Extracto
Fangchinoline es un alcaloide aislado de Radix bisbenzylisoquinoline
Stephaniae tetrandrae
S. Moore. Fangchinoline y su análogo estructura, tetrandrine, exhibieron afinidad de unión directa con el proteasoma subunidad β1 recombinante humana y también inhiben su actividad
in vitro
. En la próstata cultivadas PC-3 células y las células LNCaP, podría fangchinoline dosis-dependiente inhibir la proliferación celular y la actividad caspasa-como del proteasoma celular que fue mediado por proteasoma subunidad β1. El efecto inhibidor de fangchinoline sobre la actividad de la caspasa-como de proteasoma también se observó en purificada proteasoma 20S de eritrocitos humanos. En células PC-3, fangchinoline inducida por la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1 y la apoptosis. El tratamiento de la PC-3 tumor ratones lampiños con fangchinoline inhibió el crecimiento del tumor, la apoptosis inducida y disminución también causado en las actividades del proteasoma en xenoinjertos tumorales. la acumulación dependiente de la dosis y dependiente del tiempo de proteínas ubiquitinated y importantes sustratos del proteasoma, tales como p27, Bax y I? B-α se observó en las células tratadas con fangchinoline. La sobreexpresión de la proteasoma β1 subunidad por el plásmido de transfección aumento de la sensibilidad de las células a la citotoxicidad de fangchinoline mientras desmontables de proteasoma β1 subunidad mejorado citotoxicidad de fangchinoline en células PC-3. Los resultados del presente estudio sugieren que la inhibición del proteosoma estuvo implicado en los efectos anticancerígenos de fangchinoline. Fangchinoline y sus análogos estructura podrían ser nuevos inhibidores del proteasoma naturales dirigidas a la subunidad β1
Visto:. Li D, Lu Y, Sun P, Feng L-X, Liu M, L, Hu-H, et al. (2015) La inhibición de proteasoma subunidad β1 podría contribuir a los efectos anticancerígenos de Fangchinoline en células de cáncer de próstata humano. PLoS ONE 10 (10): e0141681. doi: 10.1371 /journal.pone.0141681
Editor: Chih-Pin Chuu, Institutos de Investigación Nacional de Salud, TAIWAN
Recibido: 20 Marzo, 2015; Aceptado: 11 Octubre 2015; Publicado: 29 de octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por Shanghai Ciencia & amp; Programa de Apoyo a la Tecnología (13431900401), la Fundación Nacional de Ciencia Natural de China, (81373964), Shanghai Ciencia & amp; programa de tecnología de acción para la innovación (15140904800), la National Science & amp; Proyecto Principal de Tecnología de China (2014ZX09301-306-03), y el Consejo Nacional de Ciencia Duodécimo Cinco Años & amp; Programa de Apoyo a la Tecnología (2012BAI29B06). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Nanjing Tianyi Bioscience Co. Ltd, proporcionó apoyo en forma de salarios de los autores YL, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Las funciones específicas de estos autores se articulan en la sección 'autor' contribuciones
Conflicto de intereses:. Yu Lu es empleado de Nanjing Tianyi Bioscience Co. Ltd. No hay patentes, productos en desarrollo, o los productos comercializados a declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
proteasoma se ha convertido en un importante y eficaz objetivo para la terapia contra el cáncer [1]. En nuestra proyección de los inhibidores del proteasoma naturales, fangchinoline y tetrandrine, dos alcaloides bisbenzylisoquinoline aislado de raíz seca de
Stephaniae tetrandrine
S. Moore (familia, Menispermaceae), conocido como Fangji en China, se encontró que tenían una afinidad de unión directa con proteasoma subunidad β1 recombinante humana y también inhibe su actividad
in vitro
. Fangji es una medicina tradicional china (MTC), que había sido utilizada en la clínica como analgésico, antirreumático, fármaco antihipertensivo y durante mucho tiempo en China [2, 3]. actividades reportadas de Fangji incluyeron los efectos anti-cáncer [2, 4], efectos anti-inflamatorios [5], efectos cardiovasculares [6, 7], y etc. Los principales componentes activos de Fangji se han encontrado para ser fangchinoline y tetrandrine [2 ]. Las estructuras químicas de fangchinoline y tetrandrina se muestran en la figura 1A y la figura 1B, respectivamente. tetrandrine purificada había sido admitido por China Food and Drug Administration para ser utilizado en clínica para el tratamiento de enfermedades inflamatorias tales como la silicosis [8] y también fue utilizado en el tratamiento del cáncer [9]. Por lo que sabemos, ni a ningún compuesto purificado aislado de Fangji ni extracto crudo de Fangji se había informado antes de que tienen efectos de inhibición de proteasoma. Proteasoma se sabe que juega un papel en el desarrollo de cáncer, enfermedades inflamatorias y enfermedades cardiovasculares [10]. Por lo tanto, podría ser interesante estudiar si la inhibición del proteasoma está implicado en los efectos de fangchinoline, tetrandrine, así como Fangji.
(A) Estructura química de fangchinoline. (B) Estructura química de tetrandrine. (C) en tiempo real las mediciones de afinidad de unión a fangchinoline el proteasoma recombinante β1 proteína de la subunidad. (D) en tiempo real las mediciones de afinidad de unión a tetrandrine el proteasoma recombinante β1 subunidad de proteína. actividades (E) de la enzima de la subunidad β1 proteasoma recombinante con o sin presencia de fangchinoline a diferentes concentraciones. actividades (F) de la enzima de la subunidad β1 proteasoma recombinante con o sin presencia de tetrandrina a diferentes concentraciones. Los datos fueron resultados estadísticos de tres experimentos independientes.
Tanto fangchinoline [2, 11-14] y tetrandrine [4, 15-26] se había informado que tiene efectos anticancerígenos
in vitro Opiniones y
in vivo
. En el presente estudio, nos centramos en el estudio de los efectos anticancerígenos de fangchinoline. En informes anteriores mostraron que, fangchinoline podría inducir la detención del ciclo celular [11, 13, 14, 27] y la apoptosis [2, 14, 27] en las células cancerosas cultivadas. También había un informe acerca de las actividades contra el cáncer de fangchinoline
in vivo
[13]. En el presente estudio, se evaluaron los efectos anticancerígenos de fangchinoline en las células PC-3 cultivadas, las células LNCaP cultivadas y PC-3 ratones desnudos portadores de tumores. Ambos se comprobaron los efectos inhibitorios de fangchinoline sobre las actividades del proteasoma celular en las células cancerosas y sobre las actividades de proteasoma 20S purificado humanos. La eficiencia de proteasoma como una diana para la terapia del cáncer se basa en el hecho de que el sistema de la ubiquitina proteasoma era responsable de la degradación de muchas proteínas intracelulares importantes que intervienen en los procesos celulares críticos, tales como la progresión del ciclo celular, la proliferación y la apoptosis [28 a 30]. Por lo tanto, los efectos del tratamiento fangchinoline sobre la degradación de importantes sustratos del proteasoma, tales como p27, que jugó un papel en la progresión del ciclo celular, Bax que fue implicado en la apoptosis, y I? B que se refería a NF-kB vía [31] se comprobaron adicionalmente en la presente estudiar. Por otra parte, también se observó la influencia de la sobreexpresión de la subunidad β1 proteasoma o desmontables de proteasoma subunidad β1 sobre la sensibilidad de las células a la citotoxicidad de fangchinoline.
En conjunto, nuestros resultados sugieren la implicación de la inhibición del proteasoma en la lucha contra CANCER efectos de fangchinoline
in vitro
y
in vivo
. Los resultados del presente estudio contribuyen a la comprensión del mecanismo antitumoral de fangchinoline, así como Fangji.
Materiales y Métodos
Químicos
Fangchinoline con una pureza superior al 98% y tetrandrine con una pureza de más del 98% era tanto adquirido de Shanghai Fuente Hoja Tecnología Co., Ltd. (Shanghai, china). Fangchinoline o tetrandrina se disolvió en DMSO a la concentración de 0,1 M como solución madre y se almacenaron a -20 ° C. sustratos peptídicos fluorogénicos Z-LLE-AMC para el control de la caspasa-como actividad (C-L) proteasoma y Z-ARR-AMC para el control (T-L) la actividad del proteasoma similar a la tripsina eran de Calbiochem, Merck. sustrato peptídico fluorogénico Suc-LLVY-AMC para el control de la actividad del proteasoma de tipo quimotripsina (CT-L) fue de Sigma-Aldrich. Otros reactivos químicos, excepto cuando específicamente indicado, se adquirieron de Sigma-Aldrich.
Cultivo de células
PC-3 células de cáncer de próstata humano y células de cáncer de próstata LNCaP humanos se adquirieron en el Centro de Recursos de la célula Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas, la Academia china de Ciencias. las células PC-3 y las células LNCaP fueron cultivadas en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina y se mantuvo a 37 ° C y 5% de CO
2. suero bovino fetal, RPMI 1640, penicilina y estreptomicina eran todos de Hyclone.
plasmón de superficie biosensor de resonancia análisis
El proteasoma humano recombinante β1 subunidad, producto de gen PSMB6, se expresó como His-tag proteínas utilizando Escherichia coli, y se purificó luego por cromatografía de afinidad como se informa en nuestro estudio anterior [32]. Las afinidades de unión de fangchinoline o tetrandrine al proteasoma subunidad recombinante β1 catalítica, se analizaron
in vitro
usando un instrumento Biacore 3000 (Biacore AB, Rapsgatan 7, S-754 50 Uppsala, Suecia) como se informó antes del [33] . Brevemente, proteasoma recombinante β1 proteína de la subunidad se inmovilizó sobre un chip sensor CM5 como ligando en 11.624,5 RU con N-etil-N '- carbodiimida (3-dimetilaminopropil) y N-hidroxisuccinimida de acuerdo con los procedimientos de acoplamiento de amina primaria estándar, y HBs EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005% (v /v) tensioactivo P20, pH 7,4) se utilizó como tampón de ejecución. La equilibración de la línea de base se realizó por un flujo continuo de HBS-EP a través de la superficie del chip durante 1 a 2 h. Se recogieron datos de Biacore a 25 ° C con HBS-EP como el tampón de desplazamiento a un caudal constante de 20 l /min. Fangchinoline o tetradrine se diluyó en serie en el tampón de desplazamiento a 0, 2,4, 3,43, 4,90, 7,0, 10 y 20 mM. Las muestras se inyectaron en los canales en un caudal de 20 l /min, seguido de lavado con el tampón de desplazamiento. Las respuestas de unión se registraron continuamente en unidades de respuesta (RU) a una frecuencia de 1 Hz como sensogramas y presentados como una función del tiempo. La asociación (
k
a) y disociación (
k
d) las constantes de velocidad, la constante de equilibrio de disociación () se determinaron mediante análisis de los sensograma-curvas obtenidas en diferentes concentraciones del compuesto mediante el uso de software de evaluación BIA versión 3.1 (Biacore) y el 1: 1. Langmuir ajuste del modelo de unión
Ensayo de la actividad enzimática del proteasoma subunidad recombinante β1 catalítica
En pocas palabras, actividad catalítica del proteasoma humano recombinante β1 subunidad se ensayó mediante la adición de proteína β1 subunidad recombinante (30 mg) a 100 l de tampón de proteasoma ensayo de actividad (10 mM Tris-HCL, pH 7,8, 5 mM de trifosfato de adenosina, ditiotreitol 0,5 mM y 5 mM MgCl
2 • 6H
2O) que contiene 50 mM Z-LLE-AMC en presencia de fangchinoline o tetrandrine a diferentes concentraciones o no. La actividad de la hidrolasa de la subunidad del proteasoma β1 catalítica podría liberar el componente AMC fluorogénico de sustrato Z-LLE-AMC y la liberación de AMC se midió después de 2 h de incubación usando un lector de microplacas Bio-Rad 550 con excitación y emisión de longitudes de onda de 360 y 465 nm , respectivamente.
ensayo MTT de los efectos de fangchinoline sobre la proliferación de células PC-3 y LNCaP células
los efectos inhibitorios del fangchinoline sobre la proliferación de células PC-3 o células LNCaP se observó mediante la comprobación la viabilidad celular de las células usando el ensayo MTT como se ha descrito antes [33]. Brevemente, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 × 10
4 células /ml para las células PC-3 y 4 × 10
4 células /ml para las células LNCaP. Después de cultivo durante la noche, los medios se cambiaron a medio fresco que contenía varias concentraciones de fangchinoline o 0,1% de DMSO (control de disolvente) durante 24, 48 h o 72 h. La viabilidad celular se evaluó midiendo la conversión mitocondrial dependiente de la sal de tetrazolio MTT amarilla para cristales de formazán de color púrpura por células metabólicamente activas. La densidad óptica (proporcional al número de células vivas) se evaluó con un lector de microplacas Bio-Rad 550 a 570 nm. IC
50 valor (concentración inhibitoria media máxima) se calculó por el método Logit.
Ensayo de la actividad del proteasoma celulares de células PC-3 y LNCaP células
Las células fueron tratadas con cualquiera control de disolvente (0,1% DMSO), fangchinoline a diferentes concentraciones, o carfilzomib 1 M (control positivo) durante 24 h a 37ºC. Las actividades enzimáticas de proteasoma celular en lisado celular se midieron como se informa en nuestro anterior documento [32]. Brevemente, las células se recogieron, se lavaron con PBS y después se lisaron en tampón de ensayo la actividad del proteasoma durante 30 min a 4 ° C. El homogenado se centrifugó a 12.000 × g durante 30 min a 4 ° C. Se recogió el sobrenadante como extracto de células completas y el contenido de proteína en el sobrenadante se midió con el reactivo de Bradford. actividades catalíticas de proteasoma celular se analizaron mediante la adición de extracto de células enteras (que contiene 30 g de proteína) a 100 l de tampón de ensayo de la actividad del proteasoma que contiene péptidos sustratos 50 M fluorogénicos como Z-LLE-AMC para detectar la actividad CL, Z-ARR-AMC de detectar la actividad TL o Suc-LLVY-AMC para detectar la actividad CT-L, respectivamente. La liberación de fluorogénico AMC a partir de los sustratos peptídicos a continuación, se midió como se describe anteriormente.
Ensayo de la actividad de CL 20S del proteasoma humano purificado
El kit de ensayo de proteasoma 20S fue comprado a Enzo Life Sciences, Inc . (Farmingdale, NY 11735, EE.UU.). El K
m, V
max valores del proteasoma purificada de eritrocitos humanos 20S para el sustrato peptídico fluorigenic Z-LLE-AMC se miden de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. La inactivación de purificada de eritrocitos humanos proteasoma 20S por fangchinoline se determinó mediante el seguimiento de la hidrólisis del sustrato en presencia de diferentes concentraciones de fangcinoline. Los ensayos se realizaron a 37 ° C en un tampón de reacción (50 l) que contiene 50 mM Tris /HCl, pH 7,5, KCL 25 mM, NaCl 10 mM, MgCl 1 mM
2, 0,1 g del proteasoma 20S y Z-lle- AMC. Las reacciones se dejaron proceder durante 120 min, y datos de fluorescencia se recogieron cada 1 min, y luego se grafican como una función del tiempo. La aparente disociación constante, K
i
aplicación, se determinó no lineal por mínimos de ajuste de la velocidad fraccionada, v
i /v
0, como una función de [I], donde v
i es la actividad residual de estado estacionario de la enzima en presencia del inhibidor (I) y v
0 es la velocidad inicial en ausencia de inhibidor (). La constante de disociación, Ki, se calculó a partir de la aparente constante de disociación, K
i
aplicación, utilizando la siguiente expresión, donde [S] es la concentración de sustrato y K
m es el sustrato constante de unión () .
inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis por fangchinoline en las células PC-3
La inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis por fangchinoline en las células PC-3 se observó mediante el uso de análisis de citometría de flujo como se se describe en nuestros informes anteriores [32-34]. En pocas palabras, para citometría de flujo análisis de ciclo celular, se recogieron las células después del tratamiento, se lavaron con PBS y después se fijaron con 70% de etanol a 4 ° C durante la noche. Después de lavados con PBS, las células se resuspendieron en tampón de tinción (10 mg /ml de RNasa A y 5 mg /ml de yoduro de propidio en PBS frío) durante 30 minutos en oscuridad a temperatura ambiente y después se analizaron usando citómetro de flujo FACSCalibur. Para el análisis de citometría de flujo de apoptosis, Alexa Fluor 488 Anexina V & amp; se utilizó PI /Dead Cell Apoptosis Kit (Invitrogen). Las células se recogieron después del tratamiento, se lavaron con PBS y después se resuspendieron en tampón de unión y después se incubaron con anexina V-FITC y yoduro de propidio durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. A continuación, se llevó a cabo el análisis de citometría de flujo y análisis de los datos se realizó con el programa informático CellQuest.
experimentos de xenoinjertos tumorales PC-3
Desnudo masculino ratones inmunodeficientes Balb /c-nu-nu, 4 semanas de edad, fueron adquiridos de Shanghai Experimental Animal Center. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Instituto de Materia Médica de Shanghai, Academia China de Ciencias. En el día 0, las células PC-3 (8 × 10
6 células) suspendidas en 0,2 ml de suero libre de RPMI 1640 se inocularon por vía subcutánea en el flanco derecho de cada ratón (seis ratones por grupo). 14 días después de la inoculación, los ratones se dividieron al azar en 3 grupos y comenzaron inyección, ya sea con el control del vehículo o fangchinoline a 25 mg /kg (ip., QD) o 50 mg /kg (ip., QD). tamaños de los tumores se midieron cada 4 días usando calibradores y sus volúmenes se calcularon utilizando una fórmula estándar: Ancho
2 × longitud /2. El volumen tumoral relativo (RTV) se define como la relación del volumen del tumor en un tiempo indicado y el volumen del tumor al inicio del tratamiento con fármacos. El peso corporal se midió diariamente. En el día 30 después de la inoculación, los ratones fueron sacrificados por CO fueron disecados
2 de inhalación y de tumores de xenoinjertos. Para visualizar la apoptosis en xenoinjertos de tumores, marcado por TUNEL se realizó para detectar los núcleos apoptóticos utilizando En Death Kit de detección in situ (Roche Molecular bioquímicos). Brevemente, xenoinjertos de tumor se fijaron con solución de formalina al 10% a temperatura ambiente durante 24 h y luego incrustan de parafina. Las muestras se calentaron durante 1 h en baño de agua-Slide Drier (LEICA H1 1220, alemán), se incubaron con dimetilbenceno por dos veces (8 min cada uno) y después se incubaron con 100%, 95%, 90% y 85% de etanol durante dos veces ( 3 min cada uno). Las muestras se incubaron a continuación con tampón citrato 0,1 M (pH 6,0) para la irradiación de microondas. Después de lavar con PBS por dos veces (3 min cada uno), las rebanadas se incubaron con tampón de reacción (de la En Death Kit de detección in situ) en una atmósfera húmeda a 37 ° C durante 1 h. a continuación, las rebanadas se lavaron con PBS tres veces (3 min cada uno) para eliminar no incorporada trifosfato de fluoresceína-desoxiuridina. Los núcleos se contratiñeron con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 1 mg /ml durante 3 minutos y después se lavó con PBS tres veces (3 min cada uno). Las imágenes fueron capturadas utilizando un objetivo 20X (Olympus BX51, Japón) en un microscopio de epifluorescencia. Además, se ensayaron las actividades del proteasoma de xenoinjertos de tumores. Brevemente, los xenoinjertos tumorales se homogenerized en tampón de ensayo la actividad del proteasoma usando el Sistema de FastPrep (MP FastPrep-24, U.S.A), y después de centrifugación a 4 ° C durante 30 min. Los sobrenadantes se usaron después para el ensayo de las actividades del proteasoma, utilizando el método como se describe anteriormente para el análisis de las actividades del proteasoma celulares.
análisis de transferencia de Western
ensayo de transferencia de Western se llevó a cabo como se ha descrito antes [33, 34] . Brevemente, una alícuota de la proteína (100 g) de la muestra se cargó en un gel de SDS 12%, se separó electroforéticamente y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad). Después de que la membrana se incubó con TBS 10 mM con 20% de Tween 20 y 5% de leche desnatada deshidratada para bloquear la unión no específica de proteínas, la membrana se incubó con anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos primarios (todos de Cell Signaling Technology) utilizados fueron un anticuerpo policlonal de conejo contra I? B-α humano (# 4812, 1: 400), Bax (# 2772, 1: 400), proteasoma β1 subunidad (PSMB6) (# 13267, 1 : 500), β-actina (# 4967, 1: 400) y anticuerpo monoclonal de ratón contra p27 humano Kip1 (# 3688, 1: 400) o ubiquitina (# 3936, 1: 1000). Después de lavados TBS, manchas de transferencia se incubaron con anticuerpo secundario durante 2 h a temperatura ambiente a una dilución 1: 1000 y luego visualizadas usando quimioluminiscencia (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, EE.UU.). Los anticuerpos secundarios utilizados eran HRP-vinculada IgG de cabra anti-conejo (# 7074) y el caballo unido a HRP anti-IgG de ratón (# 7076), ambos de Cell Signaling Technology.
La sobreexpresión de la subunidad del proteasoma β1 en PC-3 células por transfección del plásmido
Las células se obtuvieron con la sobreexpresión de la subunidad β1 proteasoma mediante transfección con el plásmido pcDNA3.1 codificación de longitud completa humana PSMB6 cDNA como se describe antes [34]. Para la transfección del plásmido, 5 × 10
5 Las células se sembraron en cada pocillo de una placa de seis pocillos hasta que las células alcanzaron aproximadamente 80% de confluencia después se cultivaron durante 24 h. 2,5 g pcDNA3.1 se diluyó plásmido que codifica ADN PSMB6 o ADN plásmido pcDNA3.1 sin PSMB6 (como control negativo) en medio libre de suero 250 l y después se incubaron durante 20 min a temperatura ambiente con una mezcla de 10 l de Lipofectamine 2000 (Invitrogen ) y medio libre de suero 400 l. Se añadió entonces la mezcla compleja resultante a cada pocillo de la placa de cultivo celular. Después de 6 h de incubación, el medio complejo se reemplazó con medio esencial mínimo fresco suplementado con 10% (v /v) FBS y dejó de crecer durante la noche. Después, se añadió G418 (Merck) al medio para alcanzar una concentración final igual a la dosis fatal mínimo (400 mg /ml). Las células se dejaron crecer y pasaje en presencia de G418 durante más de 2 semanas. La expresión de la subunidad del proteasoma β1 en las células transfectadas se comprobó mediante Western Blot ensayo y se compara con la de las células de tipo salvaje y las células de control negativo. La citotoxicidad de fangchinoline en células con sobreexpresión de la subunidad β1 proteasoma fue entonces comprueba mediante ensayo MTT como se ha descrito anteriormente y en comparación con la de las células de tipo salvaje y las células de control negativo.
Desmontables de proteasoma subunidad β1 en PC-3 células por transfección siRNA
Validado siRNAs para PSMB6 (Sigma-Aldrich) se transfectaron en células PC-3 utilizando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Revueltos ARNip de control negativo (Sigma-Aldrich) se utilizaron como control negativo. Los niveles de expresión de PSMB6 (proteasoma subunidad β1) en las células de tipo ancho, células PSMB6 desmontables (células tratadas con siRNAs para PSMB6), células de control negativo (células transfectadas con el control negativo revueltos siRNAs) se comprueba mediante ensayo de Western Blot. Para comprobar la influencia de la proteasoma β1 subunidad desmontables sobre la citotoxicidad de fangchinoline, las células fueron transfectadas con siRNAs para PSMB6 o revueltos siRNAs control negativo para 24 h. Luego, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 x 103 células /pocillo y los efectos de fangcinoline sobre la proliferación celular se comprueba mediante el ensayo de MTT como se describe anteriormente. Además, los efectos de fangchinoline sobre los marcadores de apoptosis y la autofagia en células con normal o desmontables de subunidad β1 se comprueba mediante ensayo de transferencia de Western como se describe anteriormente. En resumen, después transfectadas con siRNAs para PSMB6 o revueltos siRNAs de control negativo por 24 h, las células se trataron con fangchinoline a 40 M durante 24 h. A continuación, las células se recogieron para el ensayo de transferencia Western. Los anticuerpos primarios utilizados fueron conejo anti-caspasa 3 de anticuerpos (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat#9662), anticuerpo de conejo anti-PARP (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat#9542) y el anticuerpo anti-LC3B conejo ( 1: 1000, Tecnología de Señalización celular, Cat#2775). El anticuerpo secundario utilizado fue de cabra unido a HRP anti-IgG de conejo (1: 1000, Tecnología de Señalización Celular, Cat#7074).
El análisis estadístico
de Student
t CD - se aplicó la prueba para evaluar las diferencias entre los grupos tratados y de control. Los datos se expresan como media ± SEM y se utilizaron los resultados de al menos 3 experimentos independientes para el análisis estadístico. Los asteriscos indican una diferencia significativa (P & lt; 0,05) en comparación con el control no tratada
Resultados
Las afinidades de unión y los efectos inhibidores directos de fangchinoline /tetrandrine sobre proteasoma subunidad beta 1 recombinante
Tanto fangchinoline (figura 1C) y tetrandrine (figura 1D) exhibieron afinidad de unión directa con la subunidad del proteasoma β1 humano recombinante. Como se muestra en la figura 1C, RU aumentó al aumentar la concentración fangchinoline, que indicó que fangchinoline era capaz de unirse a proteasoma β1 subunidad de una manera dependiente de la dosis. Se observaron resultados similares para la tetrandrina (Fig 1D). La asociación (
k
a), de disociación (
k
d) y la disociación de equilibrio (
K
D) o constantes de fangchinoline la unión a la subunidad del proteasoma β1 tetrandrina se muestra en la Tabla 1. los resultados sugieren que fangchinoline y tetrandrine exhibieron afinidad de unión similar a la del proteasoma β1 subunidad. Además, tanto fangchinoline y tetrandrine podrían inhibir directamente la actividad enzimática de proteasoma recombinante β1 subunidad
in vitro
. Como se muestra en la figura 1E, dependiente de la dosis fangchinoline inhibió la actividad de proteasoma recombinante β1 subunidad. Se observaron resultados similares para tetrandrine (Figura 1F).
efectos inhibitorios del fangchinoline sobre las actividades de proliferación celular y el proteasoma de células cancerosas
Como se muestra en la figura 2A, fangchinoline podrían dosis-dependiente y el tiempo de forma dependiente de disminuir la viabilidad de las células PC-3. El IC valores
50 de fangchinoline en la inhibición de la proliferación celular de células PC-3 fueron 27,53 ± 3,346 M durante 24 h, 13,13 ± 1,579 M durante 48 h, y 7,247 ± 0,3122 M durante 72 h de tratamiento, respectivamente. Además, como se muestra en la figura 2B, fangchinoline podría dosis-dependiente inhibir la actividad C-L de proteasoma celular, que fue mediada por proteasoma β1 subunidad. La inhibición de la actividad C-L fue significativa en dosis de fangchinoline 1 y 10 mM. Las actividades del proteasoma similar a la tripsina (TL) y quimotripsina (CT-L) actividades, β2 mediado por proteasoma y subunidad β5, no se vieron afectados significativamente por el tratamiento fangchinoline.
(A) La viabilidad celular (MTT resultado del ensayo) de las células PC-3 tratados con varias concentraciones de fangchinoline para 24, 48 o 72 h. Los datos fueron resultados estadísticos de tres experimentos independientes. (B) las actividades del proteasoma celular de las células PC-3 tratados con 0,1% de DMSO o fangchinoline a diferentes concentraciones durante 24 h. (C) La viabilidad celular (resultado del ensayo MTT) de las células LNCaP tratadas con varias concentraciones de fangchinoline para 24, 48 o 72 h. (D) las actividades del proteasoma celular de las células PC-3 de control tratadas con 0,1% de DMSO (control de disolvente) o fangchinoline a diferentes concentraciones durante 24 h. Los datos fueron resultados estadísticos de tres experimentos independientes. *
p Hotel & lt; 0,05 frente al control de disolvente. Carfilzomib se utilizó como control positivo.
Se observaron resultados similares en otra línea celular de cáncer, las células LNCaP. dependiente de la dosis Fangchinoline y dependiente del tiempo disminuyen la viabilidad de las células LNCaP (Fig 2C). El IC
50 valores de fangchinoline en la inhibición de la proliferación celular de las células LNCaP fueron 36,18 ± 6,33 M durante 24 h, 11,59 ± 0,22 M durante 48 h, y 12,73 ± 0,59 M durante 72 h de tratamiento, respectivamente. Y, fangchinoline también podría inhibir significativamente la actividad de la proteasoma CL celular, pero no afectará a las actividades de las actividades del proteasoma TL y TC-L en las células LNCaP (Figura 2D).
efectos inhibitorios del fangchinoline sobre la actividad de CL purificada proteasoma 20S humanos
La curva de hidrólisis del sustrato peptídico fluorigenic-β1 específica Z-LLE-AMC a diferentes concentraciones de proteasoma 20S purificado humanos se muestra en la figura 3A. El K
m y V
máximo del proteasoma purificado se calculó en 244.2 M y 9.749X10
-4 nmol /min, respectivamente. Las curvas dependientes del tiempo de hidrólisis representativa de Z-LLE-AMC (75 M) por proteosoma con o sin presencia de 500 mM fangchinoline fueron mostrados en la figura 3B. Los resultados indicaron que la hidrólisis del sustrato por proteasoma fue parcialmente inhibida en presencia de fangchinoline. Los efectos inhibidores de fangchinoline a diferentes dosis se muestran en la figura 3C. El K
i de fangchinoline se calculó en 356,58 ± 30,63 M.
(A) La hidrólisis del sustrato-β1 específica péptido fluorigenic Z-LLE-AMC a diferentes concentraciones de proteasoma 20S purificado humanos. (B) la hidrólisis dependiente del tiempo de sustrato 75 mM Z-LLE-AMC por el proteasoma 20S, con o sin presencia de 500 fangchinoline M. (C) Los efectos inhibitorios del fangchinoline a diferentes concentraciones sobre la actividad de hidrólisis del proteasoma 20S. Los datos fueron resultados estadísticos de tres experimentos independientes.
Fangchinoline inducida por la detención del ciclo celular y la apoptosis en las células PC-3
Los resultados representativos de análisis del ciclo celular se muestran en la figura 4A y análisis estadístico resultados se muestran en la Tabla 1. tratados con Fangchinoline células PC-3 parecían acumularse en la fase G0 /G1 con una disminución concomitante en el porcentaje de células en la fase S. Y, fangchinoline también dependiente de la dosis inducida por la apoptosis en células PC-3. Los resultados representativos de análisis apoptosis se muestran en la figura 4B y resultados de los análisis estadísticos se muestran en la Tabla 2.
(A) de flujo de Representante citometría de los resultados del análisis de los histogramas de ADN de células PC-3 tratados con varias concentraciones de fangchinoline para 24 marido. se observó la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1. (B) de flujo Los resultados representativos análisis de citometría de apoptosis en células PC-3 tratados con varias concentraciones de fangchinoline durante 24 h. Mostró eran resultados representativos de tres experimentos independientes.
tratamiento Fangchinoline inhibió el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de próstata PC-3 y la apoptosis inducida
Como se muestra en la figura 5A, el tratamiento fangchinoline en 25 y 50 mg /kg dependiendo de la dosis podría inhibir el crecimiento de xenoinjertos de PC-3. Los datos mostraron en la figura 5A era el volumen tumoral relativo (RTV), que se define como la relación del volumen del tumor en un tiempo indicado y el volumen del tumor al inicio del tratamiento con fármacos. Los datos del volumen del tumor (mm
3) de cada grupo se mostraron en la Tabla S1. Y, los resultados de TUNEL etiquetado (Fig 5B) mostraron que la apoptosis se indujo en PC-3 xenoinjertos de animales tratados con fangchinoline.
(A) de la curva de crecimiento del tumor en ratones desnudos tratados con control de vehículo, 25 mg /kg fangchinoline o 50 mg /kg fangchinoline. (B) Apoptosis (mostrada por etiquetado TUNEL) inducida por fangchinoline en xenoinjertos de tumores de animales tratados con fangchinoline. Barra de escala = 10 micras. actividades (C) del proteasoma de xenoinjertos de tumores de los animales tratados con control de vehículo o fangchinoline. *
P
. & Lt; 0,05 vs grupo control
inhibición del proteasoma en xenoinjertos de animales tratados con fangchinoline
Como se muestra en la figura 5C, los resultados de la actividad del proteasoma ensayo de los xenoinjertos de tumor indicó que las actividades del proteasoma de xenoinjertos de grupos fangchinoline tratados disminuyeron en comparación con el de control del vehículo. La disminución de la actividad del proteasoma fue significativa en el grupo de 50 mg fangchinoline tratados /kg.
acumulación inducida Fangchinoline de ubiquitinated proteínas, así como Ub-I? B, Ub-p27 y Bax Ub-
proteasoma inhibición podría causar acumulación de proteínas ubiquitinadas. Como se muestra en la figura 6A y la figura 6B, fangchinoline acumulación dependiente del tiempo de las proteínas ubiquitina en células dependiente de la dosis e inducido.