Extracto
Este estudio proporciona un enfoque único para activar pequeños RNAs de interferencia (siRNAs enjaulados) usando luz UV emitida indirecta por el infrarrojo cercano (NIR) -to-UV proceso de conversión ascendente para lograr patrones de interferencia gen altos espaciales y temporales. moléculas de siRNA contra el gen anti-apoptótica
survivina
se enjaulados por moléculas sensibles a la luz (4,5-dimetoxi-2-nitroacetofenona, DMNPE), que hacían de manera temporal no funcional. NIR-a-UV Nayf
4: Yb, las nanopartículas de conversión ascendente de Tm (UCPs) sirvió como vehículos de suministro y activadores de las moléculas de siRNA enjaulados en las células del cáncer de vejiga murino (línea celular MB49). luz UV a 355 nm con elevación de frecuencia se emite desde las UCP-NIR irradiadas, que también coincidió con la longitud de onda necesaria para desenjaular DMNPE. En consecuencia, la luz UV actúa como un interruptor para desenjaular la molécula de ARNsi entregado, haciendo así totalmente funcional para ejercer su efecto terapéutico en las células de cáncer de vejiga. Para lograr la máxima eficiencia interferencia de ARN, se optimizaron las condiciones tales como el tiempo después de la captación celular, tiempo de excitación, la concentración UCP y la potencia del láser. Los resultados mostraron que 200 mg /ml de concentración de nanopartículas combina con 12 h de incubación con las células MB49 y la excitación con láser NIR a 100 mW de potencia durante 15 min previstas la eficiencia interferencia ideal y la inducción más fuerte de la muerte celular MB49. Nuestros resultados demuestran el potencial de aplicación biológica de UCPs en el tratamiento de cáncer de vejiga por un nuevo enfoque terapéutico
Visto:. Guo H, Yan D, Wei Y, Han S, Qian H, Yang Y, et al. (2014) La inhibición de murino cáncer de vejiga Crecimiento Celular
in vitro fotos: por Photocontrollable siRNA Sobre la base de conversión ascendente fluorescente nanopartículas. PLoS ONE 9 (11): e112713. doi: 10.1371 /journal.pone.0112713
Editor: Yuan-Soon Ho, de la Universidad de Medicina de Taipei, Taiwán
Recibido: 8 Agosto, 2014; Aceptado: 14 Octubre 2014; Publicado: 25 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Guo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Esta investigación fue financiada en parte por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 31100688, Nº 21471043), International Science & amp ; Programa de Tecnología de Cooperación de China (Nº 2014DFA31890), la Fundación de Investigación Científica de los eruditos chinos de Ultramar Repatriados, Ministerio de Educación del Estado, y el Estado clave Laboratorio de Biología Veterinaria etiológico, Lanzhou Instituto de Investigación Veterinaria de la Academia China de Ciencias Agrícolas (SKLVEB2013KFKT010). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es el tumor maligno más común del tracto genitourinario en todo el mundo. Se ha dedicado considerable esfuerzo de investigación para desarrollar nuevas y eficaces terapias para el cáncer de vejiga. Además de los métodos de tratamiento convencionales, tales como la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia, la terapia génica se considera una alternativa efectiva para el tratamiento de tumors.Hence, RNA de interferencia (RNAi), un mecanismo de origen natural en las células para el silenciamiento de genes, muestra un gran potencial para el tratamiento de cáncer de vejiga [1], [2], [3]. RNAi implica la unión de pequeños ARN de interferencia (siRNA) al ARN complejo de silenciamiento inducido (RISC), que dirige entonces la destrucción del ARN mensajero (ARNm) que es complementaria a la cadena antisentido del siARN. Específico de la diana RNAi puede tumbar un gen con una alta especificidad y selectividad, proporcionando así una herramienta importante para la terapia oncológica personalizada
.
La maquinaria de RNAi se suele iniciarse tan pronto como entra en la célula siRNA, y los efectos sobre el gen silenciamiento se observa poco después. Sin embargo, la rápida e incontrolada RNAi limita la utilidad de la terapia génica. Por lo tanto, se han hecho esfuerzos para desarrollar espaciotemporalmente inducible RNAi. Un enfoque prometedor es "enjaulado" RNAi, que utiliza siRNA modificados con un grupo de protección fotolábiles que bloquea su actividad. Dado que la actividad de la siRNA "enjaulado" se basa en un disparador basada en la luz (como la luz UV), este enfoque permite la separación, el momento y el control sobre el grado de expresión génica, Descrita por primera vez por Kaplan en 1978, se ha utilizado este método en una variedad de aplicaciones [4]. En este estudio, se optó por 4,5-dimetoxi-2-nitroacetofenona (DMNPE), un 2-NB (2-nitrobencil) la clase de grupo de protección fotolábil, a siRNAs jaula de permeabilidad mínima y máxima eficiencia uncaging.
En los últimos años, las nanopartículas de conversión ascendente fluorescentes (UCPs) se han utilizado cada vez más como marcadores fluorescentes y para la entrega de genes. UCPs muestran una buena biocompatibilidad y no inmunogenicidad como un sistema de suministro de genes, y puede ser excretado de forma segura sin dejar residuos en el cuerpo. UCPs puede entregar eficazmente siRNA o DNA a las células diana o tejidos mientras que los protege de la degradación por las nucleasas presentes en el suero sanguíneo. Además, en comparación con los marcadores fluorescentes tradicionales, tales como colorantes orgánicos y puntos cuánticos, UCPs presentan baja toxicidad, una buena estabilidad química, alta intensidad de fluorescencia, de alta estabilidad, y un gran desplazamiento de Stokes cuando se utilizan como marcadores fluorescentes. UCP son excitadas por la luz del infrarrojo cercano (NIR), que se ve afectada mínimamente por la interferencia y la dispersión de la autofluorescencia de los tejidos y células, y por lo tanto ofrecen un fondo bajo y alta relación señal-ruido [5].
luz NIR puede penetrar en los tejidos más profundos que la luz visible, y como tal, las UCP puede ser utilizado como marcadores fluorescentes o en el tratamiento óptica de los tejidos profundos. Por lo tanto, UCPs presentan una buena perspectiva como marcadores fluorescentes y vectores de suministro de genes en la detección clínica, el tratamiento y el análisis de moléculas biológicas [6], [7], [8], [9]. NaYF4: Yb, Er /Tm exhibe la más alta eficiencia de la NIR a la fluorescencia visible /conversión ascendente y puede proporcionar longitudes de onda de luz ultravioleta a la luz infrarroja. Por lo tanto, NaYF4: Yb, Tm se utilizó como portador siRNA photocaged en este estudio
survivina
es uno de los inhibidores más fuertes de las proteínas implicadas en la apoptosis.. Teniendo en cuenta la gran diferencia en su expresión entre los tejidos normales y malignos y su papel causal en la progresión del cáncer, la survivina se ha estudiado como un objetivo para la terapia anti-cáncer y como un marcador de tumor [10], [11], [12], [ ,,,0],13]. Aquí, survivin fue elegido como el gen diana con el fin de investigar la eficacia de la terapia génica basada en RNAi en el tratamiento de cáncer de vejiga. Específicamente, survivin siRNA enjaulado con DMNPE se combinó con UCPs como vehículo. La activación de siRNA se logró mediante la irradiación con 980 nm NIR láser y la inhibición del crecimiento celular del cáncer de vejiga se evaluó. Nuestros resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre el uso de la UCP en la terapia génica.
Materiales y Métodos
1.
Celular
células MB49-PSA que fueron proporcionados por el Dr. Ratha Mahendran de la Facultad de Medicina (Universidad Nacional de Singapur, Singapur) [7], [9], se cultivaron a 37 ° C bajo un 5% de CO
2 atmósfera en medio de Eagle modificado (MEM, Gibco) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco) que contiene 100 unidades /ml de penicilina G sódica (BBI) y 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina (BBI).
2 . grupo amino-modificado UCP UCP y /siRNA-DMNPE formación del complejo
Nayf
4: Yb, nanocristales de Tm y monodispersa recubierto de sílice Nayf
4: Yb, Tm (NaYF4: Yb, Tm @ sílice, UCPs) se sintetizaron y caracterizaron siguiendo el método descrito por Guo et al. (2010) [7] y Qian et al. (2009) [9]. El UCPs se modificaron usando un grupo amino siguiendo el método descrito por Guo et al. (2011). DMNPE (Invitrogen) se utilizó para siRNAs jaula siguiendo el protocolo del fabricante, y se hicieron complejos UCPs /siRNA-DMNPE como se ha descrito previamente por Guo et al. (2011) [14]. La relación de UCPs de siRNA se determinó midiendo el potencial zeta usando Nano-ZS ZEN 3600 (Malvern Instruments Ltd, Reino Unido) a 25 ° C. El espectro de absorción UV se obtuvieron mediante espectrofotómetro BioMate 3S UV-visible (Thermo Scientific) a 25 ° C.
3. La captación celular de UCPs a diferentes puntos de tiempo
MB49 células se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 24 h. Las células se trataron inmediatamente con nanopartículas a 100 mg /ml y se recogieron a diferentes puntos de tiempo (15 min, 1 h, 6 h, y 24 h). Las células cargadas con nanopartículas se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 10 min a temperatura ambiente (RT) y después se lavaron dos veces con 1 x PBS durante 5 min. Los núcleos se contratiñeron con 0,1 mg /ml DAPI (Sigma) durante 5 min a RT seguido de dos lavados con 1 x PBS durante 5 min cada uno. Las nanopartículas cargadas en las células fijadas fueron entonces visualizadas bajo un microscopio de barrido confocal láser (Nikon C1 Confocal) equipado con una fuente de excitación de láser de onda continua nm 980.
4. La cuantificación de la captación de UCPs
Las células se sembraron en 75 cm
2 frascos en 1 × 10
6 /ml después de cultivar durante 24 h. Las células se trataron inmediatamente con nanopartículas a 100 mg /ml y se recogieron en diferentes momentos apuntan a 0, 15 min, 1 h, 3 h, 6 h, 24 h, 48 h, y 72 h. captación intracelular de las nanopartículas se evaluó midiendo la cantidad total de las nanopartículas en células por medio de plasma de acoplamiento inductivo Espectrómetro de emisión óptica (ICP-AES).
5. La transfección de células cultivadas
p>
2 atmósfera. Al final del periodo de incubación, las células se excitaron con o sin láser de 980 nm usando un 980 nm VA-II diodo bombeado fuente de láser de estado sólido (DPSS).
6.
in vitro
pruebas de viabilidad /citotoxicidad
La viabilidad celular se evaluó a través de Titulación Celular 96 un ensayo de disolución acuosa (Promega, Madison, WI). células MB49 fueron sembradas en una placa de 96 pocillos a una densidad de 5 x 10
3 células por pocillo. Después de un día de cultivo, se añadió complejo UCP /siRNA-DMNPE a los pocillos. Las células se incubaron por diferentes puntos de tiempo, como se indica a continuación, excitados con láser 980 nm o no. Después de la incubación durante 24 h adicionales a 37 ° C, 20 l de reactivo se añadió directamente a los pocillos y se incubaron durante otras 24 h. Cantidad del producto de formazán formado como se indica por 490 nm de absorbancia es directamente proporcional al número de células vivas en el cultivo. Cada experimento se realizó por triplicado. La viabilidad celular (%) con respecto a los pocillos de control que contienen medio de cultivo celular sin nanocristales se calculó como [
Un
]
expt /[
Un
]
de control x 100%, donde [
Un
]
expt es la absorbancia de la muestra de ensayo y [I]
control es la absorbancia de la muestra de control.
7. Detección de la expresión de survivina mediante análisis de inmunotransferencia
MB49 células fueron sembradas en una placa de seis pocillos y se cultivaron hasta la confluencia fue de 80% a 90% (que se produjo después de aproximadamente 24 h). En ese momento, se añadió complejo UCPs /siRNA-DMNPE y se incubaron las células durante diferentes puntos de tiempo como se indica. Entonces, las células se irradiaron con o sin 980 nm láser y se incubaron a 37 ° C durante otras 24 horas. Se recogieron las células utilizando el reactivo de lisis de células frío (Pierce) según el protocolo del fabricante. Las proteínas en los lisados celulares se separaron mediante SDS-PAGE en 12% geles de acrilamida utilizando un sistema de tampón discontinuo. Después se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Pierce) en tampón de transferencia (20 mM Tris-HCl, glicina 190 mM, 20% de metanol, pH 8,3) utilizando un sistema de transferencia Mini Trans-blot (Bio-Rad) a 100 V durante 1 marido. Las membranas se bloquearon con leche en polvo 5% no grasa en solución salina tamponada con Tris que contiene 0,05% de Tween-20 (TBST) a TA durante 1 h y después se incubaron con anticuerpo anti-survivin (Santa Cruz, 1:200 dilución) a TA durante 1 h. Después de tres lavados en TBST, las membranas se incubaron con anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (Sigma, 1:8000 dilución) a temperatura ambiente durante otra 1 h. Se realizaron tres lavados adicionales en TBST antes de la membrana de NC se visualizaron con una solución de ECL (Pierce).
8. El análisis estadístico
Las películas fueron escaneados como escala de grises imágenes de 8 bits y la densidad de las bandas se determinaron mediante los datos de ImageJ software.The cantidad relativa de western blot se presentan y el análisis estadístico de la varianza entre los grupos fue realizado por el software SPSS 19.0. Diferencia significativa de todas las pruebas estadísticas se fijó en 0,05 (p & lt; 0,05)
Resultados
En este estudio, Nayf
. 4: 25% Yb, 0,3% Tm-a-NIR UV UCPs se utilizó como portador de siRNAs enjaulados, que se activa mediante NIR-a-UV con elevación de frecuencia de luz (Fig. 1). Como se muestra en la Figura 2B, las nanopartículas sintetizadas poseían una estructura de núcleo-corteza compuesta por una Nayf
4 núcleo nanocristal y una concha de sílice. Para fijar los siRNAs enjaulados, las UCPs fueron modificados con un grupo amino que hacen que su superficie es carga positiva. Las nanopartículas modificadas mostradas en la Figura 2C son más dispersos que los de la Figura 2B, que puede ser debido a la repulsión electrostática causada por cargas positivas en la superficie de la nanopartícula. En general, se encontró que las nanopartículas para ser bien dispersada en agua, formando una solución coloidal clara y que muestran fuerte fluorescencia conversión ascendente (Fig. 2A) guía empresas
Los espectros de fluorescencia de nanopartículas modificadas (A).; la morfología de las nanopartículas no modificadas (B) y nanopartículas con funcionalidad amino (C) observadas por TEM.
La formación de complejos de las UCPs amino-modificado con siRNA se examinó midiendo el potencial nanozeta. UCP y siRNA se mezclaron durante 1 hora a 4 ° C. Los complejos /siRNA UCPs se lavaron varias veces con PBS y después se resuspendieron en tampón PBS. Medición de potencial zeta demostró que la carga positiva en UCPs se neutralizó gradualmente por la carga negativa de siRNA con aumento de la nanopartícula /relación de siRNA (Fig. 3A). Sin embargo, las superficies de las células están cargadas negativamente en condiciones neutras (pH 7,0). Por lo tanto, para maximizar la capacidad de la UCP para entregar la mayor cantidad de siRNA como sea posible y para obtener una óptima eficiencia de la captación celular del complejo /ARNip UCP, se utilizó una relación de 10:02 nanoparticle:siRNA (mol:mol) en todo el
in vitro
experimentos. Con el fin de evaluar la eficacia de siRNA uncaging por UCPs, se midió su absorbancia. Como se muestra en la Figura 3B, enjaulado-DMNPE siRNA reveló una cumbre característica a 355 nm como se DMNPE y, como cumbre a 260 nm, como siRNA, lo que demuestra la unión de grupos DMNPE a las moléculas de siRNA. Para las moléculas de siRNA DMNPE-enjaulado, sin irradiación con un láser de 980 nm NIR, mostró un espectro confuso. Se estima que hay una interferencia entre la emisión de la UCP y la de DMNPE. Sin embargo, las UCP /siRNA-DMNPE, una caída significativa en el pico de 355 nm se observó tras la irradiación con NIR light.Hence, es creíble que UCNs-NIR a los rayos UV pueden desenjaular moléculas de siRNA bajo excitación de la luz NIR.
(A) de formación de imágenes confocal de fluorescencia emitida por la conversión ascendente MB49 células cargadas con 100 mg /ml de las nanopartículas. Excitación con 980 nm láser NIR fluorescencia visible verde y roja emitida. Los núcleos se counterstained con DAPI (fluorescencia azul). Todas las imágenes fueron obtenidas bajo los mismos parámetros, lo que permitió el cálculo de la intensidad de fluorescencia relativa de las células cargadas diferencialmente. (B) la captación intracelular de nanopartículas en las células cargadas por ICP-AES para el contenido de itrio.
Para determinar el nivel de captación celular de las UCP, UCP /o siRNA UCP se cargaron pasivamente en las células MB49 incubando con 100 mg nanopartículas /mL para diferentes duraciones. Como se muestra en la Figura 4A, se utilizaron dos filtros para capturar las emisiones de fluorescencia verde y azul. Los núcleos se contratiñeron con DAPI para demostrar que prácticamente todas las células se cargaron. Se observó un aumento progresivo de la fluorescencia emitida por las células de conversión ascendente de nanopartículas cargadas con el tiempo. Sin embargo, la intensidad de fluorescencia de complejo /siRNA UCPs en las células MB49 era más fuerte que la de UCPs sola después de 6 h de incubación. Esto indicó que las células MB49 habían tomado complejos UCPs /siRNA con más fuerza que UCPs con el aumento del tiempo, que puede ser debido a la carga superficial de las nanopartículas. Además, se midió la captación intracelular de nanopartículas en células cargadas por ICP-AES para la concentración de itrio y observó una tendencia similar de aumento en la absorción de nanopartículas en las células a través del tiempo (Fig. 4B). Sin embargo, la cantidad de UCP en las células alcanzó el pico y luego se mantuvo el equilibrio.
(A) El potencial zeta del complejo /siRNA-DMNPE UCP en mol /mol proporciones de 10:01, 10:02, 10 :3, 10:04, y 10:05; (B) Espectrofotometría de Absorción de siRNA, siRNA-DMNPE enjaulado sin irradiación, y la UCP /siRNA-DMNPE activa con o sin irradiación NIR.
Para determinar las condiciones óptimas para siRNA de interferencia después de la excitación con láser NIR , los experimentos se establecieron con diferentes condiciones de los puntos de tiempo después de la transfección, los tiempos de excitación, la concentración de complejos, y la potencia del láser. Como se muestra en la Figura 5, la eficiencia de la interferencia aumenta con la duración de la incubación de las nanopartículas con las células. La viabilidad celular se redujo significativamente en el tratamiento /siRNA-DMNPE UCP después de la excitación con NIR ligh. Sin embargo, casi no había cambio en la viabilidad celular sin NIR de excitación (Fig. 5A) .Similarly, a las 12 h después del tratamiento con o sin NIR de excitación, el nivel de expresión de la proteína suvivin disminuyó significativamente y casi se mantuvo en el mismo nivel en 24 h , lo que sugiere aumento de la eficiencia de interferencia (Fig. 5B) .Este puede ser debido al aumento en la captación celular de las nanopartículas con el tiempo, y es consistente con los resultados mostrados en la Figura 4. Como se muestra en la Figura 6, la eficiencia de la interferencia aumentó con el tiempo de la excitación. En particular, la expresión de survivina disminuyó significativamente cuando las células se excitan por la luz NIR durante más de 15 minutos. La Figura 7 muestra que la eficiencia de interferencia aumenta con el aumento en la concentración de las nanopartículas, y por lo tanto la eficiencia de interferencia también aumentó con la cantidad de siRNA contra survivina. Para determinar la influencia de la potencia del láser en la eficiencia de interferencia, las células se incubaron con UCPs o UCPs /siRNA-DMNPE, que es diferente de los utilizados en el experimento anterior. Como se muestra en la Figura 8, la eficiencia de la interferencia también aumentó con el aumento de la potencia del láser, en particular a 500 mW. Sin embargo, la expresión de survivina también disminuyó en el grupo de control UCP a 500 mW, lo que sugiere que las UCP puede inducir daño celular una vez excitado por la luz NIR a alta potencia. Por lo tanto, sobre la base de los resultados anteriores, las condiciones óptimas (12 h de incubación, 15 min de excitación, 200 mg /ml de concentración de nanopartículas, y 100 mW de potencia del láser) se utilizaron para verificar la eficiencia de interferencia máxima.
UCPs /siRNA-DMNPE se añadió a las células MB49 en concentración UCPs de 100 mg /ml. Las células se excitan mediante luz láser NIR (100 mW) durante 15 min a diferentes puntos de tiempo. Las células se recogieron a las 24 h después del tratamiento con luz. eficiencia interferencia RNAi se determinó por inmunotransferencia (A) y el ensayo de MTT (B). El experimento se repitió tres veces con resultados similares y se muestra el resultado de un experimento representativo. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las muestras con un tratamiento diferente en el mismo punto de tiempo. (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01).
UCP /siRNA-DMNPE se añadió a las células a una concentración MB49 UCPs de 100 mg /ml. Las células se excitan mediante luz láser NIR (100 mW) con diferentes momentos de excitación. Las células se recogieron a las 24 h después del tratamiento con luz. eficiencia de RNAi se determinó por inmunotransferencia (A) y el ensayo de MTT (B). El experimento se repitió tres veces con resultados similares y se muestra el resultado de un experimento representativo. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las muestras con tiempos de excitación similares (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01)
Diferentes concentraciones de UCPs /siRNA-DMNPE se añadieron a las células MB49 para 12 h.. Las células se excitan por la luz láser NIR (100 MW) durante 15 minutos. Las células se recogieron a las 24 h después del tratamiento con luz. eficiencia de RNAi se determinó por inmunotransferencia (A) y el ensayo de MTT (B). El experimento se repitió tres veces con resultados similares y se muestra el resultado de un experimento representativo. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las muestras con concentración similar (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01).
UCP /siRNA-DMNPE se añadió a las células a una concentración MB49 UCPs de 100 mg /ml . Las células se excitan mediante luz láser NIR con diferente poder durante 15 min. Las células se recogieron a las 24 h después del tratamiento con luz. eficiencia de RNAi se determinó por inmunotransferencia (A) y el ensayo de MTT (B). El experimento se repitió tres veces con resultados similares y se muestra el resultado de un experimento representativo. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las muestras con láser de potencia similar (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01).
Para confirmar si todas las condiciones son óptimas, el experimento de interferencia siRNA se realizó a través UCP y complejo /siRNA-DMNPE UCP. Como se muestra en la Figura 9, casi no hay disminución de la proteína survivina se encontró en el grupo de control en blanco después de la excitación con o sin NIR light.Howeve, la eficiencia de la interferencia de UCPs /siRNA-DMNPE fue alta después de la excitación con luz NIR. Además, el UCPs también afectó a la expresión de survivina en cierta medida, lo que puede ser debido a varios factores relacionados con los láseres y nanopartículas
.
UCPs /siRNA-DMNPE se añadió a las células MB49 en concentración UCPs de 100 g /l. Las células fueron excitados usando luz láser NIR (100 mW) durante 15 min a 12 h después de la incubación. Las células se recogieron a las 24 h después del tratamiento con luz. eficiencia de RNAi se determinó por inmunotransferencia (A). se muestran los niveles de proteína survivina en relación con los de actina con o sin la excitación inducida por NIR. El experimento se repitió tres veces con resultados similares y se muestra el resultado de un experimento representativo. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las muestras indicadas (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01) guía empresas
Discusión
La regulación de genes es importante en los sistemas vivos porque los niveles de expresión de genes desempeñan importantes. papeles en las funciones de genes. Los métodos para controlar la expresión génica (arriba-abajo o regulación) revolucionado el campo de la biología del desarrollo y la terapia génica. El reciente desarrollo de la expresión génica photocontrollable representa una gran promesa para un mayor control espacio-temporal sobre la modulación de la expresión génica. En esta técnica, activadores de la transcripción /plásmido para la expresión de genes o siRNAs para RNAi son enjaulados con moléculas sensibles a la luz que las hacen temporalmente no funcional. Este proceso, conocido como photocaging, se puede hacer en una variedad de maneras, el más común de los cuales está modificando seleccione pares de bases o los enlaces químicos en la molécula de introducción en jaula. Tras la irradiación con luz UV, la modificación se destruye, por lo tanto re-activación de los ácidos nucleicos para recuperar su función [15], [16], [17]. De esta manera, el control espacial y temporal muy alta sobre los patrones de expresión de genes se puede lograr. Sin embargo, la mayoría de los sistemas actuales son fotoactivos sólo es adecuado para
in vitro sobre las aplicaciones debido a la luz ultravioleta, que es muy perjudicial, es necesario que el proceso de uncaging. luz UV también muestra poca profundidad de penetración en el tejido, lo que es inaceptable para
in vivo
y uso clínico. Además, aunque el uso de siRNA para la RNAi tiene un gran potencial para la terapia, siRNA es fácilmente degradado por RNasa en el suero sanguíneo y, por tanto, son inadecuados para
in vivo
uso. nucleótidos siRNA son relativamente pequeñas y cortas, incluso después de la modificación química para mejorar la estabilidad siRNA. Estos nucleótidos pueden ser excretados a través del tracto urinario después de absorbancia en la sangre. siRNA también tiene que superar las barreras endoteliales para llegar a las células diana en diferentes organismos. Por lo tanto, el desarrollo de un sistema para la entrega eficiente y seguro de siRNA a las células es muy importante. Hasta la fecha, los sistemas de entrega de siRNA han incluido los sistemas de entrega nonvirus- y basados en virus; el primero incluye liposomas, nanopartículas, polímeros catiónicos, micelas y otros sistemas basados en estas formas. Dado que los sistemas de suministro basados en virus exhiben algunos efectos secundarios, incluyendo la inmunogenicidad potencial y la tumorigenicidad en la terapia génica, que no son adecuados para la entrega de siRNA. Por lo tanto, en la actualidad, se están estudiando sistemas de entrega basados en nonvirus de siRNA. En este estudio, Nayf
4: 25% Yb, UCP 0,3% Tm-NIR-a UV fueron utilizados como portadores de siRNA enjaulado. luz NIR, que fue utilizado para excitar las UCP, puede penetrar el tejido biológico más de luz visible o ultravioleta, lo que permite el uso de las UCP como vehículos en los tejidos profundos
grupos de protección fotolábiles se pueden dividir en dos tipos:. el grupo jaulas inespecífico implica introducir en la jaula aleatoria de la cadena principal de fosfato siRNA [18], mientras que el otro grupo consiste en el bloqueo específico de la 5'-fosfato de siRNAs [19]. Los grupos no específicos son más estables que los grupos específicos. Además, los grupos no específicos son fáciles de sintetizar por métodos químicos o bioquímicos, reduciendo así el costo de producción de siRNA enjaulado. En este estudio, los siRNA se enjaulado usando DMNPE. DMNPE pertenece al grupo de las jaulas 2-NB y sus derivados son las moléculas de introducción en jaulas más ampliamente utilizados y bien caracterizados [20]. El espectro NIR-a-UV UCP muestra un pico de emisión a 350 nm, lo que coincide bien con la longitud de onda necesaria para desenjaular DMNPE. Además, la luz NIR solamente se absorbe débilmente por los tejidos biológicos, lo que garantiza la máxima luz NIR absorbancia de las UCP y aumenta la sensibilidad del método.
Para comprobar el punto de tiempo óptimo de excitación NIR en las células, la captación celular de la UCP fue detectado por microscopía de fluorescencia e ICP-AES. La cantidad de UCP en las células inicialmente aumentó con el tiempo, pero disminuyó después de 24 h después de la inoculación. Esto indica que la primera etapa de incubación con UCPs es crítica. Teniendo en cuenta la viabilidad celular, se seleccionaron 12 horas después de la incubación de las UCP para la excitación inducida por NIR. Los resultados de nuestros experimentos posteriores confirmaron que este punto de tiempo es ideal para lograr una alta interferencia de ARN. Aunque la luz NIR es menos citotóxico que la luz UV, el uso de la energía láser de alta y el tiempo de excitación tiempo puede inducir citotoxicidad significativa y una menor eficiencia de RNAi. Por lo tanto, sólo se utilizaron 15 minutos de tiempo de excitación y de la potencia del láser se fijó a 100 mW. Además, dado que UCPs inducir daño a las células a altas concentraciones, la concentración de UCPs se fijó en 200 g /ml. La alta eficiencia de RNAi observada en el estudio validó la idoneidad de estos parámetros para nuestros experimentos.
Conclusiones
En conclusión, este estudio demuestra que las RIN-a-UV UCPs pueden servir como vehículos de suministro y activadores de ácidos nucleicos enjaulado. La irradiación de la UCP en las células por la luz ultravioleta emitida por convertida por elevación NIR llevó a uncaging de las moléculas cargadas, para que sean totalmente funcionales en las células huésped. Además de exhibir buena penetración de la luz en los tejidos para la fotoactivación en profundidad, la excitación inducida por la luz NIR necesaria para el proceso de conversión ascendente-NIR a los rayos UV causó daño solar mínima de muestras biológicas. Las propiedades de fluorescencia intrínseca de estas nanopartículas activadas emisión que llevó a la liberación de siRNA enjaulado y la facilitación de la interferencia de genes. Por lo tanto, las UCP puede proporcionar una plataforma para aplicaciones que implican el control remoto de RNAi y la terapia génica del cáncer. Por otra parte, nuestros resultados demuestran la utilidad de conversión ascendente multicolor luminiscencia UCP como una herramienta versátil y potente para aplicaciones avanzadas en imágenes, bio-detección y la terapia génica.