Extracto
Este carcinoma (ACC) es un tumor poco frecuente, pero muy maligno de origen desconocido. Inhibina α-subunidad (
Inha
) ratones knockout desarrollan ACC siguientes gonadectomía. En el hombre,
INHA
expresión varía ampliamente dentro de los tejidos del CAC y su circulantes péptido inhibina pro-αC ha sido descrito como un nuevo marcador tumoral para el CAC. Hemos investigado si los cambios genéticos y epigenéticos de la
INHA
gen en la pérdida causa ACC humano o variación de
INHA
expresión. Con este fin, los análisis de
INHA
secuencia, la metilación del promotor y la expresión de ARNm se realizaron en los tejidos de la corteza suprarrenal humanos. los niveles de pro-αC inhibina en suero se midieron también en pacientes ACC.
INHA
análisis genético en el 37 ACC única reveló 10 novela, variantes raras heterocigóticos. De las 3 bases de codificación afectadas, una variante era sinónimo y dos eran variantes de cambio de sentido: S72F y S184F. Se observó que el alelo menor de rs11893842 en -124 pb a una frecuencia baja (24%) en las muestras del CAC y se asoció con una disminución de
INHA
niveles de mRNA: 4,7 ± 1,9 unidades arbitrarias de AA, en comparación con 26 ± 11 para los genotipos AG /GG (p = 0,034). La metilación de cuatro proximal
INHA
CpG promotoras se incrementó de manera aberrante en cinco ACC (47,7 ± 3,9%), en comparación con las glándulas suprarrenales normales (18,4 ± 0,6%, p = 0,0052), mientras que los otros 14 ACC estudiados tuvieron disminuido metilación del promotor (9,8 ± 1,1%, p = 0,020). CpG metilación se correlaciona inversamente con los niveles de mRNA
INHA Hoteles en ACC (r = -0,701, p = 0,0036), pero no asociada con niveles pro-αC inhibina en suero. En conclusión, la metilación aberrante y la variación genética común en el
INHA
promotor ocurrir en los ACC humana y están asociados con la disminución de
INHA
expresión
Visto:. Hofland J, J Steenbergen , Voorsluijs JM, Verbiest MMPJ, de Krijger RR, Hofland LJ, et al. (2014) La inhibina subunidad alfa (
INHA)
expresión en cáncer de la corteza suprarrenal está vinculado a
INHA genética y epigenética
Promotor Variación. PLoS ONE 9 (8): e104944. doi: 10.1371 /journal.pone.0104944
Editor: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Marzo, 2014; Aceptado: 17 Julio 2014; Publicado: 11 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Hofland et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos están presentes en el manuscrito y la Tabla Suplementaria
Financiación:. Los autores no tienen financiación o apoyo al informe
Conflicto de intereses:. Prof. Wouter de Herder es un tablero editorial PLoS ONE miembro. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales.
Introducción
Este carcinoma (ACC) es una neoplasia poco frecuente, con una tasa de supervivencia de los pobres [1], [2] . La ocurrencia de ACC tiene una preponderancia femenina y una distribución bimodal con una mayor incidencia en los niños y en adultos mayores de 60 años [3]. Familial ACC se produce en el contexto de síndromes genéticos, como el síndrome de Beckwith-Wiedemann [4] y el síndrome de Li-Fraumeni [5]. Las mutaciones en los genes subyacentes a estos trastornos también se han relacionado con la formación de ACC esporádica, especialmente en el caso de
TP53
[6]. La alteración más frecuente encontrada en ACC es la sobreexpresión del locus maternalmente impreso IGF-II [7]. Más recientemente, las mutaciones en la vía /β-catenina Wnt han sido demostrado que se producen durante tumor adrenocortical progresión [8]. Las causas genéticas y el papel de las aberraciones cromosómicas en la tumorigénesis de la corteza suprarrenal siguen siendo en gran parte desconocido.
La inhibina α-subunidad (codificada por
INHA
) forma la inhibina A o B mediante el acoplamiento a la inhibina o βA- βB subunidades, respectivamente. Su expresión se limita a las gónadas, la placenta y la corteza adrenal. El efecto principal de circulación inhibinas A y B es la inhibición de la secreción local de la hormona estimulante del folículo activin inducida (FSH) en la glándula pituitaria [9]. En un modelo murino knockout, se encontró que la inhibina α-subunidad de tener un papel supresor tumoral para el tejido gonadal [10] y, después de la gonadectomía, por la corteza suprarrenal [11]. El noventa y nueve por ciento de los
Inha CD - /- ratones desarrollaron carcinomas adrenocorticales secretoras de esteroides después de la gonadectomía [11]. Vías involucradas en este sentido incluyen la diferenciación en células similares a las células de la granulosa-con la expresión de marcadores fetales o gonadales tales como
Gata4
,
Lhr, RFSH
y
CYP17A1
[12 ].
inhalación
carcinogénesis relacionada en los ratones también se ha atribuido a una disminución de la expresión de señalización activina potencial y aberrante y los efectos de TGF-β2 [13], [14].
En el hombre, la función de inhibinas suprarrenales es desconocida, aunque su contraparte activina a se ha descrito para estar involucrado en la regulación de la zona específica de la esteroidogénesis adrenocortical [15]. La evidencia de
INHA
como un supresor de tumores en el CAC humana es contradictoria. Varios estudios de ARNm y análisis de proteínas han demostrado falta de
INHA
expresión en una proporción de pacientes con ACC, así como
INHA
sobreexpresión en otro subconjunto [16], [17], [18] , [19], [20]. Recientemente, se informó de que los niveles séricos de la forma péptido libre de la α-subunidad, inhibina pro-αC, se incrementaron en pacientes con carcinomas de la corteza suprarrenal y que estos niveles se pueden utilizar como un marcador de tumor [21]; niveles-αC pro inhibina puede ser útil para la diferenciación entre tumores malignos y benignos adrenocorticales, así como para el seguimiento de los pacientes individuales. Aunque la mayoría de los pacientes mostró un incremento del CAC niveles séricos de inhibina pro-αC un subgrupo de pacientes tenían niveles normales, posiblemente en representación de los tumores que no expresan
INHA
[21].
Varios ADN alteraciones se sabe que influyen en la expresión génica durante la tumorigénesis. Aparte de los cambios genéticos que causan la expresión aberrante o ausente, alteraciones epigenéticas, tales como remodelación de la cromatina y la metilación de CpG, puede afectar a la transcripción de genes y frecuentemente ocurren en el cáncer [22]. La metilación de las islas CpG en las regiones promotoras de genes puede resultar en el silenciamiento transcripcional y la pérdida de la expresión de genes debido a la interferencia con la unión de factores de transcripción [23].
Insights en el control regulador de
INHA
expresión podría arrojar más luz sobre el papel de
INHA
en la tumorigénesis suprarrenal humana y de la variabilidad de los niveles de inhibina circulantes libres de suero que podrían funcionar como marcador tumoral en suero en pacientes con ACC. Con el fin de desentrañar este se investigaron los mecanismos de regulación de
INHA
expresión en el CAC humano. La secuenciación del
INHA
gen se realizó para buscar variantes genéticas que podrían afectar los niveles de función o expresión de genes. Además, el análisis de metilación cuantitativa de la
INHA
promotor se llevó a cabo con el fin de estudiar si la metilación de CpG contribuye a las diferencias en la expresión. Estos análisis se acoplan a los niveles de mRNA de tumor de las concentraciones de inhibina subunidad ay séricos de inhibina pro-αC.
Materiales y Métodos
Muestra recogida
tejido
parafina embebido bloques se obtuvieron de los archivos patológicos del Erasmus MC. Las muestras de tejido se originaron a partir de pacientes operados entre 1991 y 2010 en este hospital. El diagnóstico de carcinoma adrenocortical se hizo si el índice van Slooten superó 8 [24]. La estadificación del tumor se realizó de acuerdo a la Red Europea para el Estudio de los tumores suprarrenales sistema (ENSAT) puesta en escena [1]. Hematoxilina y eosina diapositivas fueron evaluados por un patólogo y secciones con un alto porcentaje de células tumorales viables fueron microdissected para su posterior análisis. Los tejidos extirpados antes de 2007 se obtuvieron de los archivos patológicos del Erasmus MC. El consentimiento informado para el uso secundario de tejido excedente se obtuvo de todos los pacientes antes de la cirugía oral. negativa del paciente para hacer tejido disponible para la investigación fue registrado por escrito y estas muestras no fueron incluidos en este estudio en consecuencia. A partir de 2007, se recogieron muestras en un estudio prospectivo de los tumores suprarrenales y el consentimiento escrito informado se obtuvo de todos los participantes. Estas muestras también incluyen tejidos adrenales de los pacientes que fueron sometidos a adrenalectomía debido a un carcinoma de células renales, la hiperplasia suprarrenal y el adenoma. secciones de tumores se recogieron a partir de piezas tumorales viables y se congelaron en nitrógeno líquido o hielo seco, poco después de la resección. los niveles séricos preoperatorios de inhibina pro-αC se midieron en los subgrupos de pacientes utilizando un ensayo inmunométrico ligado a enzimas (Diagnostic Systems Laboratory, Webster, TX, EE.UU.). El estudio se realizó de acuerdo a la normativa neerlandesa sobre el uso de tejidos residuales y aprobado por el Comité de Ética Médica del Erasmus MC.
secuenciación de ADN
Se aisló el ADN con un kit de ADN mini ( Qiagen, Venlo, Países Bajos) según el protocolo del fabricante y se disolvió en H
2O. Su concentración se midió usando un dispensador Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.).
El gen α-subunidad de la inhibina, situado en 2q35, se compone de dos exones (Figura 1). Para el análisis de ADN de tejidos embebidos en parafina se seleccionaron pares de cebadores para amplificar las regiones de 200 a 250 pb. Para las regiones de tejidos frescas congeladas hasta 500 pb podría ser amplificado con éxito. localizaciones de los cebadores se resumen en la Tabla 1. Los cebadores cubre la región de codificación, hasta -331 pb del sitio de inicio ATG (que contiene la unión del AMPc, SF-1 y GATA elementos de respuesta a -151 a -112 pb [25], [ ,,,0],26]) y al menos 153 bps de intrón adyacentes al exón-intrón límites (Figura 1).
Situado en 2q35,
INHA
se compone de dos exones separados por un intrón de 2 kb. La secuencia de codificación se compone de 1101 bps. Las regiones secuenciadas en este estudio se indican por las flechas continuas. Las áreas investigadas para la metilación se representan por las flechas de trazos; dinucleótidos CpG caracterizados éxito se muestran como círculos abiertos.
PCR amplificación se realizó en un volumen de 30 l de 0,05 U /l FastTaq polimerasa (Roche Applied Science, Almere, Países Bajos), 1 ng /ADN l, 250 nM adelante y atrás primers, 200 mM dNTPs (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) y tampón que contenía MgCl
2 (Roche) en un GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Nieuwerkerk aan den IJssel, Países Bajos) bajo las siguientes condiciones: 7 minutos a 95 ° C, seguido por 40 ciclos de intervalos de 1 minuto a 95 ° C, 56-63 ° C y 72 ° C, finalizando con 10 minutos a 72 ° C. Los productos de PCR fueron purificados por alta PCR kit de purificación de producto puro (Roche)
.
Tanto directo e inverso se utilizaron cebadores de PCR en las reacciones de secuencia por separado con el Kit de Secuenciación de Ciclo v1.1 BigDye Terminator (Applied Biosystems). Tres l de producto de PCR purificado se utilizó con 500 nM de cebador en una reacción de 1 minuto a 96 ° C y 25 ciclos de 30 segundos a 96 ° C, 15 segundos a 50 ° C y 4 minutos a 60 ° C. Los productos de reacción de secuencia se purificaron con el uso del colorante-Ex 96 kit de purificación (Qiagen) y columnas de purificación de Micro-Bio-Spin (Bio-Rad, Veenendaal, Países Bajos). detección de la secuencia se realizó a través de ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). software Sequencher (genes Códigos Corporation, Ann Arbor, MI, EE.UU.) se utilizó para el análisis de ADN.
La metilación análisis
Uno g de ADN, obtenidas a partir de muestras congeladas, se trató con bisulfito mediante el EZ kit de metilación del ADN (investigación Zymo, Irvine, CA, EE.UU.), se eluyó en 100 l H
2O y se almacena a -80 ° C. ADN bisulfito tratada en la región promotora de
INHA
fue amplificado por PCR, mientras que un promotor T7 se introdujo en el cebador inverso. El uso de software EpiDESIGNER proporcionada por Sequenom (San Diego, CA, EE.UU.) dos conjuntos de cebadores fueron diseñados que cubría múltiples dinucleótidos CpG aguas arriba de la
INHA
comenzar sitio (Figura 1); las secuencias de cebadores se describen en la Tabla 1.
La PCR se realizó en un volumen de 5 l que contiene 0,04 U /l HotStar Taq polimerasa (Qiagen), 200 mM dNTPs, 200 nM de ambos cebadores, 1 l de bisulfito ADN tratado con, HotStar PCR tampón y H
2O. Después de 10 minutos a 95 ° C, 35 ciclos se llevaron a cabo de 30 segundos a 95 ° C, 30 segundos a 53 ° C y 45 segundos a 72 ° C. La reacción terminó con una etapa de recocido de 7 minutos a 72 ° C. Después de la confirmación de producto de PCR en un gel de agarosa que contiene-2%, el producto se trató con 0,3 U de fosfatasa alcalina de camarón durante 20 minutos a 37 ° C y 5 minutos a 85 ° C.
A continuación,
in vitro
transcripción y escisión de base específica se realizó en una mezcla de 7 l que contiene 20 U de T7 R & amp; ADN polimerasa, la mezcla de escisión de T-específico, 3,14 mmol /l de DTT, la RNasa a, producto de la PCR y el tampón de la polimerasa T7 (Sequenom ). Los fragmentos resultantes se diluyeron con H
2O y 6 mg de resina limpio se añadió durante 10 minutos para eliminar los iones de sodio y potasio. Esta mezcla se centrifugó a 3000 rpm durante 5 minutos y se dispensa en un SpectroCHIP con el MassARRAY Nanodispenser RS-1000 instrumento (Sequenom). metilación cuantitativa fue detectado por un desorción de matriz asistida por láser /ionización se ha realizado mediante software EpiTYPER acompaña de tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrómetro de masas (MassARRAY analizador compacto, Sequenom) y el análisis.
curvas estándar para estos Los ensayos se construyeron mediante el ensayo de mezclas de muestras de ADN mixtas que contienen 0% a 100% de metilación con intervalos de 10%. El análisis de metilación fue un éxito durante 8 GPC en el
INHA
promotor:. ubicada 149, 203, 241, 285, 558, 599, 719 y 751 pb aguas arriba de la
INHA
comenzar sitio
ARNm
El ARN total se aisló de los tejidos congelados por la corteza suprarrenal reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). transcriptasa inversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de
INHA
y limpieza genes
HPRT1
y
GAPDH
se realizaron por duplicado como se describe anteriormente [16]. Las secuencias de cebadores y sondas se han indicado en la Tabla 1. Los niveles de expresión de
INHA
se calcularon en relación a la del ciclo de umbral medio (Ct) de
GAPDH
y
HPRT1
utilizando el método delta-Ct y se multiplica por 1000.
el análisis estadístico
el conjunto de datos para este estudio se incluye en la Tabla S1. Los análisis de las diferencias entre los grupos se realizaron con las pruebas de Chi-cuadrado, análisis unidireccional de varianza seguido de pruebas múltiples de Tukey de comparación o t-tests utilizando el software GraphPad Prism (GraphPad Inc, La Jolla, CA, EE.UU.). los niveles de mRNA fueron log-convertidos antes del análisis. Las correlaciones se analizaron mediante el coeficiente de correlación de Spearman. Todas las pruebas se calcularon como dos colas y un nivel de P inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativa.
Resultados
Análisis de secuencias
El
INHA
secuencia se analizó en 37 tejidos únicos ACC (12 fresco congelado, incluidas en parafina 25). Los resultados de los análisis de la secuencia se han resumido en la Tabla 2.
En total, la secuenciación del
INHA
gen en el 37 ACC reveló 10 nuevas variantes genéticas raras en 8 ACC. Una ACC albergaba tres variantes heterocigotos (-77G & gt; A, -63A & gt; G y -56G & gt; T) en el 5'UTR, mientras que una variante heterocigota directamente después del codón de terminación (* 1G & gt; A) se detectó en otro ACC. Hemos localizado tres variantes intrónicas, ubicadas 179, 72 y 9 pb aguas arriba del intrón 1-exón 2 frontera. En la región de codificación de
INHA
detectamos 1 sinónimo de cambio de nucleótido (75C & gt; T, Ala25Ala) y 2 variantes de cambio de sentido, en 3 distintos ACC. Estas últimas incluyen tanto heterocigotos C → T variantes, en bps 215 y 552, que conduce a serina a fenilalanina cambios en los aminoácidos 72 y 184, respectivamente
En nuestra serie completa de muestras del CAC, el -124A & gt; G. SNP, rs11893842, fue la variación genética más frecuente con un alelo menor frecuencia (MAF) de 24%, frente al 44% en una población de referencia (www.1000genomes.org [27]). Además, el alelo menor de la intrónica SNP IVS1-87G & gt; A (rs116399602) estuvo presente en 16% de las muestras del CAC, aparentemente mayor que en individuos sanos (2,8% MAF). Rs7588807 (IVS1-314G & gt; T), sólo se midió en el subconjunto de muestras de ADN congelados. El alelo T menor se había informado anteriormente que se producen en 48% en los sujetos control; los ACC mostró un MAF menor del 29%. Rs35118453 (-16C & gt; T) y rs12720063 (532C & gt; T) estaban presentes en las frecuencias bajas, comparable a la referencia [27]: 9% y 12%, respectivamente. Rs144941390, rs374972575 y rs148455844 dentro del
INHA
gen se detectó en cada una muestra ACC.
La metilación análisis
La primera serie en la que
INHA
promotor metilación se investigó, abarcado ADN de 3 glándulas suprarrenales normales y 12 ACC. Para los 4 dinucleótidos CpG 558, 599, 719 y 751 pb aguas arriba de la
INHA
start site bajo relaciones de metilación se obtuvieron en todas las muestras analizadas: 4,4 ± 1,1%, 4,5 ± 0,8%, 1,7% y 0,7 ± 2,5 ± 0,6% (media ± SEM), respectivamente. Además, no hubo diferencias entre los tejidos suprarrenales normales y ACCs (datos no mostrados). Los CpG en proximidad al sitio de inicio se metilado a un mayor grado en un subconjunto de las muestras; Por lo tanto, hemos analizado un 7 ACC adicionales sólo con el par de cebadores aguas abajo.
Los resultados del análisis de metilación de CpG en -285, -241, -203 y -149 se representan en la Figura 2. Cinco ACC tenían aberrantemente alto las tasas de metilación de CpG proximales los cuatro investigados en el
INHA
promotor. ratio media de metilación de estos ACC fue 47,7 ± 3,9%, frente al 18,4 ± 0,6% para las glándulas suprarrenales normales (p = 0,0052) y 9,8 ± 1,1% para el otro ACC (P & lt; 0,0001). La diferencia en la metilación entre glándulas suprarrenales normales y el otro ACCs también fue estadísticamente significativa (P = 0,020). El porcentaje de
INHA
metilación del promotor en las muestras del CAC no se asoció con las características del tumor, como la sobreproducción hormonal, van Slooten índice o etapa ENSAT (datos no mostrados).
El análisis cuantitativo de metilación cuatro dinucleótidos CpG en el
INHA
promotor se realizó en 3 glándulas suprarrenales normales y 19 ACC. CpG individuales se indican en el eje x por el número pb situado 5 'del sitio de inicio ATG. 0 indica que no hay metilación de ADN mientras que 1 indica que todos los ADN a prueba en la muestra de tejido está metilado. puntos de datos individuales se componen de una media de mediciones por triplicado.
El análisis de expresión
INHA
los niveles de expresión de mRNA se midieron en adrenal normal (n = 10), hiperplasia adrenocortical (n = 20), adenoma (ADA, n = 11) y ACC (n = 25) tejidos. La cohorte incluyó 10 adrenal normal, hiperplasia suprarrenal 4 y 14 muestras del CAC en el que
se reportaron niveles INHA
antes [16]. El presente análisis mostró ausencia de
INHA
expresión en 3 ACC mientras que el otro ACCs demostraron una amplia gama de expresión a partir de 0,080 a 220 unidades arbitrarias (a.u.). En general, no hubo diferencias significativas entre los niveles de
INHA
expresión en todos los grupos investigados (Figura 3A). Además, los niveles de mRNA de
INHA Hoteles en los ACC no estaban relacionados con las características del tumor (datos no mostrados).
(A) Cuantitativo
INHA
análisis de mRNA fue comparable en las glándulas suprarrenales normales (Nl, n = 10), la hiperplasia suprarrenal (Hyp, n = 20), adenomas (ADA, n = 11) y carcinomas (ACC, n = 25). La muestra que alberga el CAC S184F variantis muestra como un círculo abierto. Bar representa la media. (B) La variación en rs11893842 (-124A & gt; G) se asocian con cambios en
INHA expresión génica
. Las barras representan medios, * P & lt; 0,05. (C) asociación negativa entre la metilación del promotor de la
INHA
gen y
INHA
expresión de ARNm (r = -0,701, p = 0,0036). (D) La falta de correlación entre los
INHA
la expresión de ARNm y pro-αC puntuaciones Z de la inhibina en suero en pacientes con ACC (r = -0,473, p = 0,10).
De la 3 muestras del CAC con variantes genéticas raras en el
INHA
exones, sólo uno estaba disponible para análisis de expresión; este ACC albergar el cambio S184F mostró un nivel normal de
INHA
ARNm (15 a.u., la figura 3A, círculo abierto). Cuando estratificado para los cinco SNPs comunes, sólo la variación genética rs11893842 se asoció con cambios en
INHA
ARNm: significa la expresión en tejidos con el genotipo AA fue de 4,7 ± 1,9 a.u., comparado con el 26 ± 11 a.u. para los genotipos AG /GG (P = 0,034, Figura 3B).
ARNm combinada y análisis de metilación estaban disponibles para 15 tejidos. En general, hubo una asociación negativa significativa entre la proporción media de metilación de las islas CpG proximales y
INHA
expresión de ARNm (Figura 3C, r
s = -0,701, p = 0,0036).
Los niveles séricos de inhibina pro-αC estaban disponibles en un subgrupo de pacientes. No hubo relaciones significativas entre la inhibina en suero pro-αC puntuaciones Z en una relación de lado y metilación (n = 9, r
s = -0.10, p = 0,81, datos no mostrados) o la expresión de ARNm (n = 13, r
s = -0,47, P = 0,10, Figura 3D) en el otro. los niveles de inhibina pro-αC sólo estaban disponibles para un paciente ACC con raras
INHA variantes
: este paciente premenopáusica con tres variantes raras en el 5'UTR de
INHA
había incrementado altamente pro inhibina niveles αC a 3000 ng /l. (normal & lt; 780 ng /l)
Discusión
La inhibina α-subunidad se ha implicado en la tumorigénesis adrenocortical, ya que se observó que gonadectomized
Inha CD - /- ratones desarrollaron carcinomas adrenocorticales con penetrancia casi completa [11]. La pérdida de
INHA
expresión se ha detectado sólo en un pequeño subgrupo de los ACC humana [16], [17], [18], [20], [28], [29], abogando contra un tumor significativa papel supresor de
INHA
en la carcinogénesis de la corteza suprarrenal humana. Este es el primer estudio que muestra que la gran variación en
INHA
expresión en los ACC es causada en parte por la metilación y la variación genética común de la
INHA
promotor y no se debe a variantes genéticas raras.
En el modelo murino knockout,
Inha
se piensa que predisponen a las células de la corteza suprarrenal subcapsulares que someterse a un interruptor fenotípica de las células gonadales-como [11], [12], [14]. Esto ha planteado la hipótesis de que es causada por el aumento de la disponibilidad de la TGF-β de tipo III receptor betaglicano conduce a aumentada señalización de TGF-β2 [13]. El aumento concomitante en los niveles circulantes de gonadotropinas podría asegurar proliferación de células adrenocorticales a través de una vía de la ciclina D2-dependiente [30]. Aunque la histología de estos tumores parece a la de carcinoma adrenocortical en el hombre [11] que son funcionalmente más comparable a las células gonadales-como el estrógeno secretoras de [12]. Ya sea caída local de los
INHA
en las células de la corteza suprarrenal humanos contribuye a la tumorigénesis de la corteza suprarrenal es desconocido. Desde la aparición de los ACC muestra predominio en las mujeres posmenopáusicas que han aumentado los niveles de gonadotropina, este mecanismo podría ocurrir en este subgrupo de pacientes.
estudios de expresión previos han revelado que la inhibina α-subunidad no se expresa en un pequeño subconjunto de las muestras del CAC [16], [17], [18], [20], [28], [29]. Por el contrario,
in vivo
estudios tienen mayores niveles reveladas de la inhibina α-subunidad en el suero de pacientes con ACC [21], [31], [32]. Estos resultados son probablemente una consecuencia de la amplia variación en tumor
INHA
niveles de expresión, en el presente estudio sobre un 1.000 veces. Las causas de la pérdida o variación en
INHA
expresión eran desconocidos.
Un estudio previo ha investigado
INHA
variantes genéticas en los ACC. Longui
et al.
[19] estudiaron pacientes pediátricos con ACC línea germinal
TP53 mutaciones y
encontrado 3 raros, heterocigotos
INHA
variantes en 6 de cada 46 (13%) pacientes. De estas tres nuevas variantes, uno (G227A, rs12720061) se demostró posteriormente que un SNP común y no se produjo en nuestra cohorte ACC. Implicaciones de las otras dos variantes genéticas (P43A y A257T) son desconocidos; que no se encontraron en la investigación actual de los ACC esporádica. Curiosamente, el estudio mencionado anteriormente se encontró pérdida de heterocigosidad (LOH) en las proximidades de la
INHA
gen en ocho de los nueve ACC estudiados [19], lo que sugiere que la LOH podría causar disminución de los niveles de expresión. Por otra parte, los análisis de hibridación genómica comparativa de los ACC humana descrita pérdida cromosómica esporádica de la
INHA
región en 2q33-36, con predominio de los tumores infantiles [33], [34], [35]. Por otro lado, la inhibina α-subunidad se había demostrado que se sobreexpresa en los ACC pediátrica [21].
En el presente estudio, se detectaron dos nuevas variantes genéticas missense heterocigótica. La serina a sustituciones de fenilalanina en los aminoácidos 72 y 184 puedan afectar a la actividad de la inhibina α-subunidad resultante, pero ya que la función de la inhibina en la glándula adrenal humana es desconocido [36], es difícil para investigar las consecuencias de potencialmente alterado actividad. El tumor que alberga el cambio S184F expresa un nivel normal de
INHA
ARNm, pero la función o la degradación de proteínas aún podría verse afectada por la introducción del anillo lateral bencilo. Las variantes genéticas localizadas 179, 72 y 9 pb aguas arriba de la frontera intrón-exón podría conducir a splicing alternativo de la
INHA
gen. Es importante destacar que no se han detectado variantes homocigotos, abogando contra Parálisis total de
INHA
que conduce a la formación de ACC. Por desgracia, sólo teníamos un paciente con
INHA variantes
y los niveles de pro-αC concomitantemente disponibles inhibina sérica. Aquí, los niveles séricos altos fueron encontrados a pesar de tres variantes en la región promotora que crían la probabilidad de aumento de la actividad promotora. Dada la baja frecuencia de
INHA
variantes genéticas en los ACC esporádico y familiar [19], estos cambios en el ADN solamente podrían estar implicados en la tumorigénesis de la corteza suprarrenal en un pequeño subgrupo de pacientes del CAC. Varios común
INHA
SNPs se detectaron en nuestros pacientes. No se encontraron alelos menores de rs11893842 y rs758807 que ocurra en pacientes ACC en frecuencias más bajas que las reportadas previamente en cohortes sanas, lo que podría sugerir que los principales alelos de estos SNP juegan un papel en la oncogénesis suprarrenal. Curiosamente, el alelo menor de rs11893842, que se encuentra en la región promotora en las proximidades de las secuencias reguladoras cruciales [25], [26], se asocia con niveles más bajos de
INHA
expresión mRNA. La menor frecuencia de este SNP en muestras ACC parece contradecir la hipótesis de que
INHA
es un supresor de tumores en el CAC humano.
La metilación de regiones promotoras de los genes supresores de tumores es un mecanismo común que participan en carcinogénesis [23]. Disminución de
INHA
expresión en los ACC podría ser causado por el aumento de la metilación del
INHA
promotor. La metilación de follistatina, que participan en la activina e inhibina vía de señalización como un antagonista de la activina, se había encontrado en la línea celular humana ACC H295R [37]. Ahora muestran que un subconjunto de los ACC humana (21%) tiene una mayor relación de la metilación de varios CpG en el
INHA
promotor, en contraste con la mayoría de los ACCs que muestran una metilación disminuida de la
INHA
promotor comparación con el tejido adrenal normal. Esta amplia gama de metilación presumiblemente representa parte de la amplia
INHA
rango de expresión, como lo demuestra la relación inversa entre el
INHA
la metilación del promotor y
INHA
la expresión del ARNm. Esta modificación epigenética en el
INHA
promotor y rs11893842 también podría estar involucrado en el control reglamentario de
INHA
expresión en el otro
INHA
tejidos que expresan, es decir, gónadas y placenta.
los niveles de metilación de la
INHA
promotor y
INHA
la expresión de ARNm no se asociaron con niveles pro-αC inhibina en suero. Además, hemos encontrado previamente ninguna asociación entre los niveles de pro-αC y el estadio del tumor o el tamaño [21]. Por lo tanto, estos niveles podrían ser depende principalmente de la (post) translacional modificaciones, la actividad de las células tumorales, o aclaramiento de la circulación.
Las limitaciones del estudio incluyen el pequeño tamaño de la muestra, la incertidumbre acerca de la presencia de LOH y si la novela son variantes de la línea germinal o somática. Dada la muy baja incidencia de
INHA
variantes genéticas en este conjunto sustancial de 37 ACC, es muy poco probable que
INHA
mutaciones juegan un papel significativo en la formación del CAC en el hombre. Aunque no se estudió LOH directamente en estas muestras, la aparición de variantes de heterocigotos en los ACCs suplica contra knockout completa del gen. Es importante destacar que los ratones
Inha
ronda única homocigotos desarrollan tumores suprarrenales [11] declararse en contra de potencial tumorigénico del número de copia simple eliminación. Por último, se combina la secuenciación de tejido normal y tumoral podría revelar si las variantes no descritas anteriormente tienen una línea germinal o somática origen, pero esto no estaba disponible para el estudio actual. Estos resultados revelan un nuevo enlace entre la metilación y la expresión de la inhibina. Desmontables de la inhibina α-subunidad durante la formación del CAC través de la metilación podría predisponer a la acción de TGF-β o activina paracrina sin oposición sobre la proliferación de la corteza suprarrenal o la esteroidogénesis. La restauración de la inhibina y también follistatina [37] Los niveles de ACC por agentes demethylating podrían contribuir a las antiproliferativos y androgénica efectos observados con inhibidor de la metilación del ADN 5-aza-2'- desoxicitidina en las células de la corteza suprarrenal [38]. Por el contrario, la metilación del promotor de la inhibina podría ser también un mecanismo regulador común de la expresión de la inhibina en gonadal, tejido adrenal y placenta y el tratamiento con agentes desmetilantes podría especular para afectar la producción de inhibina en estos órganos.
En conclusión, aberrante metilación y la variación genética común dentro de la región promotora del
INHA
gen están asociadas con
INHA
la expresión del ARNm en el CAC humano. Estos epigenética y genética
INHA
cambios podría contribuir a la tumorigénesis de la corteza suprarrenal humana, similar a la situación en el murino
Inha
modelo nocaut. Rara
INHA
variantes no parecen estar implicados en la fisiopatología de la ACC esporádica.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Estudio conjunto de datos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0104944.s001 gratis (XLSX)