Extracto
Fosforilados moléculas de señalización son biomarcadores de la fisiopatología del cáncer y la resistencia a la terapia, sino porque analitos fosfoproteína a menudo son lábiles, prácticas de laboratorio clínico mal controlada podría prevenir traducción de resultados de la investigación en este campo desde el banquillo a la cabecera. Por lo tanto, comparamos múltiple biomarcador y fosfoproteína inmunohistoquímica (IHC) da como resultado 23 muestras de carcinoma colorrectal clínicos después de ya sea una novela, rápido protocolo de fijación del tejido o de un protocolo de fijación del tejido estándar empleado por los laboratorios clínicos, y que también investigó el efecto de un definido postoperatorio período de "frío" isquemia en estos resultados IHC. Se encontró que un intervalo de isquemia fría de una hora, permitido por directrices ASCO /CAP para ciertos ensayos de biomarcadores del cáncer, es altamente perjudicial para ciertos analitos fosfoproteína, específicamente el receptor fosforilado factor de crecimiento epidérmico (pEGFR), pero los intervalos isquémicos más cortos (menos de 17 minutos) facilitan la preservación de fosfoproteínas. En segundo lugar, se encontró que una rápida 4-horas, de dos temperaturas, la fijación con formalina dio tinción superior en varios casos con marcadores de selección (pEGFR, pBAD, pAKT) en comparación con un protocolo de fijación temperatura ambiente durante la noche estándar, a pesar de tomar menos tiempo. Estos hallazgos indican que las futuras utilidades de investigación y clínicos de la fosfoproteína IHC para evaluar colorectal carcinoma fisiopatología absolutamente dependen de atención a los factores preanalíticas y protocolos de fijación del tejido rigurosamente controladas
Visto:. Theiss AP, Chafin D, Bauer DR, Grogan TM, Baird GS (2014) La inmunohistoquímica de biomarcadores del cáncer colorrectal La fosforilación Requiere controlada fijación del tejido. PLoS ONE 9 (11): e113608. doi: 10.1371 /journal.pone.0113608
Editor: John Matthew Koomen, Moffitt Cancer Center de los Estados Unidos de América
Recibido: 18 Junio, 2014; Aceptado: 28 Octubre 2014; Publicado: 19 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Theiss et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue financiado en parte por una beca de investigación de GSB de Ventana Medical Systems, Inc. No hay un número de subvención asociada a esta investigación por contrato conceder. Este estudio fue un esfuerzo de colaboración entre la institución y de la Ventana de GSB, y por lo tanto los empleados de Ventana estuvieron involucrados en todas las etapas de esta investigación (diseño del estudio, recopilación de datos, análisis, decisión a publicar, y la preparación del manuscrito). La parte restante de este trabajo fue financiado por la Universidad de Washington interno de los fondos
Conflicto de intereses:. Geoffrey Baird ha leído la política de la revista y los autores de este manuscrito tiene los siguientes intereses en competencia: Los autores indicados son empleados de Ventana Medical Systems, Inc. Esta no modifica la adhesión de cualquier autor a cualquier política de PLOS ONE.
Introducción
atención reciente
en la terapia dirigida de cáncer colorrectal, se ha colocado en la importancia de identificar la estados de activación de las células moléculas de señalización a la predicción de respuestas a la terapia. Un ejemplo de ello es la reactivación mediada por EGFR de la señalización de MAPK, lo que contribuye a la insensibilidad de los carcinomas colorrectales BRAF mutante a la inhibición de la RAF con vemurafenib [1]. Es importante destacar que este evento de reactivación pEGFR está sujeto a la modulación por los inhibidores de EGFR, y la politerapia combinado inhibidores de BRAF y EGFR superar esta resistencia, con una respuesta beneficiosa
modelos in vitro y en Hoteles en animales
in vivo
.
la extensión de estos hallazgos de laboratorio previas a la clínica, y nuestra capacidad de afectar a los tratamientos alternativos, es totalmente dependiente de nuestra capacidad de preservar y detectar los estados de activación que se trate con precisión. Al tratar de determinar la preservación (fijación del tejido) óptima condiciones para apoyar la terapia dirigida, la literatura nos ha llevado a cuestionar si es o no una práctica habitual en el laboratorio de anatomía patológica es suficiente para hacer frente a todos los peligros potenciales que podrían afectar el estado de biomarcadores /activación preservación. Por ejemplo, en nuestra experiencia de laboratorio clínico, las muestras de tejido pueden permanecer a temperatura ambiente antes de la inmersión en fijador durante largos periodos, y el tiempo real invertido en un fijador, y la temperatura de dicho fijador, son a veces mal controlada. Actuales directrices profesionales estadounidenses sobre esta cuestión [2] - [4] frente a sólo un número limitado de tipos de muestras clínicas y de biomarcadores aguas abajo analiza, o son todavía bastante amplio en la definición de lo que se considera aceptable en términos de tiempo de fijación (una variación de 2 veces en el tiempo máximo de fijación, 16-32 horas, se recomienda en las directrices CLSI, y una gama de 12 veces la duración de la fijación, 6-72 horas, se considera aceptable en ASCO /CAP directrices marcador de cáncer de mama). Un pre-fijación del tiempo de "isquemia fría" de hasta una hora también se considera aceptable en una de estas directrices [3], que se encuentra dentro del rango de lo que hemos observado clínicamente en nuestras propias instituciones. Anteriores biomarcadores del cáncer estudios de inmunohistoquímica de hecho han encontrado ~ 1 hora tiempos de isquemia aceptable, aunque estos estudios se han centrado principalmente en los marcadores biológicos establecidos como del receptor de estrógeno y HER2 [5], [6]. Sin embargo, de las directrices que existen, no pretende considerar la preservación de estados de activación de biomarcadores, como los estados de fosforilación, en absoluto. Esto es particularmente problemático, ya que los estados de fosforilación se conocen desde hace algún tiempo para ser altamente sensibles a las condiciones preanalíticas [7] - [9]., Incluyendo los tiempos de calentamiento isquémicos [10] (que no son investigados aquí) guía
con este fin, hemos desarrollado una novela, rápido de dos temperaturas estrategia de fijación con formalina que encontramos conserva las características clave de los tejidos tales como la morfología, así como la expresión de proteínas, evaluado por la inmunohistoquímica [11]. En ese trabajo, hemos encontrado preservación pAKT significativa en un modelo de xenoinjerto Calu3 ratón, tal como se evaluó por IHC, utilizando un protocolo de fijación de dos temperaturas, y hemos encontrado que esta tinción se perdió casi por completo el uso de la fijación de la temperatura ambiente normal. Avanzando a partir de este estudio, hemos ampliado nuestro estudio en muestras de carcinoma colorrectal, el análisis de phosphoepitopes adicionales. En este amplio estudio actual, nos preguntamos si es o no la tecnología de dos temperaturas, además, ayudó a preservar el estado de activación de biomarcadores relevantes para la terapia del cáncer colorrectal, así como si o no el control de pre-fijación intervalos de isquemia fría fue importante para estos biomarcadores. El uso de 23 muestras quirúrgicas de carcinoma colorrectal recogidos con intervalos de isquemia fría definidos y protocolos de la fijación con formalina, se estudió el estado de fosforilación de numerosos objetivos vía de la PI3 quinasa, así como la mutación BRAF V600E y otros marcadores mediante inmunohistoquímica [12], [13]. Se presenta aquí en tanto la importancia del tiempo de isquemia fría como una variable en el análisis fosfoproteína, así como el impacto global de nuestro rápido protocolo de fijación con formalina de dos temperaturas.
Materiales y Métodos
Muestra muestras de carcinoma de colon humano de recogida y fijación
se obtuvieron de Indivumed GmBH (Hamburgo, Alemania) como bloques incluidos en parafina. Se recogieron muestras a Indivumed porque Ventana no es un centro médico y por lo tanto no tiene acceso a las muestras quirúrgicas, y también porque Indivumed se sabe que es capaz de proporcionar muestras de tejido con una documentados cortas (menos de 17 minutos) después de la escisión intervalo isquémico. Indivumed científicos realizaron colecciones de tejidos en proceso de aprobación de su junta de revisión institucional local, y obtuvo el consentimiento por escrito de los pacientes involucrados.
Para todos los experimentos, los protocolos de fijación se llevaron a cabo por los científicos Indivumed, y consistieron en la inmersión en un 10% neutral formalina tamponada (10% saturada acuosa de formaldehído a partir de Fisher Scientific, Houston, TX, tamponada a pH 6.8 a 7.2 con tampón de fosfato 100 mM) durante tiempos variables a temperaturas que varían desde 4 hasta 45 ° C. temperatura ambiente osciló entre 20-25 ° C. Las muestras de tejido recogidas de casos clínicos se dividieron en tres partes y cada fijados de manera diferente. Una pieza fue envuelto en solución salina empapado gasa y se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 hora ( "1 hora de isquemia fría") antes de la fijación 24 horas a RT. Esto era para probar el efecto del intervalo de isquemia fría pauta prescrita más larga de una hora. Las dos piezas restantes eran para probar el efecto de la más corta (menos de 17 minutos) Intervalo de isquemia fría. Una pieza se coloca directamente en la habitación de formalina temperatura durante 24 horas ( "24 horas"). Una tercera pieza se coloca directamente en 4 ° C formalina durante 2 horas seguido de 2 horas en 45 ° C formalina ( "2 + 2") [11]. Este último fue probar si el proceso podría ser acelerado para aumentar la eficiencia del trabajo en el hospital. La fijación se lleva a cabo en vasos de precipitados de 100-500 ml cubiertos en un refrigerador durante 4 ° C de tratamiento, o en una campana de humos química estándar para temperaturas más altas. tiempos de isquemia fría para el "24" y muestras "2 + 2" en promedio 10 +/- 3 minutos (rango 6-17 min). el procesamiento de tejidos aguas abajo se realizó tal como se describe [11], con todas las medidas de procesador de disolvente se mantuvieron a 45 ° C bajo presión ambiente, y el paso de la parafina se llevó a cabo a 60 ° C bajo vacío. Todas las muestras fueron embebidas en parafina y se cortaron en portaobjetos de vidrio como secciones de 4 micras de IHC o histomorfología.
La inmunohistoquímica automatizada
ensayos de inmunohistoquímica se realizaron en un instrumento automatizado de tinción VENTANA Descubrimiento XT de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. Las láminas fueron des-con parafina utilizando la solución EZprep (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) durante 30 minutos a 75 ° C. Epítopo recuperación se llevó a cabo en el centro de tinción automatizado con solución CC1 (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ) durante 64 minutos a 95 ° C. Los anticuerpos obtenidos de señalización Cell Technologies o Epitomics se titularon primero en un intervalo de concentraciones para proporcionar la relación óptima de la tinción específica de la tinción de fondo. Una vez que se establecieron títulos, los anticuerpos se transfirieron con diluyente a los dispensadores se pueden rellenar por el usuario para su uso en la tinción automatizada. Los portaobjetos se desarrolló utilizando la vista Opti
kit de detección de DAB (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Brevemente, los pasos incluyen inhibidor durante 8 minutos, enlazador durante 8 minutos, multímero durante 12 minutos, DAB /peróxido durante 8 minutos y el cobre por 4 minutos. Las láminas fueron counterstained con hematoxilina II durante 8 minutos (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, AZ). Anticuerpos, clones, y los títulos se enumeran en la Tabla 1. Los títulos de anticuerpos se determinaron para cada anticuerpo utilizando tejidos de control positivo y negativo, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Análisis inmunohistoquímico
Los análisis inmunohistoquímicos fueron anotado por dos patólogos independientes, cada uno cegados a la metodología de fijación para cada diapositiva, el uso de un H-score para semiquantitation de la proporción de tinción e intensidad [14]. En los casos con ambos
in situ
y neoplasia invasiva, sólo el tumor invasivo lejos de los márgenes de la muestra de tejido se anotó. Tinción de alta intensidad que fue claramente relegado a los márgenes de tejido absolutos (es decir, lo que comúnmente se conoce en inmunohistoquímica clínica como un "efecto de borde" [15]) ha sido ignorada. Las puntuaciones fueron cegados por un tercero, y todas las puntuaciones de cada H patólogo se representaron uno contra el otro para cada marcador. Las puntuaciones que aparecían subjetivamente discrepante, es decir, aquellos que se desviaban sustancialmente de la línea de identidad tal como se evaluó mediante la inspección visual, se revisaron de forma conjunta en un microscopio de múltiples cabezas y no se generó una puntuación de consenso.
Análisis estadístico
Todos los análisis se realizó con el paquete estadístico R. Para cada caso, se promediaron los puntajes H de los dos revisores. Las diferencias estadísticas entre los grupos de fijación (24 hr vs 2 + 2, 24 hr vs isquemia fría) usando una prueba de Wilcoxon Signed Rank dos lados emparejado. Debido a múltiples condiciones fueron evaluados de forma simultánea, los valores de p para estas comparaciones fueron convertidos en valores de Q falsos descubrimiento tasa corregida [16], [17]. Boxplots en la Figura 1 se generaron con el ggplot2 paquete. Las barras negras representan los valores medios y las cajas se extienden desde el 25
º a 75
º percentiles. Las marcas se prolongan hasta el 1,5 × la distancia intercuartil.
H puntuaciones de intensidad de la tinción para todos los biomarcadores estudiados, por condición de tratamiento. "2 + 2" es la condición de fijación rápida, "24 h." Es la condición temperatura ambiente 24 horas estándar sin pre-fijación de isquemia fría, y "isquemia" denota un período de isquemia fría de 1 hora antes de habitaciones las 24 horas fijación de la temperatura. Las medianas están representados por líneas horizontales, las cajas en parcelas corresponden a la 25
º y 75 percentiles de cada distribución, los bigotes se extienden hasta el valor más extremo que es menos de 1,5 veces la distancia entre el primer y el tercer cuartil, y datos más allá de los bigotes se muestran como puntos.
resultados
H-puntuaciones de todos los marcadores están representados gráficamente en diagramas de caja Figura 1, y los resultados de las pruebas de comparación se muestran en la Tabla 2 .
son muy pocos los casos mostraron ninguna tinción apreciable para tres de los marcadores (BRAF V600E, pMEK1 /2, y pAKT), pero dos casos eran claramente positivo para la mutación BRAF V600E, un hallazgo confirmado por análisis molecular (datos no mostrados). En general, el protocolo 2 + 2 produjo tanto o más señales IHC que el tratamiento de 24 horas, con tinción resultados representativos se muestran en la Figura 2. Mientras que varias diferencias específicas de cada caso se resaltan en la figura 2, no hubo diferencias estadísticamente significativas observadas en múltiples comparaciones pareadas a través de los 24 casos (Tabla 2). La Tabla 2 muestra que dos marcadores parecían tener poco aumento de la tinción en el tratamiento de 24 horas (EGFR y Perk), pero una vez más, estas diferencias no fueron estadísticamente significativas, ni tampoco los patólogos que califican las muestras encuentra cualquier caso en que la tinción de discrepancia entre el 2 + 2 y las condiciones de 24 horas daría lugar a un cambio en la interpretación fisiopatológica de estos dos marcadores.
los resultados representativos del análisis de IHC de dos muestras de carcinoma de colon sometidos a ya sea la condición de fijación rápida ( "2 + 2") o estándar 24 condición de temperatura ambiente -horas sin pre-fijación de isquemia fría ( "24 horas"). Perk, pMTOR, pMEK1 /2 y pPRAS40 se muestran para un caso y pBAD y pAKT se muestran desde un segundo caso. Dos casos diferentes se muestran aquí porque no todos los casos mostraron tinción para todos los marcadores. Todas las micrografías se toman a 200 × con exposiciones equivalentes.
La señal de IHC se vio afectada mucho más perjudicialmente por el período de isquemia fría ya 1-hora antes de la fijación en comparación con los protocolos de intervalos isquémicos más cortos, con la única excepción de EGFR. Estas tendencias fueron estadísticamente muy significativo para pEGFR y pMSK1, y la reducción de la tinción de pERK acercaron a la significación estadística. En dos casos en específico, que se muestran en las figuras 3 y 4, los carcinomas que albergan la mutación BRAF V600E se encontró que eran claramente positivos para pEGFR tanto de las condiciones de intervalo isquémicos más cortos, pero tinción fue casi completamente ausente cuando la muestra se expuso a la ya 1 hora de isquemia fría condición.
imágenes representativas de un caso de carcinoma de colon teñidas con anticuerpos para BRAF V600E, pEGFR, EGFR, y pMSK1, que muestran una pérdida significativa de tinción pEGFR en la condición de la isquemia. Todas las micrografías se toman a 200 × con exposiciones equivalentes.
Representante de un segundo caso de carcinoma de colon teñidas con anticuerpos para BRAF V600E, pEGFR, PTEN, y pMSK1, mostrando una pérdida significativa de tinción pEGFR en la isquemia condición. Todas las micrografías se toman a 200 × con exposiciones equivalentes.
Discusión
Los resultados de este estudio demuestran claramente que un post-quirúrgica, antes de la fijación del intervalo de isquemia fría sustancial (una hora ) confunde el intento de identificar los estados de fosforilación de un elemento clave vía de la PI3 quinasa en tejido fijado con formalina. Este hallazgo es consistente con los informes anteriores que indican la sensibilidad preanalítica significativo de ensayos de fosfoproteína [7], [18]. Si se emplea la manipulación de muestras cuidado para reducir al mínimo el intervalo de frío isquémica (menos de 17 minutos), sin embargo, tanto 24 horas fijación con formalina temperatura ambiente y nuestro rápido protocolo de fijación de dos temperaturas preservar señales de fosforilación promedio para esencialmente todos los marcadores investigados. ¿Por qué algunos marcadores fueron más afectadas por la isquemia fría es claro para nosotros; el equilibrio entre la quinasa sin obstáculos y la actividad de la fosfatasa durante los intervalos de isquemia fría no es probable que juegue a cabo de forma idéntica para cada objetivo fosforilación, sin embargo, por lo que la identificación de los objetivos con sensibilidades exageradas a isquemia fría a través de estudios como éste será de vital importancia como el campo de avances de inmunohistoquímica fosfoproteína.
Cuando prefijación tiempo de isquemia fría se extiende a la hora considerará un intervalo aceptable en las actuales directrices de la ASCO /CAP para las pruebas de ER [3], se encontró que la señal de fosfoproteínas seleccionados disminuye significativamente. En concreto, en dos ejemplares encontrado para albergar la mutación BRAF V600E (Figuras 3 y 4), el intervalo de isquemia fría de 1 hora apareció a oscurecer la expresión de pEGFR, un error que podría dar lugar a la falta de identificación de estos pacientes como candidatos para adicional la terapia [12], [13], [19]. En estos dos casos, la rápida protocolo de fijación de dos temperaturas produjo visiblemente más tinción pEGFR que el protocolo de fijación 24 horas, lo que indica que la rápida protocolo podría ser una metodología más robusta para la evaluación de este estado de activación de biomarcadores clínicamente significativa. Una tendencia similar se observa en algunos marcadores adicionales (por ejemplo. PBAD, pAKT) en los casos seleccionados se muestran en la Figura 2. Este hallazgo acentúa claramente el impacto potencial de la muestra preanalíticos manipulación en la era de la medicina personalizada, ya que la preservación de los estados de activación biomarcador parece ser relativamente constante, en promedio, entre los protocolos de fijación para algunos biomarcadores, pero difiere sustancialmente para casos específicos
.
Varios estudios han identificado ahora que la reactivación vía MAPK constituye un mecanismo de resistencia a la terapia en BRAF V600E mutado carcinomas colorrectales que son tratados con vemurafenib [1], [20], [21].
In vitro
y modelos de xenoinjerto indican que este estado de resistencia podría ser superado por la terapia dual incluyendo inhibidores de EGFR dirigidos a pEGFR, pero este enfoque se basa en la capacidad de los diagnósticos para identificar pEGFR sobreexpresión en la muestra de tejido clínica. Mientras que la literatura existente indica que la terapia dual se encuentra gran beneficio potencial para los pacientes con estos fenotipos tumorales específicos, nuestros resultados indican que todo esto es posible beneficio en riesgo si se emplea un proceso de conservación y fijación de tejido incontrolado. Los dos pacientes cuyos carcinomas albergaban mutaciones BRAF V600E, por ejemplo, podría no ser identificados como candidatos para la terapia EGFR-dirigida tenían sus muestras recogidas con un intervalo de horas de isquemia fría ya que no sólo se ve en las áreas de patología clínica, pero es también se consideran aceptables en una cantidad actual análisis de biomarcadores de cáncer. Más allá de estas consideraciones clínicas, es también vale la pena considerar los costes extremos asociados a terapias novedosas, de manera que no identificar pacientes como candidatos para terapias podrían ser no sólo personalmente perjudiciales sino también un derroche económico.
Además de la BRAFV600E ejemplo /pEGFR , también es de destacar que la expresión perk se disminuye después de 1 hora de isquemia fría (ver Tabla 2). Desde pERK se ha utilizado para controlar la eficacia de terapia, este efecto, si está presente en un ensayo clínico, podría potencialmente afectar monitorización de la terapia. También los casos, en seleccionados (Figura 2), la expresión pBAD aparente puede ser reducida por la isquemia clasificación previa, confundiendo nuestra capacidad para evaluar la expresión de un factor conocido por ser relevante para la patogénesis del cáncer de colon [19].
Uno potencial debilidad de este estudio es que se estudiaron relativamente pocas muestras. Aunque se analizaron todas las muestras para todos los marcadores, el alto costo y la dificultad de obtener muestras con tratamientos preanalíticos definidos con precisión de nuestro proveedor comercial impedían el estudio de más muestras. Claramente, los estudios adicionales de mayor tamaño sería beneficioso para confirmar estos hallazgos. También podría esperarse un trabajo sobre modelos de xenoinjertos ser beneficioso en esta área, y ha sido hecho por lo que en nuestro trabajo anterior sobre este tema [11] debido al control exquisito sobre las condiciones preanalíticas que es posible en esos sistemas. Sin embargo, se optó por trabajar en muestras clínicas aquí debido a su mayor relevancia a los problemas actuales de la investigación traslacional del cáncer. Debe tenerse en cuenta que los tiempos de isquemia fría medios de 10 minutos de las muestras recogidas en virtud de este protocolo de investigación no se observan típicamente en las actuales prácticas de anatomía patológica, así como cualquier tipo de tiempos de isquemia fría rápidas ser alcanzables con los procesos actuales en vigor en los laboratorios clínicos. Si bien puede ser un reto para incorporar nuestros hallazgos en flujos de trabajo clínicos estándar debido a que muchas instalaciones médicas actuales no son capaces de reducir significativamente los tiempos de isquemia, creemos que nuestros datos indican que la estandarización y optimización de las condiciones preanalíticas es al menos un objetivo valioso.
Otra debilidad potencial es que las puntuaciones de señal a través de la fosfoproteína condiciones de tratamiento no se compararon mediante umbrales de puntuación validados clínicamente, simplemente porque no existen tales umbrales de los marcadores investigados aquí. Lo que observamos con nuestro enfoque semicuantitativo, sin embargo, fue que las señales se reducen a menudo drásticamente en las muestras con un intervalo isquémico larga clasificación previa, y que en los dos casos específicos que hemos discutido, el intervalo isquémico largo prefijación apareció para la ablación de todas las señales relevantes desde una crítica biomarcador. En estos casos, los protocolos de fijación controlados que investigaron señales conservados que probablemente ser interpretadas, en el juicio médico de dos patólogos en ejercicio, como fisiopatológico pertinentes a la terapia potencial.
Por último, aunque hemos interpretado las pérdidas de fosfoproteína IHC señales que indican efectos nocivos preanalítica, que podría ser el caso que los aumentos en la tinción de los artefactos eran verdaderos y que disminuyeron tinción estaba más cerca del verdadero estado
In situ
. Sin embargo, otros han demostrado que numerosos phosphomarkers, incluyendo pAKT, están claramente disminuidos en el contexto de la fijación de condiciones alteradas o isquemia fría [22], [23], por lo que nuestra interpretación no carece de precedentes. Si bien esta cuestión no puede resolverse sin futuro
in vivo
estudios, lo que es absolutamente claro a partir de este trabajo es que los cambios en los estados de activación aparentes de muchos biomarcadores de cáncer relevantes parecen ser sensibles a las variables preanalíticas comunes. De estas variables, el intervalo isquémica es quizás uno de los más importantes, y por lo tanto creemos que una mayor investigación y estudios clínicos deben incorporar controles que cubren este factor.
Información de apoyo sobre Table S1.
datos sin procesar H-score para todos los casos examinados en este estudio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0113608.s001 gratis (XLSX)