pruebas de Western Blot, como se muestra en la figura 2A. MiaPaca2, BxPC3 y Panc1 (líneas celulares de cáncer de páncreas) y SKOV3 y OVCAR3 (líneas celulares de cáncer de ovario) mostraron niveles de expresión MSLN aumentado, mientras que las células HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana) y NIH3T3 se mantuvieron negativos para MSLN como se esperaba. La electroporación de todas las líneas celulares de cáncer mencionadas anteriormente dio como resultado una reducción significativa de su viabilidad (Figura 2B-2D, los resultados muestran para SKOV3, BxPC3 y MiaPaca2). Una vez más, se observó un repunte de la proliferación debido al despacho de ARNsi a partir de células de cáncer de páncreas y de ovario. El marco de tiempo para esta recuperación fue variable entre estas líneas celulares debido a su velocidad de eliminación relativa de siRNA.
proteínas (A) La mesotelina se detectó en las líneas celulares de cáncer de páncreas, Panc1, MiaPaca2 y BxPC3 y las células de cáncer de ovario SKOV3 y OVCAR3. Se utilizaron células NIH3T3 y Huvec que son vacío de mesotelina para demostrar la especificidad de anticuerpo mesotelina. las células (B) SKOV3 habían reducido la proliferación en los días 3 después de la electroporación con siRNA anti-mesotelina a alrededor de 50% de control negativo. paneles de texto destacado muestran la densidad de células en cada punto de tiempo. (C-D) Dos líneas celulares de cáncer de páncreas, BxPC3 y MiaPaCa, se ensayaron para determinar el resultado de silenciar a la mesotelina sobre su proliferación. En ambos casos se observó una pérdida significativa de la proliferación, sin embargo para BxPC3 el descenso se inicia en los puntos de tiempo posteriores, en comparación con las células MiaPaca. Por tanto las células, una vez más, un rebote a mayores tasas de proliferación se observa a más puntos de tiempo debido a la liquidación de siRNA a partir de células. paneles de texto destacado muestran la densidad de células en cada punto de tiempo.
Si bien todas las células de cáncer mostraron una pérdida significativa de viabilidad a la electroporación con anti-MSLN siRNA, las células sin expresión de MSLN como NIH3T3 no lo hizo presentar cambios significativos en sus tasas de proliferación vez a electroporación con anti-MSLN siRNA (focalización MSLN ratón). Por lo tanto, las células normales, con muy baja o ninguna expresión de MSLN no se verían afectadas por esta estrategia implica la especificidad de los resultados biológicos de MSLN de silenciamiento para células malignas. Por lo tanto la inhibición de la MSLN puede ser considerada como una estrategia potencial para dirigir los tumores como el mesotelioma, de ovario y de cáncer de páncreas en una manera específica de la célula. También se han reportado ensayos clínicos recientes que utilizan anticuerpos monoclonales contra MSLN ser bien tolerado en pacientes que confirma mínima en vivo efectos secundarios para MSLN estrategias de orientación [28], [29]. Esto es de especial importancia debido a los limitados niveles de expresión de la mesotelina en pleural, pericárdico, peritoneal y membranas [30], [31].
También estaban interesados en investigar el corolario de silenciar MSLN en la invasividad de Células cancerígenas. Metástasis como el resultado más devastador de tumores malignos juega un papel importante en la patogénesis del cáncer. Por lo tanto, es un paso lógico para estudiar el resultado de silenciar la mesotelina de la capacidad de las células cancerosas de invadir. Esta es también una preocupación importante teniendo en cuenta la naturaleza invasiva de los tumores malignos estudiados en este trabajo. Para tal fin se utilizó un modelo in vitro basado en el estudio de la capacidad de las células para invadir a través de una capa de matrigel como un modelo para la metástasis (ensayo de cámara de Boyden modificada). Se evaluó la capacidad de invasión de las células H2373, SKOV3 y BxPC3 una vez tratados con anti-MSLN y control de siRNA (Figura 3A-3C). En los tres casos se observó una reducción significativa de la capacidad de invasión. La invasividad reducida de todas las células cancerosas ensayadas es de relevancia clínica especial debido a la naturaleza de alta metastásico de estas enfermedades.
(A) Una vez probado en un ensayo de cámara de Boyden modificada, la invasividad de las células H2373 mesotelioma se reduce significativamente (p & lt; 0,05) en el silenciamiento de mesotelina. Se introdujeron células sometidas a electroporación a las cámaras de invasión para este experimento y se contaron las células invadidas y se fotografiaron después de 48 hrs. paneles de texto destacado representan la densidad de células invadidas teñidas con cristal violeta. las células (B-C) y SKOV3 BxPC3 tanto exhiben una disminución significativa (p & lt; 0,05) disminución de su capacidad de invasión en el silenciamiento mesotelina a valores de menos de 20% de control negativo. paneles de texto destacado representan la densidad de células invadidas teñidas con cristal violeta. (D) Silenciamiento de mesotelina induce una disminución significativa en la activación (fosforilación) de ERK1 (pero no ERK2) y fosfo-AKT. Además, la expresión de β-catenina, un conocido marcador de EMT, se redujo. Slug, otro factor de transcripción implicado en la EMT mostró un ligero aumento en estas condiciones. A partir de marcadores de estrés ER-, Ero-1 se redujo, mientras Bip estaba ligeramente elevada. (E) La progresión de ciclo celular se altera por la mesotelina silenciar principalmente por un aumento en el porcentaje de células en fase S. El porcentaje de células en cada fase se muestra en el panel superior y el flujo de datos representativa de citometría se ofrece en el panel inferior. G1, S y G2 selecciones están marcadas en cada gráfico que muestra un aumento en la población S fase de las células.
Con este fin, habíamos observado la pérdida de viabilidad y capacidad de invasión en una variedad de células de cáncer que son silenciamiento de MSLN. Con el fin de dilucidar un poco el mecanismo molecular subyacente tales cambios fenotípicos se evaluó el nivel de expresión /activación de algunas de las proteínas de señalización más importantes implicados en la transformación neoplásica en H2373 células (Figura 3D). vías efectoras aguas abajo del proto-oncogén Ras [32], [33], [34] tales como la activación de ERK1 /2 (extracelular quinasa relacionada señal), fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K /AKT) y p38 (p38 quinasa) se estudiaron para este propósito. Hemos observado que al MSLN silenciamiento, fosfato ERK1 y niveles de activación fosfo-AKT se redujeron profundamente mientras que los niveles de fosfo-p38 se mantuvo sin cambios (figura 3D). Con la participación de ERK en la proliferación y la metástasis [35], [36] y también la implicación de la vía /AKT PI3K en la protección contra la apoptosis [37], una disminución en la activación de estas vías de señalización puede explicar los efectos anti-proliferativos de silenciar MSLN . Sin embargo, p38 vía [38] (que participan en la señalización del estrés, la apoptosis y la senescencia) parecía permanecer inalterada tras la inhibición de MSLN. Desde p38-quinasa actúa como una vía inhibidora del crecimiento, es concebible que la capacidad de las células para someterse a la inhibición del crecimiento y /o apoptosis (dictado por vía de p38-quinasa) no se ve afectado por el silenciamiento MSLN
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El resultado de siRNA desmontables mediada por MSLN en la transición epitelio-mesenquimal (EMT) [39], [40], un programa biológico para la mejora de las capacidades metastásicas, también fue investigado por nuestro equipo. EMT es un paso importante en la realización biológica de un fenotipo metastásico de las células del cáncer [41]. El beta-catenina, una de Wnt aguas abajo moléculas y también un jugador importante en la señalización de la EMT, se constató que se redujo significativamente tras silenciar MSLN (figura 3D, el panel central). Se encontró Slug, otro represor transcripcional implicados en la EMT para ser aumentado algo en MSLN silenciar [42]. Con consideraciones al papel de Slug en la represión de E-cadherina [43] sería un paso lógico siguiente para evaluar los niveles de expresión de E-cadherina en el silenciamiento de mesotelina. Sin embargo, no se observó un cambio significativo en los niveles de E-cadherina (datos no mostrados). Por tanto, el aumento progresivo de los niveles de esta proteína puede no afectar positivamente las capacidades de la EMT de las células del cáncer una vez se silencia mesotelina.
También nos interesa investigar los niveles de expresión de marcadores implicados en la regulación de ER estrés. situaciones de estrés que interrumpen la función ER conducir a la acumulación de proteínas desplegadas en la sala de emergencias que se hace referencia como ER-estrés [44], [45]. Bajo las condiciones de un panel integrado de las vías de señalización se activa dando lugar a la respuesta de la proteína desplegada (UPR) [46], [47]. Después de la continuación de la respuesta UPR y si las proteínas desplegadas no se borran mecanismo será activado para inducir la muerte celular. Existencia de condiciones ER-estrés crónico es cada vez más evidente en las células del cáncer [47]. Por lo tanto, sería novedoso e interesante para ver si los cambios en la vía de ER-estrés podrían contribuir a los resultados de MSLN silenciamiento en las células cancerosas
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ER-proteínas que residen endoplásmico oxidoreductin-1 (Ero1), una de las moléculas implica en la vía de ER-estrés, la proteína disulfuro isomerasa oxida (PDI), que, a su vez, presenta bandas de disulfuro de proteínas ER [48]. La significativa disminución observada en Ero1 al silenciamiento MSLN podría dar lugar a una disminución de la capacidad de las células cancerosas para plegar proteínas y claros con miras a su eventual muerte (Figura 3D, panel inferior). Además, se observó un incremento en la expresión de Bip (Luminal precursor de la proteína de unión), una chaperona molecular para prevenir la agregación de proteínas [49]. Tal observación podría ser indicativa de niveles elevados de proteína despliegue sobre MSLN silenciamiento como los niveles de Bip generalmente se plantean en la célula para combatir la agregación de proteínas desplegadas [50]
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La última característica fenotípica estudiado en células silenciadas-MSLN era la progresión de ciclo celular. El principal cambio observado en estas células un aumento significativo (~ 50%) en la fracción de células en la fase S que retratan un bloqueo en la progresión de S a la fase G2 (Figura 3E).
El enfoque actual para el avance de la terapia de RNA inhibidor a los estudios preclínicos y clínicos se basa principalmente en el uso de lentivirus con el fin de expresar y entregar las moléculas de siRNA de una manera continua [51], [52], [53]. Para tal propósito, y para producir una herramienta de traducción para atacar a las células cancerosas sobre la base de la inhibición de la MSLN, decidimos desarrollar un lentivirus que expresan anti-MSLN miARN. Tal herramienta se puede utilizar en el futuro para evaluar aún más el valor pre-clínica de gen MSLN silenciamiento específico como un enfoque terapéutico.
Como moléculas de ácido ribonucleico (ARN corto) ($ ~ $ 22 nucleótidos) que se encuentran en todas las células eucariotas, miRNAs son reguladores post-transcripcional que se unen a secuencias complementarias en las transcripciones de ARNm diana. Esto resulta en la represión de traducción y de silenciamiento génico específico [54], [55]. Una vez que una serie de tres secuencias de genes miARN (miR1, MIR2 y MIR3, posiciones relativas se muestran en la figura 4A, panel superior) fueron seleccionados, cada uno de ellos se clonó en un plásmido de expresión (pcDNA6.2-GW /EmGFP, Invitrogen) y electroporación en células OVCAR5. Todos los plásmidos se sometieron a electroporación de manera eficiente en las células (en base a la expresión de GFP) (Figura 4A, panel central). Dos de los miRNAs diseñados (miR1 y MIR3) de cada tres silenciados MSLN eficientemente como fue revelado por el Western Blot (Figura 4A, panel inferior).