Extracto
MYC sobre-expresión tal como se determina mediante moleculares ha sido reportado como un biomarcador pronóstico favorable en el carcinoma colorrectal (CCR). Sin embargo el análisis de expresión MYC no está disponible en el entorno clínico de rutina. Hemos investigado si la inmunohistoquímica (IHC) para la proteína myc utilizando un novedoso disponible en el mercado anticuerpo monoclonal de conejo [Y69 clon], que está actualmente en uso clínico generalizado para el diagnóstico del linfoma podría ser utilizado para predecir el resultado de CRC resecado. Myc IHC se realizó en un microarray tisular (TMA) que comprende una cohorte retrospectiva de 1421 pacientes con CRC y obtuvo cegado como a todos los datos clínicos y patológicos. IHC también se realizó en un subcohort de sección CRCs enteros para evaluar características de tinción y concordancia con la expresión TMA. MYC se encontró sobreexpresión en 980 (69%) de los CCR y se asoció con el estadio del tumor y la reparación de ADN no coinciden /BRAF. Hubo acuerdo sustancial entre TMA y sección entera myc IHC (kappa = 0,742, p & lt; 0,01). CRC con MYC sobreexpresión demostraron mejoría en la supervivencia a los 5 años (93,2% vs. 57,3%), con el efecto modulado significativamente por el efecto dominante de la etapa del tumor, la edad al momento del diagnóstico y el estado del espacio invasión linfovascular en la supervivencia. Llegamos a la conclusión de que el estado de myc como se determinó por IHC solo se puede utilizar para predecir la supervivencia global en pacientes con CCR sometidos a resección quirúrgica
Visto:. Toon CW, Chou A, Clarkson A, K DeSilva, Huang M, Chan JCY , et al. (2014) La inmunohistoquímica para Myc predice supervivencia en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (2): e87456. doi: 10.1371 /journal.pone.0087456
Editor: Nathan A. Ellis, de la Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 4 de octubre de 2013; Aceptado 27 de diciembre de 2013; Publicado: 4 Febrero 2014
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Financiación:. Patología del Norte Fondo Fiduciario del personal especialista. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
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Introducción
La desregulación de MYC (HGNC: 7553). es una consecuencia anticipada de la activación de mutaciones en APC (HGNC: 583), una mutación factor clave en la ruta de adenoma-carcinoma en el cáncer colorrectal (CCR). Mediada por beta-catenina a través de la vía Wnt canónica, aberrante sobre-expresión de MYC y ciclina D1 resultados en la proliferación celular incontrolada, que confiere una ventaja de crecimiento a las células cancerosas [1], [2]. El papel de MYC sobre-expresión en la conducción CRC tumorigénesis ha sido confirmado por estudios de perfiles de expresión génica [3], y más recientemente por el análisis de todo el genoma CRC como parte de la iniciativa del Genoma del Cáncer Red Atlas [4].
Curiosamente MYC sobreexpresión determinado por análisis de transferencia de Northern se informó como un biomarcador de buen pronóstico en el cáncer colorrectal ya en 1996. [5] en la actualidad su uso como biomarcador pronóstico es difícil de justificar debido a la limitada disponibilidad y el costo participan de las pruebas moleculares. Por lo tanto, las pruebas de MYC sobre-expresión en CRC no está disponible, posible o justificados en el entorno clínico de rutina.
Recientemente, un nuevo anticuerpo monoclonal de conejo muy sensible y específico dirigido contra la proteína myc (Y69 clon) se ha convertido disponible. Este anticuerpo ha sido validado en la práctica clínica de rutina en tejido incluido en parafina formol fija, donde myc immunohistochemsitry en combinación con técnicas de inmunohistoquímica BCL2, se ha utilizado para identificar a los pobres de subgrupos de pronóstico del linfoma no Hodgkin conocido como "doble golpe linfoma '. [6], [7] De hecho MYC y la expresión de BCL2 según lo determinado por immunohistochemsitry en formalina incluido en parafina tejido fijado ha convertido rápidamente en parte de la evaluación de diagnóstico de rutina de los pacientes con linfoma de células B de alto grado. [8].
Hemos tratado de volver a examinar el uso de la expresión de MYC como biomarcador en el CCR mediante la correlación de los resultados con la expresión de MYC según lo determinado por este anticuerpo monoclonal de conejo ampliamente disponibles.
Materiales y Métodos
Nuestra cohorte CRC se ha descrito anteriormente. [9] En resumen, los casos de CCR retrospectivos fueron reclutados mediante la búsqueda en la base de datos de patología del Departamento de Anatomía Patológica, Hospital Royal North Shore, de Sydney para los pacientes que tuvieron operaciones definitivas para CRC entre 2004 y 2009. Durante este período, este centro realiza la prueba patológica centralizado durante dos hospitales de referencia cuaternario con unidades de cirugía colorrectal dedicados y 4 hospitales de la comunidad. Por lo tanto esta cohorte de pacientes representa una verdadera instantánea de los casos de CCR encontró en la comunidad australiana en su conjunto.
Los criterios de exclusión fueron los tumores de localización extra-colónica y apendicular, los tumores tratados exclusivamente por vía endoluminal y tipos histológicos distintos de adenocarcinoma definido por el sistema de la OMS de 2010. [10].
Los tumores fueron revisados de forma independiente por tres patólogos (CT, KDS y AG) para confirmar el diagnóstico y para escenificar los tumores de acuerdo a 7
ª edición de 2009 del AJCC /TNM. [11] Para las resecciones implican tumores sincrónicos, fue seleccionado y anotado el tumor con el estadio patológico más alto. microarrays de tejidos (TMA) que contienen duplicado de 1 mm núcleos A continuación, se construyen a partir de bloques de tejido tumoral disponibles
La inmunohistoquímica se realizó en el TMA utilizando un anticuerpo disponible en el mercado de conejo anti-myc (Y69 clon, gato:. ab32072, Abcam, Burlingame CA, EE.UU.) utilizando el sistema de tinción automática Leica BondIII (Leica Microsystems, Mount Waverley, Victoria, Australia) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los portaobjetos se eliminó la cera en solución Bond desparafinar (AR9222, Leica Microsystems) y se hidrataron en la solución de lavado Bond (AR9590, Leica Microsystems). El calor inducido por la recuperación de epítopo se llevó a cabo durante 60 minutos en una solución alcalina de recuperación del fabricante ER2 (VBS parte no: AR9640, Leica Microsystems). Los portaobjetos se incubaron después con el anticuerpo primario a una dilución de 1 en 100 durante 30 minutos a temperatura ambiente. La detección de anticuerpos se realizó mediante el sistema biotina libre Bond Polymer Definido detección (DS9713 Leica Microsystems) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las láminas fueron counterstained con hematoxilina.
MYC sobre-expresión fue evaluada por IHC myc, anotó el uso de un sistema visual de dos niveles por un patólogo quirúrgico practicar (CT) cegado a toda la información clínica, patológica y el resultado. tinción nuclear de cualquier intensidad en más del 10% de las células neoplásicas se puntuó como positivo (sobre-expresado). Todos los otros patrones de tinción fue evaluado como negativo. Un control externo (un linfoma amplificada MYC) se llevó a cabo con cada serie de diapositivas.
desajuste de reparación del ADN (MMR) y el estado de BRAF IHC se determinó por inmunohistoquímica, como se describe anteriormente [9], [12].
con el fin de examinar la precisión de la interpretación TMA IHC, Myc IHC se realizó en secciones enteras de CRC en un subcohort de 98 CRC consecutivos a partir de 2004, interpretado por el mismo evaluador en TMA (CT) cegado a todos los clínicos, patológicos y TMA datos.
Correlación entre MYC sobre-expresión y variables clínico de pacientes de CRC se examinaron en 2 × 2 tablas contingengy para las variables categóricas o utilizando el test de Mann-Whitney para la edad (Tabla 1). Las variables que mostraron una significación de p & lt; 0,10 se incluyeron en un modelo de regresión logística binaria para examinar más a fondo la relación entre MYC sobre-expresión y la reparación de genes de ADN (MMR) /BRAF estado de IHC fenotipo (Tabla 2) guía empresas.
el seguimiento se obtuvo mediante el examen de los registros médicos del hospital, los de las habitaciones privadas de los cirujanos y los avisos de defunción y obituarios archivo público en el estado de Nueva Gales del Sur, Australia. La supervivencia global se define como la duración vivo desde el momento de la cirugía definitiva. Los pacientes fueron seguidos hasta la muerte o la última fecha de seguimiento no más de 7 años después de la cirugía definitiva. Se utilizó el análisis
Kaplan Meier reportar supervivencia general a 5 años para los CRC con y sin sobre-expresión de MYC , con la diferencia evaluado por Log Rank Test. regresión de Cox multivariable se utilizó para estudiar la asociación entre el efecto ajustado de MYC sobre-expresión en la supervivencia global, en un modelo completo que incluía la edad al momento del diagnóstico, el género, la localización anatómica del tumor, el estadio tumoral, la deficiencia combinada de reparación de genes y BRAF en IHC, el tamaño del tumor, el grado histológico, la presencia o ausencia de invasión del espacio linfovascular y el estado de respuesta de los linfocitos peritumoral
a p. & lt; 0,05 se tomó como significativo, excepto en el modelado inicial mediante regresión logística binaria (mencionado anteriormente). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando v21 IBM SPSS Statistics en OSX.
Resultados
Un total de 1421 CRC se evaluaron en TMA. Las características clínicas y patológicas se resumen en la Tabla 1. En pocas palabras, había aproximadamente la misma distribución de género, con una edad media de diagnóstico a los 74 años (rango 17-100 años). La supervivencia global a los 5 años para la cohorte fue de 66,3%, con una media de 52,9% (IC del 95% = 5,14-5,44).
Myc IHC mostró consistente inmuno-localización nuclear, y no había una distinción visible entre los casos que fueron negativos (anotaron como negativo para la sobre-expresión), y las que mostró débil a fuerte tinción en 10% o más células neoplásicas (anotaron como positivas para la sobre-expresión). Ejemplos de características myc tinción IHC se presentan en la Figura 1. La prevalencia de la sobre-expresión de MYC en el CCR fue del 69%.
Las características clínicas y patológicas de myc negativo IHC (n = 441, 31,0% ) y myc IHC positivo (mYC sobre-expresan, n = 980, 69,0%) CRC se resumen en la Tabla 1. mYC sobre-expresión se asoció significativamente con el estadio del tumor y el fenotipo MMR /BRAF IHC, pero no de género, localización anatómica, histológica grado, presencia o ausencia de invasión del espacio linfovascular, ni el estado de reacción de linfocitos peritumoral. La relación entre MYC sobre-expresión y la edad al momento del diagnóstico tendencia a la significación (p = 0,07).
La Tabla 2 muestra el efecto ajustado de de MMR /BRAF IHC fenotipo sobre el estado de IHC myc. MYC sobre-expresión está fuertemente asociada con el fenotipo MMRD /BRAFV600E IHC [odds (IC del 95% = 1,45-3,24) ratio = 2,17, p & lt; 0,01].
La supervivencia a 5 años para los CRC con MYC más -expresión fue de 93,2% (en general 50
º percentil de supervivencia 3,06 años, rango intercuartil 0,56 a 5,22), en comparación con myc CRC negativo de 57,3% (en general 50
º percentil de supervivencia de 2,32 años, rango intercuartil 0,31-4,26) .
El efecto del estado myc en la supervivencia global CRC se muestra en la Figura 1. Los CRC con mYC sobreexpresión mostró una supervivencia significativamente mayor en comparación con los casos negativos myc (test de rangos logarítmicos p & lt; 0,01), con un efecto de crudo relación (univariable modelo) de la peligrosidad del 0,67 [(IC del 95% = 0,54-0,83), p & lt; 0,01]. Este efecto sobre la supervivencia global de crudo se mantuvo significativa incluso cuando se estratificó por MMR /BRAF IHC fenotipo [hazard ratio = 0,68 (IC del 96% = 0,54 a 0,84), p & lt; 0,01].
En el modelo multivariable completo, la efecto ajustado de MYC sobre-expresión en la supervivencia global fue insignificante [hazard ratio = 0,91 (95% CI = 0,69-1,20), p = 0,52], debido al efecto dominante de la edad al momento del diagnóstico, el estadio del tumor y el estado del espacio invasión linfovascular y la MMR deficiente /BRAFV600E mutante fenotipo IHC en la supervivencia (Tabla 3). La Tabla 4 muestra el modelo completo que incluye la interacción entre myc IHC y el estado MMR /BRAF
Hubo acuerdo sustancial entre TMA y sección entera myc resultados de IHC. (Kappa = 0,742, p & lt; 0,01) . Todos los casos de TMA positivos fueron positivos en secciones enteras. Hubo 11 casos discordantes (negativos en TMA y positivo en la sección de conjunto), debido a la tinción irregular. de regresión de Cox univariable también se realizó en secciones enteras, lo que confirma la mejora de la supervivencia global de los CCR que muestran MYC sobre-expresión (Figura 2)
Panel A:. Las curvas de Kaplan-Meier que muestran la supervivencia general de los CCR con MYC sobreexpresión en comparación con myc CRC negativos (Log Rank test, p & lt; 0,01); Panel B:. El análisis de regresión de Cox muestra Univariable MYC sobre-expresión correlacionó significativamente con una mejor supervivencia global [hazard ratio = (IC del 95% = 0,15-0,60) 0,30, p & lt; 0,01]
Discusión
estudios anteriores sobre la expresión de MYC en CRC han sido inconsistentes y contradictorios presumiblemente debido a la utilización de pequeñas cohortes (n entre 38 y 310) y el uso de una variedad de métodos de detección que incluyen IHC, hibridación fluorescente in situ ( FISH), basado en el análisis de RNA y DNA número de copias. [5], [13] - [17]. Estudios previos utilizando IHC se han limitado por el uso de anticuerpos que demostraron aberrante (citoplásmica) inmuno-localización presumiblemente debido a la mala especificidad. [18].
El desarrollo y la validación de un anticuerpo monoclonal de conejo altamente específico para myc ha tenido un impacto importante en el diagnóstico de linfoma donde la combinación de MYC y la sobreexpresión BCL2 según lo determinado por inmunohistoquímica solo se ha utilizado para definir una grupo pobre pronóstico de células B linfoma no Hodgkin conocido como linfomas doble golpe. [6], [7] Curiosamente, en estos estudios linfoma donde myc IHC y FISH evaluación han dado lugar a resultados contradictorios, MYC expresión según lo determinado por IHC ha habido un mejor predictor del resultado que el oro anterior norma FISH. Presumiblemente, esto se debe a MYC sobre-expresión puede ser debido a una variedad de procesos celulares en lugar de sólo la amplificación simple.
En este contexto, nuestro estudio, que se basa en una cohorte muy grande y no seleccionado en 1421 cohortes CRC el uso de esta nueva generación de anticuerpos monoclonales específicos de conejo, demuestra la alta prevalencia de mYC sobre-expresión en los CRC, y lo más importante, el papel potencial de myc como un poderoso biomarcador pronóstico en el CCR. El hecho de que la sobre-expresión de MYC se asoció significativamente con una mejor supervivencia global en el análisis univariable es quizás sorprendente, dada la comprensión actual del potencial tumorigénico de MYC desregulación [1] - [4]. Sólo un estudio previo ha demostrado este efecto en el CCR [5]. Si bien no hay datos suficientes para postulan que el mecanismo subyacente, la correlación entre el potencial tumorigénico (oncogénesis) y la supervivencia, al menos por MYC, es como ser más compleja de lo que se pensaba inicialmente.
En este estudio hemos elegido para examinar MYC sobre-expresión en el contexto de CRCs agrupados según su MMR y el estado de BRAF, en lugar de estado MMR y BRAF individualmente. Está bien establecido que la triple vírica y BRAF interactúan de manera compleja en cuanto a su efecto sobre la supervivencia. Por ejemplo, en MMR CRCs de dominio, la presencia de la mutación BRAFV600E confiere una supervivencia peor, mientras que en MMR CRCs deficientes, BRAFV600E es un marcador del fenotipo methylator, un grupo de CRC, que muestran excelente pronóstico [12], [19].
Curiosamente, a pesar MYC sobre-expresión está fuertemente asociada con el fenotipo /BRAFV66E MMRD, su falta de interacción en el modelo multivariable completo muestra que el efecto de MYC en la supervivencia no puede explicarse completamente solo por su asociación con MMR estado /BRAF . Esto sugiere que el efecto de predicción de MYC sobre-expresión en la supervivencia está mediado en parte, por mecanismos independientes de la condición de MMR /BRAF.
Uno de los principales inconvenientes de nuestro estudio es la simplificación sobre por que MYC sobre -expresión se determina. La naturaleza semi-cuantitativa de IHC es tal que los cambios en la intensidad de IHC tienen que ser significativa (en la escala logarítmica, también conocida como la ley de Weber-Fechner) con el fin de que el ojo humano sea capaz de apreciar un cambio. Este método de puntuación de IHC embargo, no presta a un análisis correlativo más sencillo como la regresión logística binaria, y es la metodología predominante por el cual la mayor parte de IHC se anotó en el entorno clínico de diagnóstico. De manera significativa, a pesar de este inconveniente, pudimos demostrar diferencias significativas de supervivencia global en el análisis univariable de la condición de IHC myc.
Otro inconveniente importante es la falta de resultados específicos de la enfermedad y la mortalidad específica por cáncer en nuestro estudio de cohortes. Futuros estudios que emplean estos criterios de valoración proporcionarán información importante que puede informar de manera significativa en la práctica clínica.
En resumen, nuestro estudio muestra que el estado myc, según lo determinado por IHC utilizando una sencilla metodología de puntuación semicuantitativa fácilmente desplegado en la clínica ajuste se puede utilizar como un predictor de pronóstico en el CRC. El refinamiento de esta utilidad predictiva espera una aclaración adicional en las cohortes con los resultados específicos de la enfermedad.