Extracto
El hialuronano (HA), una unidad de disacárido simple, puede polimerizar y se considera un componente principal de la matriz extracelular, que tiene una amplia gama de funciones biológicas. En los últimos años, HA se encuentra en la superficie de las células tumorales. De acuerdo con informes anteriores, diferente contenido de HA en la superficie celular de las células tumorales está estrechamente relacionado con metástasis en los ganglios linfáticos, pero los mecanismos que median este proceso sigue siendo poco clara. Esta investigación destinada a estudiar el contenido de la superficie de HA en las células tumorales y analizar los cambios de adhesivo celular causado por la interacción entre HA y su receptor endotelial linfático (LYVE-1). Hemos examinado y observado alto contenido de HA en células de mama HS-578T y bajo contenido de HA en células MCF-7 de mama a través de la exclusión de partículas, inmunofluorescencia y citometría de flujo experimentos. La expresión de LYVE-1, el receptor específico de HA linfático-buque, fue consistente con nuestro informe anterior y mejoró la adhesión de HA
pilas de gran-HS-578T a COS-7
LYVE-1 (+) a través de HA en la adhesión celular estática y experimentos cámara de flujo de placas paralelas dinámicas. MCF-7 células de mama contienen poco de HA en la superficie; Sin embargo, nuestros resultados mostraron poca diferencia adhesión entre células MCF-7 y COS-7
LYVE-1 (+) y células COS-7
-1 LYVE (-) de las células. Se observaron resultados similares en relación con la adhesión de las células HS-578T o células MCF-7 a SVEC4-10 células. Asimismo, se observó por primera vez que el contenido de HA de la superficie celular de las células tumorales alta transferencia era rico, y visualizamos la reticulación de estructuras de cables de alta disponibilidad, que pueden activar LYVE-1 en las células endoteliales linfáticas, que promueve la adhesión tumoral. En resumen, el contenido de HA de la superficie celular de máximos y mínimos de las células tumorales a través de la interacción con LYVE-1 conduce a la adhesión diferencias
Visto:. Du Y, Liu H, He Y, Liu Y, Yang C, Zhou M , et al. (2013) La interacción entre LYVE-1 con ácido hialurónico en la superficie celular puede desempeñar un papel en la diversidad de adhesión a las células cancerosas. PLoS ONE 8 (5): e63463. doi: 10.1371 /journal.pone.0063463
Editor: Nikos K. Karamanos, Universidad de Patras, Grecia
Recibido: 13 Enero, 2013; Aceptado: 3 Abril de 2013; Publicado: 22 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Du et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Comité de Shangai de la Ciencia y la Tecnología (No.10411950500), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81071814, 81172027, 81272479) y el Programa de Shanghai Asunto Jefe Científico (11XD1404000). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
invasión y metástasis son las características biológicas más importantes de los tumores malignos. adhesión de células tumorales juega un papel importante en la invasión tumoral y metástasis, incluyendo la conexión entre las células tumorales a sí mismos y entre las células tumorales con otros tipos de células. La transferencia de células tumorales implica la adhesión y separación (adherencia despolimerización). En la etapa temprana de la invasión tumoral, las células tumorales individuales se desprenden del tumor primario debido a la pérdida factor de adhesión, que genera el potencial de transferencia de las células cancerosas. Durante la etapa media de la invasión, las células tumorales que fueron transferidos en el sistema de circulación se adhieren a las células endoteliales vasculares y la matriz extracelular. Este proceso implica muchos factores de adhesión y varios otros factores que promueven o adhesión por separado, tales como moléculas de adhesión celular (CD44, cadherina). Este estudio analiza principalmente problemas de adhesión con células tumorales y las células linfáticas endoteliales.
El hialuronano (HA) se compone de una repetición lineal de unidades de disacárido que consiste en ácido D-glucurónico y N-acetilglucosamina y es el componente principal de la matriz extracelular. En condiciones fisiológicas, HA se distribuye principalmente en el tejido conectivo con muchas otras proteínas para formar una red grande y complicado que mantiene el espacio entre las células, tales como la propia mucosa lámina y la membrana externa alrededor de los vasos sanguíneos en la distribución de la piel [1], [2 ]. Muchos estudios han demostrado que el HA afecta a la angiogénesis tumoral, la metástasis y la invasión. In vivo estudios encontraron que antes de la migración, las células aumentaron su concentración de HA en su lugar de partida [3], [4]. Además, HA se encontró para aumentar en el borde invasión de células de cáncer de mama [5], [6] y en el entorno extracelular [7], que reorganiza la matriz de las células tumorales invasoras. Un gran número de resultados experimentales han demostrado que los tumores agresivos contienen altos niveles de HA y que el aumento de los niveles de HA en tumores sólidos están relacionados con pobre diferenciación del tumor y una reducción en la tasa de supervivencia de los pacientes. Estudios previos han encontrado que el aumento de HA fue producido por los fibroblastos circundantes después de la estimulación por las células de cáncer de mama [8]. Sin embargo, las células tumorales invasoras mismos también podrían sintetizar HA en la superficie celular. Muchos estudios se centran en la correlación de la cantidad de HA en la superficie de células tumorales a su metástasis y han encontrado que la capacidad de las células tumorales para transferir estaba relacionada con su contenido de HA de superficie [9], [10]. Itano et al [10] por vía intravenosa inyectaron células mamarias que producen HA y células de mama mutantes que no podían producir HA en ratones desnudos. Ellos encontraron que los clones mutantes muestran una disminución significativa en la capacidad metastásica en comparación con las células parentales después de la inyección intravenosa (i.v.) en ratones singénicos. Expresando hialuronano sintasa de ratón 1 (HAS1) por transfección en HAS
- células defectuosas en la actividad de hialuronano sintasa rescatados formación de la matriz hialuronano, así como la producción de hialuronano. Las metástasis pulmonares después de la administración i.v. inyección de transfectantes Has1 también se recuperó de manera significativa. Muchos informes han confirmado que el contenido de HA en la superficie de células tumorales fue relacionada con la velocidad de transferencia de células [9], [10], [11]. Específicamente, los altos niveles de células de cáncer causa HA superficie para transferir rápidamente, y los bajos niveles de HA hacen que las células tumorales para transferir lentamente.
La literatura existente apoya la relación entre el contenido de HA en la superficie de células tumorales y la metástasis linfática tumor. Sin embargo, la regulación de la adhesión tumoral, metástasis linfática y la velocidad de transferencia de superficie celular HA sigue siendo poco clara. Estudios relativos a transferencia a través de la vía de sangre mostraron que las células tumorales en combinación con la composición específica de la superficie celular endotelial vascular promueve las células tumorales y la adhesión celular endotelial vascular [12], [13]. Por otra parte, la velocidad de transferencia del tumor y la tasa de adherencia se relacionaron positivamente. Los estudios también han encontrado que el CD44, un receptor de HA de la superficie celular endotelial ampliamente expresado, afectó a la adhesión de células tumorales y linfocitos. estudios de campo metástasis linfática confirmaron que los niveles altos de la superficie de HA en células de melanoma de ratón promueven la transferencia rápida a los ganglios linfáticos, y los niveles bajos de la superficie de HA en células de melanoma de ratón se correlacionaron con la metástasis a los ganglios linfáticos lento [9]. células endoteliales linfáticas tienen un receptor de ácido hialurónico linfático específico denominado receptor de la célula endotelial 1 ácido hialurónico (LYVE-1) [14]. LYVE-1 se planteó la hipótesis de tener un efecto que es similar a CD44 en las células endoteliales de sangre, que es facilitado por la interacción con HA superficie de la célula tumoral y las influencias adhesión de células tumorales. Sin embargo, el mecanismo por el cual la superficie de células tumorales HA actúa sobre LYVE-1 para afectar a su adherencia y la transferencia en el tumor de metástasis linfática sigue siendo poco clara.
En este estudio, la función biológica de la interacción entre LYVE-1 y tumor se investigó celular hA superficie en la adhesión de células de cáncer. células HS-578T que contienen HA de alto en su superficie (HA
altos-HS-578T) y células MCF-7 que tienen poco de HA en la superficie (HA
bajo MCF-7) fueron seleccionados. COS-7 transfectadas con LYVE-1 (COS-7
LYVE-1 (+)) y SVEC4-10 células (una línea celular de tipo célula endotelial linfático) se utilizaron como los modelos para estudiar el efecto de adherencia entre LYVE -1 células y tumorales que expresan niveles altos o bajos de HA. células HS-578T y células MCF-7, como las células superiores, se adhieren de forma independiente a la subcapa de células COS-7
LYVE-1 (+) y las células 7 COS transfectadas con control de pEGFP-N1 vector (COS-7
LYVE-1 (-) Unidos) bajo estáticas y dinámicas. Los resultados mostraron que HA, presente en la superficie de las células tumorales, mediada la adhesión de células tumorales a células COS-7
LYVE-1 (+) y células
COS-7 LYVE-1 - células (). HA
células de cáncer de mama de alto HS-578T tenía una mayor adhesión a células COS-7
LYVE-1 (+) de COS-7
LYVE-1 (-) de las células a través de la interacción entre el HA y endotelial linfático celda específica del receptor de ácido hialurónico LYVE-1. Además, las células MCF-7 de tumor de mama que carecen de superficie celular HA, básicamente, no se pueden adherir a través de HA y LYVE-1 de unión. También se observaron resultados similares en relación con la adhesión de las células HS-578T o células MCF-7 de células SVEC4-10.
Resultados
Visualización de la Formación pericellular Matriz de 6 células de cáncer de mama humano
El contenido de HA en células de cáncer de mama es significativamente diferente; Por lo tanto, HA presente en la superficie se visualizó usando un ensayo de partículas exclusión. En este ensayo, se observó una clara zona entre el HS-578T y MDA-MB-231 células y los eritrocitos fijos (Fig. 1A a, c). Además, se añadió 5 min después de Streptomyces hialuronidasa a la placa de cultivo, las capas de HA fueron degradados, permitiendo que las células rojas de la sangre para contactar HS-578T y MDA-MB-231 células directamente (Fig. 1A b, d). Además, estos datos son consistentes con el trabajo previo [15]. Nuestros resultados mostraron que MDA-MB-435S, MDA-MB-468, MCF-7, y SK-BR-3 células, que tienen una baja capacidad para la producción de HA, no fueron excluidos de los eritrocitos fijos (Fig. 1A E, G , I, K), y casi no se observó ningún cambio después de la adición de hialuronidasa (fig. 1A f, h, j, l). Para cuantificar el grosor de la matriz, se trazaron los contornos de las matrices y los límites celulares procedentes de 10 celdas individuales. espesor de capa se representó gráficamente para cada línea celular con y sin el tratamiento con hialuronidasa de Streptomyces (Fig. 1B). La relación media para cada condición se indica mediante una barra horizontal. Consistente con los resultados del experimento de exclusión de partículas, de inmunofluorescencia (Fig. 1C) y citometría de flujo (Fig. 1D) experimentos de manera similar demostraron que el contenido de HA en la superficie celular de HS-578T y MDA-MB-231 células era rico, y los otros cuatro células tenían bajo contenido de HA superficie.
(a) de visualización y análisis morfométrico de las matrices de HA se realizaron utilizando un ensayo de partículas exclusión antes y después de la adición de hialuronidasa de Streptomyces específico de HA. Una zona clara fue evidente entre el SA-578T, células MDA-MB-231 y los glóbulos rojos (a, c); Se añadió aproximadamente 5 minutos después de la hialuronidasa de Streptomyces a las células, las capas de HA fueron degradados, permitiendo que las células rojas de la sangre para contactar el HS-578T y las células MDA-MB-231 (B, D). No hay diferencia antes de (e, g, i, k) y después (f, h, j, l) la adición de Streptomyces hialuronidasa a MDA-MB-435S, MDA-MB-468, MCF-7 y SK-BR- se observó 3 células. retención (B) HA de superficie se cuantificó como la relación de área de la matriz de área de la celda. células de cáncer de mama individuales fueron rastreados utilizando Image Pro Plus 6 en el límite de la zona clara para calcular el área de la matriz y en el perímetro de células para calcular el área de la celda. relaciones Escudo de área /célula se representan como una distribución, con el valor medio representado por una barra horizontal. (C) Un experimento de fluorescencia de células inmunes se utilizó para detectar HA superficie celular. El brillo relativo representado el contenido de HA en la superficie celular. La luz fuerte se visualizó en el HS-578T y MDA-MB-231 células; A la luz de los otros cuatro tipos de células era básicamente indetectable. contenido de (D) HA también se evaluó mediante análisis de FACS. histogramas representativos se muestran para las células teñidas con HABP biotinilado y Alexa 488 marcado con avidina de HA en células no tratadas (rojo) o células tratadas con Streptomyces hialuronidasa (azul). Control de las células fueron teñidas únicamente con avidina marcada con Alexa 488 (negro).
Breast Cancer Cells HA
de alta HS-578T y HA
bajo MCF-7 Se adhieren de manera diferente bajo estático Condiciones
Como han demostrado los estudios anteriores, el experimento adherencia estática se utiliza a menudo para probar la diferencia adhesión entre diferentes moléculas y células. Para explorar la diferencia en la adhesión de células tumorales a células COS-7 a través de una interacción con la superficie de HA y LYVE-1, se realizó un ensayo de unión. La expresión correcta de LYVE-1 en células COS-7 se confirmó en nuestro estudio anterior [16]. HA
alta HS-578T y HA
-MCF-7 BAJO células marcadas con DAPI se aplicaron a células COS-7
LYVE-1 (+) y células COS-7
LYVE-1 (- ) las células para observar la adherencia estacionaria. Nuestros resultados mostraron que las células muchos HS-578T adheridas a estacionarias COS-7
células debido a la abundancia de moléculas de HA en su superficie, y el número de células que se adhirieron disminuyó cuando interactuaban con COS LYVE-1 (+) 7
LYVE-1 (-) de las células (Fig. 2A, a, b; 2B, e). Estudios anteriores utilizando Streptomyces hialuronidasa antes de que el ensayo de unión mostraron que HA participa en la adhesión del tumor [16]. En consonancia con este hallazgo, MCF-7 células, que tienen bajo contenido de HA de superficie, no mostraron diferencias en la adherencia a las células COS-7
células LYVE-1 (+) y COS-7
1-LYVE (-) de las células (Fig. 2A, c, d; 2B, f). SVEC4-10 células se verifican cuando una línea de células de tipo célula endotelial linfático [17] y son diferentes de las células COS-7; Por lo tanto, también a prueba la adhesión de células HS-578T y células MCF-7 de células SVEC4-10, que fue verificada como una línea celular de tipo célula endotelial linfático. Nuestros resultados mostraron que después de bloquear la interacción entre LYVE-1 y HA, se observó una ligera disminución en la adhesión entre las células HS-578T y SVEC4-10 células (Fig 2C, g-i;. 2D, m). No se observó diferencia entre células MCF-7 y SVEC4-10 células (Fig 2C, j-l;. 2D, n). Por lo tanto, estos resultados indican que la diferencia observada en la transferencia en los vasos linfáticos de células tumorales que expresan alta y baja HA puede ser debido a la adhesión distintivo para LYVE-1 en las células endoteliales linfáticas.
(A) se adhirieron HS- 578T y las células MCF-7 aparecen como esferas azules (a-D). células HS-578T marcadas con DAPI fueron más adherente a la monocapa confluente de células COS-7
LYVE-1 (+) en comparación con las células COS-7
LYVE-1 (-). MCF-7 células adheridas de manera similar con ambos COS-7
LYVE-1 (+) y células COS-7 LYVE-1 (-) las células. (B) se muestran las evaluaciones cuantitativas de MCF-7 de adhesión de células en la monocapa de células COS-7 HS-578T y, y cada ensayo se realizó por triplicado. Los resultados se muestran como la media ± SD de pocillos por triplicado de un experimento típico y se expresan como un aumento de veces en relación con células COS-7 transfectadas con el vector de control pEGFP-N1. * P & lt; 0,05 frente indica transfectaron pEGFP-N1 control de vectores células COS-7. (C) se adhirieron HS-578T y las células MCF-7 aparecen como esferas azules (g-l). células HS-578T marcadas con DAPI eran adherentes a la monocapa confluente de células SVEC4-10 antes y después de bloquear con LYVE-1 anticuerpo, anticuerpo de isotipo. (D) se muestran las evaluaciones cuantitativas de los datos de MCF-7 de adhesión de células en la monocapa de células SVEC4-10 HS-578T y, y cada ensayo se realizó por triplicado. Los resultados se muestran como la media ± SD de pocillos por triplicado de un experimento típico y se expresan como una disminución veces en relación con SVEC4-10 células sin tratamiento. * P & lt; 0,05 frente. SVEC4-10 células sin tratamiento
Breast Cancer Cells HS-578T y MCF-7 diferencialmente Adhiere en condiciones de flujo
arresto de células tumorales y la formación de estable interacciones de adhesión entre las células tumorales y las células endoteliales son pasos cruciales en el proceso metastásico. Para obtener más información sobre las propiedades de unión de las células del cáncer de mama a COS-7
LYVE-1 (+) y COS-7
LYVE-1 (-) las células, los estudios de adhesión similares a los descritos anteriormente se realizaron utilizando una cámara de flujo de placas paralelas en condiciones de esfuerzo cortante. Diapositivas con COS-7
LYVE-1 (+) y COS-7
LYVE-1 (-) las células se colocaron en una cámara de flujo de placas paralelas, y HS-578T o células MCF-7 se sometieron a perfusión bajo condiciones fisiológicas esfuerzo de corte. Como se muestra en la Fig. 3 (A, a, b; B, e), aumento de la adhesión similar de células HS-578T a COS-7
LYVE-1 (+) de COS-7
LYVE-1 (-) se observó células bajo condiciones de flujo bajo (0.1dyn /cm
2); sin embargo, las células MCF-7 células todavía de manera similar adheridas a ambos COS-7
LYVE-1 (+) y células COS-7
LYVE-1 (-) de las células (Fig 3A, C, D;. 3B, f) . Nuestros resultados también mostraron que después de bloquear la interacción entre LYVE-1 y HA, la adhesión entre células HS-578T y SVEC4-10 células disminuyó ligeramente en condiciones de flujo bajo (0,1 dyn /cm
2), como se muestra en la Fig. 3 (C, G-i; D, m). No se detectaron diferencias obvias entre células MCF-7 y las células SVEC4-10 (antes y después) de bloqueo (figura 3C, j-l;. 3D, n).
(A) El número de HS-578T y MCF-7 células adheridas a COS-7
LYVE-1 (+) y COS-7
LYVE-1 (-) células en 0,1 dinas /cm
2 estrés de baja cizalladura se evaluó contando 5 vistas al azar de imágenes microscopio de fluorescencia. Adherido HS-578T y las células MCF-7 aparecen como esferas azules (A-D). (B) se muestran las evaluaciones cuantitativas de los datos que representan la adhesión de células MCF-7 HS-578T y en la monocapa de células COS-7, y cada ensayo se realizó por triplicado. Los resultados se muestran como la media ± SD de pocillos por triplicado de un experimento típico y se expresan como un aumento de veces en relación con el control de pEGFP-N1 vector transfectadas células COS-7. * P & lt; 0,05 frente a las células transfectadas pEGFP-N1 COS-7 de control de vectores indicados. (C) El número de HS-578T y las células MCF-7 adherido a SVEC4-10 células antes y después de bloquear con LYVE-1 de anticuerpos, anticuerpos de isotipo a 0,1 dinas /cm
2 estrés de baja cizalladura se evaluó contando 5 al azar vistas de imágenes microscopio de fluorescencia (g-l). (D) se muestran las evaluaciones cuantitativas de los datos de MCF-7 de adhesión de células en la monocapa de células SVEC4-10 HS-578T y. Cada ensayo se realizó por triplicado. Los resultados se muestran como la media ± SD de pocillos por triplicado de un experimento típico y se expresan como una disminución veces en relación con SVEC4-10 células sin tratamiento. * P & lt;. SVEC4-10 0,05 frente a células sin tratamiento
La adhesión de HS-578T y las células MCF-7 de células COS-7
LYVE-1 (+) y COS-7
LYVE-1 (-) se midieron por separado las células fueron sometidas a diferentes intensidades de esfuerzo de cizallamiento, y los cambios en el número de células adhesivas. Se permitió que las células HS-578T para unirse a LYVE-1-transfectadas y las células de control en 0,1 dinas /cm
2 de 2 min y fueron expuestos a la creciente tensión de corte de hasta 13,54 dinas /cm
2 (fig. 4A; B, a). células HS-578T con alto contenido de HA siguen estando unidas a la COS-7
LYVE-1 (+) monocapa de células a niveles tensión de cizallamiento de hasta 5,4 dinas /cm
2 y comenzó a ser lanzado a las 13.54 dyn /cm
2. La cantidad de adhesión de células HS-578T a COS-7
LYVE-1 (+) células en comparación con las células COS-7
LYVE-1 (-) de las células era todavía más alto y no obviamente cambiado hasta que la tensión de corte alcanzó 13,54 dyn /cm
2. No hay diferencias significativas en el comportamiento de giro de las células MCF-7 a COS-7
LYVE-1 (+) y células COS-7
LYVE-1 (-) se observaron células (Fig 4A;. B, b) . Sin embargo, la adhesión de las células HS-578T a SVEC4-10 células (antes y después de bloqueo) difería de la adhesión a células COS-7. Una notable disminución de la adhesión se produjo entre las células HS-578T y SVEC4-10 células, que fueron tratados o tratados con IgG
anticuerpo de control de isotipo 2A cuando el esfuerzo cortante alcanzó 2,7 dinas /cm
2 (figura 4C;. D , c). Además, no se detectaron diferencias significativas en el comportamiento de giro de células MCF-7 a SVEC4-10 células (Figura 4C;. D, d).
HS-578T y las células MCF-7 fueron perfundidos sobre COS 7
LYVE-1 (+) y células COS-7
LYVE-1 (-) de las células en la pared de esfuerzos de cizalla de 0,1, 0,4, 2,7, 5,4 o 13,54 dyn /cm
2 de 2 min. (A) El número de células adherentes en el mismo campo se muestra como esferas azules. (B) Los resultados se muestran como el número relativo de células de células HS-578T (a) y MCF-7 células (b) capturados por las células COS-7
LYVE-1 (+) (línea roja) a COS-7
LYVE-1 (-) (línea azul) células. células HS-578T y MCF-7 fueron perfundidos sobre una monocapa confluente de células SVEC4-10 antes y después de bloquear con LYVE-1 de anticuerpos, anticuerpos de isotipo en la pared esfuerzos de cizalla de 0,1, 0,4, 2,7, 5,4 o 13,54 dinas /cm
2 durante 2 minutos. (C) El número de células adherentes en el mismo campo se muestran como esferas azules. (D) Los resultados se muestran como el número de células relativas de células HS-578T (c) y las células MCF-7 (d) captadas por las células SVEC4-10 bloqueo con LYVE-1 (línea azul), SVEC4-10 bloqueo con células control de isotipo (línea roja) hasta SVEC4-10 células sin tratamiento (línea de color negro). Las barras de error representan la media ± SD del número de células unidas. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes.
Alto HA-que expresan las células cancerosas forman estructuras de cables de hialuronano
cables HA pueden tener la misma capacidad para activar LYVE-1 como su capacidad para activar CD44 in vivo [18], y nuestros resultados, así como los resultados de los informes anteriores mostraron que algunas superficies tumorales contienen altos niveles de HA. Sin embargo, no estaba claro si HA en la superficie de las células tumorales desarrollan en estructuras de cables y desempeñar un papel en la activación LYVE-1. Por lo tanto, hemos intentado utilizar inmunofluorescencia para detectar cables HA en la superficie de las células tumorales. Hasta que las células del tumor alcanzó 100% de confluencia, se añadió HABP biotinilado a las células para detectar la distribución de HA. Los resultados mostraron que las células de cáncer de mama HS-578T y BT-549, cáncer de pulmón de células 95-D, células HeLa de carcinoma cervical, células RKO cáncer de colon y células de adenocarcinoma de pulmón A549 todos contienen altos niveles de HA y se desarrollan estructuras de cables (Fig . 5), que se había informado anteriormente que se producen en las células hK2. Después de usar Streptomyces hialuronidasa para degradar HA en la superficie del tumor, los cables HA de hK2 células se desaparecieron (Fig. 5). Del mismo modo, los cables de HA de las otras células también fueron abolidas por Streptomyces digestión hialuronidasa (datos no mostrados). cables de HA también no se detectaron en las células MCF-7, que tienen bajos niveles de HA superficie.
células monocapa confluente se cultivaron en presencia de 10% (v /v) de FCS antes de la fijación con metanol y la detección de HA mediante la adición de bHABP. Las secciones fueron imágenes por microscopía de fluorescencia invertida (20 × objetivo). cables HA están resaltados con flechas blancas. aumento original × 20. Streptomyces hialuronidasa se añadió a las células antes de la fijación. Los cables HA fueron degradados sin ser detectado.
Discusión
Este estudio ha demostrado el mecanismo mediado por HA regulación de la adhesión de las células tumorales a los ganglios células endoteliales. Se observó una diferencia significativa en la adherencia de la línea celular de cáncer de mama HS-578T, que expresa altos niveles de HA, con
LYVE-1 (+) células COS-7; Por el contrario, las células COS-7
LYVE-1 (-) las células transfectadas con el control del vector pEGFP-N1 no exhibieron esta alteración tanto en condiciones estáticas como de flujo. MCF-7 células que carecen de HA en su superficie adherida de la misma manera a COS 7-
LYVE-1 (+) como células COS-7
-1 LYVE (-) células. Un ligero cambio también se detectó en la adhesión de células HS-578T a SVEC4-10 células antes y después de la adición de anticuerpo bloqueante. Estos hallazgos sugieren que HA en la superficie del tumor puede participar en la metástasis de tumor de mama, influyendo en unión con LYVE-1 en las células endoteliales de los vasos linfáticos.
metástasis temprana a los ganglios linfáticos es una complicación frecuente en cáncer de mama humano. De acuerdo con informes anteriores, hemos examinado HA en 6 tipos de células de cáncer de mama, las líneas de células altamente metastásicas HS-578T [19], [20] y MDA-MB-231 [21], [22], [23], la líneas celulares moderadamente metastásicas MDA-MB-435S [21], [23] y MDA-MB-468 [24], [25], y el no hay líneas de células metastásicas baja o MCF-7 [23], [25], [ ,,,0],26] y SK-BR-3 [19], [27] a través de un ensayo de exclusión de partículas clásico, un experimento de inmunofluorescencia y análisis citométrico de flujo. De acuerdo con informes anteriores [28], se encontró que las células HS-578T y MDA-MB-231 contienen altos niveles de HA en su superficie, mientras que los niveles de HA en la superficie de MDA-MB-435S, MDA-MB-468, MCF -7, y SK-BR-3 células fueron apenas se detectan. HA en la superficie del tumor se ha demostrado que se asocia con metástasis linfáticos tumor; por lo tanto, se consideró que si y cómo HA presente en la superficie del tumor participa en este proceso. Para explorar más a fondo la función biológica del HA en la metástasis linfática tumoral, se optó por pilas de gran HA-expresan HS-578T y baja HA-que expresan las células MCF-7 para investigar si HA influye en la capacidad de las células tumorales para adherirse a las células COS-7
células LYVE-1 (+) y células SVEC4-10.
LYVE-1, un receptor de la superficie celular para hA en el endotelio linfático, se ha demostrado que se correlaciona con una alta frecuencia de metástasis en los ganglios linfáticos regionales [29], [30]. Los científicos de otros laboratorios han demostrado que los vasos linfáticos peritumoral en algunos tipos de carcinoma contienen émbolos tumorales decoradas con hialuronano dentro de la luz, y se sugirió que las células tumorales dentro de los vasos linfáticos que drenan pueden unir HA, causando una interacción con la pared del vaso a través de la CD44 /HA /LYVE-1 interacción [31]. Para investigar si la interacción directa LYVE-1-HA influye linfático metástasis tumoral, se analizó la capacidad de adherencia de las células tumorales (diferente contenido de HA) para Lyve-1-positivas las células. Nuestro ensayo de adhesión estática reveló que LYVE-1 mejora la adhesión de las células HS-578T a células COS-7 a través de hialuronano, que se informó anteriormente [16]. Sin embargo, si bajo contenido de HA en las células tumorales produce una interacción con LYVE-1 a través de otros factores para influir en la adhesión de células tumorales todavía no está claro. También se realizó un experimento de adherencia estática con células MCF-7 y
COS-7
LYVE-1 (+) y COS-7 LYVE-1 - (células). El presente estudio demostró que LYVE-1 no mejoró la adhesión de las células MCF-7 células que carecen de HA en su superficie de células COS-7. Además, para mejor modelo de la adhesión de células tumorales a los ganglios células endoteliales, se utilizó SVEC4-10 células para repetir la adherencia. Sólo un poco disminución fue observado después de usar el anticuerpo de bloqueo, que puede ser causada por las interacciones limitadas con HA y LYVE-1 en SVEC4-10 células. En conjunto, estos hallazgos sugieren que los diferentes niveles de HA en las células tumorales afectan a su metástasis en el sistema linfático. Los altos niveles de HA en células HS-578T promueve la unión de Lyve-1 y adhesión, y las células pueden incluso ser retraídos por el sistema linfático.
La interacción de rodadura es un requisito previo para la generación de enlaces intermoleculares de alta resistencia y la adhesión firme [32]. Para determinar la estabilidad de las interacciones adhesivas, los experimentos de cámara de flujo hidrodinámico in vitro se utilizan a menudo [33], [34]. En el presente estudio, para investigar el efecto del flujo en la adhesividad de HA
pilas de gran-HS-578T y HA
low-MCF-7 células COS-7
LYVE-1 (+) y COS-7
LYVE-1 (-) de las células, las células se expusieron a aumentar progresivamente la tensión de cizallamiento de fluido. Los resultados mostraron que las interacciones de HA con LYVE-1 fueron moderadamente fuerte en la mediación de la adhesión en condiciones de esfuerzos de cizalla fisiológica a 2,7 dyn /cm
2. adhesión firme se definió como la capacidad de las células para resistir el desprendimiento en una tensión de cizallamiento de 10 dinas /cm
2, como se informó anteriormente [33]; Por lo tanto, el número de células HS-578T adheridas disminuyeron a medida que la tensión aumenta a 13,54 dyn /cm
2, pero seguían siendo parcialmente unido a COS-7
LYVE-1 (+) células en comparación con COS-7
LYVE-1 (-) de las células. Además, los resultados mostraron que las interacciones con HA en células SVEC4-10-1 LYVE eran débiles en comparación con la interacción con células COS-7 debido a que el número de células HS-578T adheridas evidentemente disminuyó bajo esfuerzo de cizalla fisiológica a 2,7 dyn /cm
2. Estos resultados sugieren que HA promueve una adhesión relativamente débil y transitoria de las células tumorales a los ganglios células endoteliales mediante la interacción con LYVE-1, que también puede sugerir sus funciones en las células tumorales de rodadura a lo largo del endotelio bajo flujo de la linfa. Como control, HA
células bajo MCF-7 fueron también expuestos a células COS-7 y SVEC4-10 células, pero no hay cambios significativos en el comportamiento de adhesión de las células MCF-7 a ambas células se observaron en cualquier cizalla dada vigor.
las investigaciones realizadas por la Dirección General de Jackson [35] mostró que LYVE-1 fue funcionalmente "silenciado" en una celda de manera específica y que los complejos de proteínas hA-hA, como los cables pueden tener la misma capacidad para activar LYVE -1 como la capacidad de activar CD44 in vivo [36], [37], [38]. Por primera vez, el actual estudio proporciona evidencia para la distribución y la morfología de HA en las superficies de células tumorales. Nuestro estudio encontró que existen cables de HA en algunas superficies de células tumorales y que HA es atravesado como cables en la superficie celular de los tumores pueden activar LYVE-1. Sin embargo, en base a los resultados publicados por Jung San Huang, HA estimula la contracción de la red de ER en las células endoteliales linfáticos de una manera LYVE-1 dependiente de [39], y se cree que el HA se une a LYVE-1 en endotelial linfático células, que estaba de acuerdo con nuestros resultados. Estas contradicciones pueden ser atribuidas a los diferentes métodos de detección utilizados en los estudios. No obstante, HA en la superficie de las células tumorales puede influir en la adhesión tumoral a través de las interacciones con el LYVE-1 que se encuentra en las células endoteliales linfáticas.
En conclusión, los resultados nos permiten comprender mejor el mecanismo detrás de la regulación de la HA en superficies de las células tumorales y la adhesión de células tumorales. HA en células tumorales media su adhesión a través de la célula endotelial linfático HA receptor LYVE-1. La resistencia de adherencia depende de la cantidad de HA presente en las células tumorales; Sin embargo, este mecanismo sólo juega un papel en el inicio del proceso, y muchas preguntas siguen sin estar claros. Por ejemplo, no se sabe si la superficie de las células tumorales HA se relaciona con la enzima sintética HA, la enzima de degradación de HA o otras moléculas. Además, no está claro si los cables HA activan LYVE-1 en los vasos linfáticos. Más trabajo en esta área está en curso en nuestro laboratorio.
Materiales y Métodos
Reactivos y suministros gratis (proteína de unión al ácido hialurónico, HABP)
biotinilado HABP se adquirió de Merck (Darmstadt , Alemania). avidina marcada con TRITC se obtuvo de Boster (Wuhan, China). Alexa Fluor® 488 conjugado con estreptavidina se adquirió de Life Technologies (Carlsbad, EE.UU.). Ratón LYVE-1 y el anticuerpo IgG de rata
control de isotipo 2A se compraron de R & amp; D Systems (Minneapolis, EE.UU.). DMEM, RPMI-1640, L-15 y F-12K fueron adquiridos de Gibco (Estocolmo, Suecia). suero bovino fetal (FBS) se obtuvo de Hyclone (Lanzhou, China). Una cámara de estrés SC-cizalla Chamlide se obtuvo de Instrumentos de células vivas (Seúl, Corea).