Extracto
IL-10 se asocia con malignidad del tumor a través de escape inmune. La hipótesis de que la IL-10 haplotipos clasificados por IL-10 polimorfismos de promotor en -1082A & gt; G, -819C & gt; T, y -592C & gt; A podría influir en la IL-10 expresión y dar lugar a cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) con malos resultados y la recaída. Hemos recogido los tejidos normales adyacentes de 385 pacientes con CPNM para determinar IL-10 haplotipos mediante secuenciación directa y la cadena de la polimerasa polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción de reacción (PCR-RFLP). De los 385 tumores, 241 estaban disponibles para evaluar de ARNm de IL-10 por los niveles de expresión en tiempo real de RT-PCR. La influencia de la IL-10 haplotipos en la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de recaída (RFS) se determinaron por Kaplan-Meier y el análisis multivariado de regresión de Cox. Los resultados mostraron que los niveles de IL-10 mRNA fueron significativamente mayores en los tumores con el haplotipo no ATA que con el haplotipo ATA (P = 0,004). Los pacientes con el haplotipo no tenían ATA OS más cortos y períodos RFS que los pacientes con el haplotipo ATA. Esto puede estar asociado con la observación de que el número de linfocitos infiltrantes de tumor se redujo en los tumores con niveles más altos de IL-10. En consonancia, las células T de la sangre periférica de los pacientes con haplotipo no ATA eran más susceptibles a la apoptosis y menos citotóxico para las células tumorales, en comparación con los de los pacientes con haplotipo ATA. Los resultados sugieren que la IL-10 puede promover la malignidad del tumor a través de la promoción de la apoptosis de células T y la supervivencia de células tumorales, y la IL-10 haplotipo evaluada por PCR-RFLP o secuenciación directa se puede utilizar para predecir la supervivencia y la recaída en el CPNM resecado, ayudando a los médicos de hacer las decisiones adecuadas sobre el tratamiento de los pacientes
Visto: Wang. YC, Sung WW, Wu TC, Wang L, Chien WP, Cheng YW, et al. (2012) La interleucina-10 haplotipo podría predecir la supervivencia y la recaída en el resecado de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (7): e39525. doi: 10.1371 /journal.pone.0039525
Editor: Pan-Chyr Yang, el Hospital de la Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 6 Enero, 2012; Aceptado: 22 de mayo de 2012; Publicado: 27 Julio 2012
Copyright: © Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado conjuntamente por subvenciones del Consejo Nacional de Ciencias (NSC-96-2628-B-040-002-MY3), y el Departamento de Salud (DOH101-TD-C-111-005) de Taiwán, República de China. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la interleucina-10 (IL-10), una importante citoquina inmunoinhibitoria, es parte de una red equilibrada de citoquinas [1] - [5]. La citoquina IL-10 es producida por varias células incluyendo las células B normales y neoplásicas, estimulado monocitos, macrófagos, y un subconjunto de células T [1] - [4]. Muchos estudios de casos y controles han indicado una asociación de IL-10 promotor polimorfismos (SNPs) con los riesgos de cáncer humano, incluyendo el riesgo de cáncer de pulmón [6] - [9]. Del promotor de IL-10 SNPs, las de -1082A & gt; G, -819C & gt; T, y -592G & gt; A han sido el centro de estudios recientes, y los fenotipos de estos SNPs de nucleótido único se han confirmado por ensayos funcionales en células modelos [10], [11].
tumorales estudios de vigilancia inmune han revelado una asociación entre IL-10 y el desarrollo de los cánceres humanos tales como el linfoma de células B grandes, de células T de linfoma no Hodgkin, y los cánceres de colon, de próstata, de mama, gástrico, de mieloma, y de pulmón [4], [6] - [9], [12] - [22]. En los casos de cáncer de pulmón, algunos informes han indicado que la pérdida de IL-10 en tumores de pulmón pueden promover la progresión tumoral y dar lugar a malos resultados clínicos en los pacientes; Sin embargo, un efecto opuesto se ha reportado en otros estudios [23] - [29]. Curiosamente, la ausencia de IL-10 expresión se ha asociado con un mal resultado en la etapa I el cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) [24], [25], mientras que en la fase final del CPNM, la presencia de IL-10-positivas macrófagos en los márgenes del tumor pueden ser un indicador de mal pronóstico pronóstico [23]. Además, se han reportado más cortos tiempos de supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón avanzado que tenían séricos elevados niveles de IL-10, en comparación con pacientes similares que tuvieron séricos bajos niveles de IL-10 [26]. Por lo tanto, sigue siendo un claro papel de la IL-10 en la tumorigénesis de pulmón no ser identificado.
En el presente estudio se analizaron los tejidos pulmonares normales adyacentes a los tumores de NSCLC resecado quirúrgicamente en 385 pacientes con el fin de identificar la IL-10 promotor SNPs en -1082A & gt; G, -819C & gt; T, y -592C & gt; a por secuenciación directa y la reacción en cadena de polimerasa de restricción polimorfismo de longitud de fragmentos (PCR-RFLP). Estos tres SNP IL-10 promotores se han reportado para producir principalmente tres haplotipos: CCG, ACC, ATA [30] - [33]. En el presente estudio, los pacientes se clasificaron en dos haplotipos, ATA y ATA no (Fig. 1), que habían sido utilizados en dos informes anteriores [34], [35]. Hemos cuestionado: 1) si los tumores de los transportistas no ATA tienen niveles de IL-10 niveles de expresión de mRNA que los tumores de portadores ATA, 2) si los pacientes con un haplotipo no ATA o los niveles de IL-10 mRNA más altos en tumores de pulmón tienen mayor del tumor inmune vigilancia, y 3) si la IL-10 haplotipo o expresión de ARNm se podría utilizar para predecir la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de recaída (RFS) en pacientes con CPNM resecado.
SNPs en las posiciones -819 y -592 en el promotor de la IL-10 estaban en completo desequilibrio de ligamiento. Se observaron tres haplotipos de IL-10 y se lista la ocurrencia de cada haplotipo o haplotipo combinación en los cuadros sombreados.
(A) Representante de CD3 inmunotinción de TIL en tumores de pulmón con baja densidad de TIL (& lt; 25 CD3
+ /HPF) (izquierda: 100x; derecha: 400x); (B) TIL presenta en los tumores de pulmón muestran una elevada densidad de TIL (≥25 CD3
+ /HPF) (izquierda: 100x; derecha: 400x).
Se definió la apoptosis de las células T como Anexina V
+ /CD3
+ y la apoptosis de las células tumorales se definió como la anexina V
+ /PKH26
+. (A) Representante citometría de flujo de escala SSC-FSC para conmutar población de linfocitos, y PKH26 indicando para el marcado de las células tumorales. (B) Representante citometría de flujo de resultado la apoptosis de células CD3 + células T
y las células tumorales PKH26 cerrada. (C) Mayor nivel de apoptosis de las células T después de co-cultivo con células tumorales de 22 voluntarios sanos de sexo masculino que albergaban la IL-10 no ATA haplotipo frente a los IL-10 ATA de haplotipos (tasas de apoptosis de las células T durante el co-cultivo con A549: 10,49 ± 3,04 vs. 8,34 ± 2,37, P = 0,011; durante la co-cultivadas con TL-1: 18,30 ± 3,82 vs. 12,97 ± 2,94, P & lt; 0,01). Añadimos la proteína recombinante de IL-10 al medio de co-cultivo de CMSP que albergan el IL-10 ATA haplotipo, y se aumentó la tasa T apoptosis (aumento del 7,63% durante el co-cultivo con el A549, P & lt; 0,001; aumento de 2,73% durante la co -Cultura con TL-1, P = 0,008). También añadimos IL-10 neutralizó anticuerpo al medio de co-cultivo de PBMCs que albergan el no-ATA IL-10 haplotipo, y se redujo la tasa de T apoptosis (por 1,78% durante el co-cultivo con A549, P = 0,017; por 7,75 % durante el co-cultivo con TL-1, P & lt; 0,001). (D) Mayor nivel de la apoptosis de las células tumorales después de co-cultivo con PBMCs de 22 voluntarios sanos de sexo masculino que albergaban la IL-10 ATA haplotipo en comparación con el haplotipo no ATA (apoptosis de las células A549: 16.80 ± 3.38 vs 14,45 ± 3,78, p = 0.035; apoptosis de TL-1: 12,95 ± 3,05 vs. 8,68 ± 2,57, P & lt; 0,01). Añadimos proteína recombinante IL-10 al medio de co-cultivo de PBMCs que albergan el-10 IL ATA haplotipo, y se redujo la tasa de apoptosis tumor (disminución de 4,29% de A549, P & lt; 0,001; disminución de 1,94% de TL-1, P = 0,043). También hemos añadido la IL-10 anticuerpo neutraliza al medio de co-cultivo de CMSP que albergan la IL-10 no ATA haplotipo, y se incrementó la tasa de apoptosis tumoral (incremento de 2,46% de A549, P = 0,037; aumento de 6,67% de TL 1, p. & lt; 0,001) guía empresas
(20 microgramos por cada 3 días). Los ratones fueron sacrificados en el 14
º días. Las metástasis pulmonares se encontró en los ratones inyectados con anticuerpo IgG (A) y no se encontró en los pacientes con IL-10 de anticuerpos neutralizan (B).
De acuerdo con IL-10 haplotipo (A), IL- 10 mRNA (B), y la combinación de IL-10 de haplotipos y ARNm (C).
Materiales y Métodos
los pacientes
Este estudio incluidos 385 pacientes con NSCLC. Todos los pacientes eran de origen chino no relacionados y los residentes del centro de Taiwan. Los pacientes habían sido diagnosticados de adenocarcinoma (194; 50,4%) o carcinoma de células escamosas (191; 49,6%) y fueron sometidos a resección quirúrgica en la División de Cirugía Torácica, Hospital de Veteranos Taichung general, entre 1993 y 2004. Las muestras se congelaron inmediatamente a la cirugía y se mantiene a -80 ° C hasta su procesamiento. El estudio fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional (Institutional Review Board, Hospital de la Universidad Médica Chung Shan CSMUH. No: CS11177). los datos de recaída del cáncer se obtuvieron mediante la revisión de las historias y confirmados por los cirujanos torácicos. Los parámetros clínicos y datos de SO y RFS se obtuvieron de revisión de expedientes (32 pacientes no tenían datos de recaída) y el Registro de Cáncer de Taiwán, Departamento de Salud, Yuan Ejecutivo, la República de China.
extracción de ADN genómico, la extracción de RNA y cDNA síntesis
ADN genómico fue extraído por métodos convencionales. Resecado quirúrgicamente los tejidos normales adyacentes al tumor de pulmón se prepararon mediante el uso de digestión con proteinasa K y el ADN se extrajo usando fenol-cloroformo, seguido de precipitación con etanol.
ARN total fue extraído de 241 tejidos de tumor de pulmón disponibles usando reactivo TRIzol ( Invitrogen). la síntesis de ADNc de primera cadena en presencia de cebadores aleatorios se realizó con un alta capacidad de cDNA kit de transcripción (Applied Biosystems) inversa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
análisis de PCR-RFLP para IL-10 -592C /A genética SNP
Los genotipos de IL-10 -592C /A se determinaron por PCR-RFLP como se describe por Rad et al. [36]. productos de amplificación de PCR de 50 muestras fueron seleccionados al azar para la secuenciación directa para confirmar el genotipo indicado por PCR-RFLP.
secuenciación directa para la IL-10 -1082A /G y -819C /T SNPs genéticos
SNPs de IL-10 -1082G /a y -819C /T se determinaron por secuenciación directa de productos de PCR amplificados a partir del ADN de los tejidos normales adyacentes a los tumores. Las muestras de ADN se prepararon utilizando digestión con proteinasa K y extracción con fenol-cloroformo, seguido de precipitación con etanol. Los cebadores utilizados para la amplificación del ADN y la secuenciación directa fueron: 5'-CTCGCCGCAACCCAACTGGC-3 '(F) y 5'-TGGGGGAAGTGGGTAAGAGT-3' (R). Las condiciones de ciclo de PCR consistió en una etapa inicial de desnaturalización a 94 ° C durante 10 min, seguido de 35 ciclos de 30s a 94 ° C; 45s a 56 ° C; 45s a 72 ° C; y una elongación final a 72 ° C durante 10 min. Los productos de PCR se secuenciaron utilizando un Applied Biosystems 3100 Avant Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Real-time RT-PCR
tiempo real la amplificación RT-PCR de muestras de ADNc se realizó con una ABI 7500 en tiempo real PCR System (Applied Biosystems) y el tinte SYBR Green para cuantificar las transcripciones de ARNm de IL-10. En tiempo real cebadores RT-PCR fueron las siguientes: para la IL-10 transcripciones, 5'-GGCGCTGTCATCGATTTCTT-3 '(hacia delante) y 5'-TGGAGCTTATTAAAGGCATTCTTCAC-3' (inverso); para la transcripción de genes 18S, 5'-TCGGAACTGAGGCCATGA-3 '(hacia delante) y 5'-CCGGTCGGCATCGTTTA-3' (hacia atrás). Los productos amplificados por la IL-10 cebadores fueron verificados por secuenciación directa. Las cantidades de IL-10 transcritos de ARNm se cuantificaron en relación con el control interno 18S según las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems).
periférica de aislamiento de monocitos de sangre y de co-cultivo experimentos
monocitos de sangre periférica (PBMCs) de donantes sanos se aislaron por Ficoll-Paque (GE Healthcare) centrifugación en gradiente de densidad tal como se describe anteriormente [37]. Las PBMCs se utilizaron para la determinación de la inducida por células del cáncer de apoptosis de las células T por co-cultivo con células de cáncer de pulmón en una proporción de 40:1 durante 36 horas con IL-10 de anticuerpos neutralizan (MAB2171, R & amp; D Systems) o IL 10 proteína recombinante (CYT-500, Prospec). Las PBMCs se recogieron para el análisis de apoptosis de las células T por citometría de flujo
Citometría de flujo análisis
un citómetro de flujo. (FACSCalibur; BD Biosciences) se utilizó para determinar el tamaño de la población de células y el porcentaje de apoptosis . PBMCs fueron teñidas con PE-Cy
ratón TM7 anti-CD3 humano (BD Pharmingen) y las células positivas CD3 en la puerta de linfocitos se identificaron como células T. Se utilizó la anexina V-FITC (BD Pharmingen) para marcar la apoptosis celular. Después de la tinción de las células de acuerdo con el protocolo recomendado, las muestras se analizaron dentro de 1 hora. Para la apoptosis de las células T, que GaTeD la puerta de linfocitos en FSC-SSC y la población con CD3
+ y Anexina V
+ se calculó [37].
tinción inmunohistoquímica
La tinción inmunohistoquímica para evaluar la expresión de CD3 en linfocitos se llevó a cabo en todo el montaje secciones de parafina de especímenes de cáncer de pulmón. Se utilizó anti-CD3 (1/100) anticuerpo primario policlonal (Santa Cruz Biotechnology). Un kit de detección inmunohistoquímica para
se utilizó vitro
uso en diagnóstico (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo estándar. TIL fue contado por selección aleatoria sistemática de los campos. Al menos cinco diferentes HPF se contaron en cada muestra, que depende del tamaño del área del tumor.
Modelo animal
C57BL /6 ratones se mantuvieron en las instalaciones de ratón estándar (libres de patógenos específicos) al Chung Médico de la Universidad de Shan. TC-1 línea celular fue proporcionado amablemente por el Dr. Wu TC (John Hopkins, Baltimore, MD) [38]. células TC-1 se suspendieron en PBS a una concentración de 10
5 células por 100 l. Cada ratón se inyectó con 10
5 TC-1 células por inyección vano cola. Los ratones recibieron dosis intraperitoneales de 200 g de anti-IL-10 anticuerpo (mAb417 R & amp; D Systems) en el primer día de la inyección; alternado con dosis intraperitoneales de 20 g de anticuerpo anti-IL-10 (mAb417 R & amp; D Systems) espaciados by3 días. Los ratones fueron sacrificados a los 14
th días después de la inyección del tumor. Tinción HE se realizó para comprobar la formación de tumores entre los órganos de los ratones.
El análisis estadístico
prueba de la t de Student y la prueba de Chi-cuadrado se aplicaron para el análisis de datos continua o discreta. Las asociaciones entre la IL-10 polimorfismos de promotor y la supervivencia del paciente se calcula utilizando el método de Kaplan-Meier y se evaluaron mediante la prueba de log-rank. posibles factores de confusión se ajustaron los modelos de regresión de Cox, con el promotor polimorfismos de IL-10 equipados como variables indicadoras. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa estadístico SPSS (versión 13.0) (SPSS, Inc., Chicago, IL). Todas las pruebas estadístico se realizó mediante ensayos y valores P & lt dos caras; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
El No-ATA haplotipo es más común en pacientes con metástasis ganglionar
IL-10 haplotipos-ATA /ATA (ATA haplotipo) y no-ATA /ATA (ATA no haplotipo) -fueron categorizados por la IL-10 promotor SNPs en -1082A /G, -819C /T y -592C /A (Fig. 1). Las relaciones entre la IL-10 haplotipos y parámetros clínico en 365 pacientes con CPNM se analizaron estadísticamente mediante una prueba de Chi-cuadrado. Como se muestra en la Tabla 1, el haplotipo no ATA fue más frecuente en los pacientes con metástasis ganglionar (N1 y N2) que con metástasis no ganglionares (N0) (62,5% vs. 50,3%, p = 0,016). Además, una prevalencia relativamente mayor de los no fumadores se observó entre los pacientes con el haplotipo no ATA que con el haplotipo ATA (61,7% vs. 51,8%, P = 0,049). Por lo tanto, los pacientes con no-ATA haplotipo pueden tener tumores más agresivos con una mayor tendencia a la recaída.
, niveles elevados de IL-10 mRNA en tumores de pulmón de pacientes con haplotipos no-ATA comparación con los pacientes de haplotipos ATA dieron lugar a tumores más pobre la vigilancia inmune parcialmente a través de los números de tumor disminuyó la infiltración de linfocitos
de los tumores de los 385 pacientes con cáncer de pulmón, 241 estaban disponibles para la evaluación de la IL-10 niveles de expresión de ARNm. Como se muestra en la Fig. 2, significativamente más altos niveles de ARNm de IL-10 fueron encontrados en los tumores de pacientes no-ATA de haplotipos que de los pacientes de haplotipos ATA (media ± DE, 68,51 ± 16,31 vs 12,85 ± 4,54, p = 0,004). La distribución de los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) en tumores de pulmón se evaluó por IHC en 87 secciones de parafina de tumores de pulmón disponibles. En toda la población de estudio, no se encontraron diferencias en el número de TIL en tumores de pulmón de ATA y los pacientes que no son ATA (Tabla 2, Figura 3;. 50,0 vs. 37,5; p = 0,236). Sin embargo, se observó una diferencia en los números TIL entre ATA y ATA transportistas no en pacientes en etapa tardía (P = 0,032, Tabla 2), pero no en pacientes en estadio temprano (P = 0,988, Tabla 2). Estos resultados sugieren que los pacientes que no son ATA que tienen números de TIL más bajos en comparación con los pacientes ATA pueden tener la vigilancia inmune del tumor más pobre.
IL-10 reduce la apoptosis de las células tumorales a través de aumento de la apoptosis de las células T
Para verificar la posibilidad de cambios en la vigilancia inmune del tumor, las PBMC se obtuvieron de 22 donantes sanos con el haplotipo ATA y 22 donantes sanos con el haplotipo no ATA. los niveles de IL-10 mRNA en PBMCs de no-ATA de haplotipos donantes sanos fueron superiores a partir de haplotipos ATA donantes sanos (media ± DE, 78,54 ± 13,18 vs 46,37 ± 3,91, p = 0,028). Estas células se co-cultivadas con A549 y TL-1 en las células de cáncer de pulmón. La citotoxicidad de las células de cáncer de pulmón se determinó mediante una citometría de flujo con anexina V
+ /PKH26
+ y apoptosis de las células T se determinó con Anexina
+ /CD3
+. La apoptosis de las células T después de co-cultivo con células A549 y TL-1 fue menor en los PBMCs de donantes sanos ATA haplotipos que en PBMC de los donantes no ATA haplotipo sanos (8,34 ± 2,37 frente a 10,49 ± 3,04, p = 0,012 para A549; 12,97 ± 2,94 vs. 18,30 ± 3,82, P & lt; 0,001; Fig. 4A). En consecuencia, el número de células tumorales apoptóticas (A549 y TL-1) fue significativamente mayor después de co-cultivo con PBMC de los donantes sanos de haplotipo ATA que de los donantes sanos no ATA (16,80 ± 3,38 vs. 14,45 ± 3,78, P = 0,035 para A549; 12,95 ± 3,05 vs. 8,68 ± 2,57, P & lt; 0,001; Fig. 4B). Para verificar si la IL-10 era responsable de esta apoptosis de las células T y las células de cáncer de pulmón, el número de células T apoptóticas de PBMCs de los donantes sanos ATA de haplotipos se aumentó mediante tratamiento con 100 ng /ml de IL-10 (8,34 ± 2,37 vs . 15,97 ± 3,03, P & lt; 0,001 para A549; 12,97 ± 2,94 vs. 15,70 ± 3,54, P = 0,008 para TL-1; la Fig. 4A). Por el contrario, la apoptosis de células T en PBMC de donantes sanos no-ATA se redujo notablemente en una forma dependiente de la dosis por IL-10 anticuerpo (Fig. 4A) neutralizado. En consecuencia, la apoptosis de ambos tipos de células de cáncer de pulmón se redujo mediante el tratamiento con IL-10 y aumentó por la IL-10 anticuerpo neutralizado (Fig. 4B). Colectivamente, PBMCs de los transportistas no tuvieron efectos ATA menor apoptosis en células de cáncer de pulmón que hizo PBMCs de portadores ATA, e IL-10 fue el responsable de la apoptosis de las células tumorales después de co-cultivo con PBMC. Estos resultados indican claramente que la IL-10 reduce la apoptosis de las células tumorales a través de aumento de la apoptosis de las células T.
En nuestro experimento con animales, las células TC-1 que no expresaban IL-10 (amablemente proporcionado por el Dr. TC Wu, John Hopkins, Baltimore, MD, EE.UU.) fueron inyectadas en ratones C57BL6 a través de la vena de la cola. Después de 14 días, se formaron tumores en todo el pulmón (Fig. 5). Sin embargo, no se observaron tumores después de que las células TC-1 ratones tratados fueron tratados con IL-10 anticuerpo neutralizado. Estos resultados parecen apoyar los estudios previos que indican que la IL-10 secretada por las células inmunes puede promover la progresión del tumor de pulmón [39].
Los pacientes con haplotipo no ATA o altos niveles de IL-10 mRNA tenían resultados más pobres en comparación con los pacientes con el haplotipo ATA o bajos niveles de ARNm de IL-10
Kaplan-Meier y se realizaron análisis multivariados de regresión de Cox para verificar si una peor supervivencia y mayor de recaídas se observan en pacientes con el haplotipo no ATA o elevada de IL-10 los niveles de mRNA en tumores de pulmón en comparación con los pacientes con el haplotipo ATA o IL-10 niveles bajos de ARNm. Las curvas de supervivencia predichas por análisis de Kaplan-Meier mostró que los pacientes con el haplotipo no ATA tuvieron una SG más corta y períodos RFS que los pacientes con el haplotipo ATA (P = 0,001 para el sistema operativo, el panel izquierdo de la figura 6A;. P & lt; 0,001 para RFS, panel derecho de la Fig. 6A). En consonancia con el valor pronóstico de la IL-10 haplotipo, los niveles elevados de IL-10 de ARNm también se observó en un subconjunto de esta población de estudio (n = 241), que muestra que los tumores con niveles altos de IL-10 mRNA se correlacionaron con peor OS y RFS que en los pacientes cuyos tumores tenían bajos niveles de ARNm de IL-10 (P = 0,001 para el sistema operativo, el panel izquierdo de la figura 6B;. P & lt; 0,001 para RFS, panel derecho de la figura 6B.). Como era de esperar, el peor sistema operativo y RFS se observaron en los pacientes con un haplotipo no ATA y altos niveles de IL-10 mRNA (Fig. 6C). Estos resultados sugieren que el haplotipo de IL-10 o IL-10 expresión de mRNA en tumores de pulmón podrían utilizarse para predecir los resultados de los pacientes.
regresión multivariante de Cox se utilizó para explorar si IL-10 haplotipo o niveles de mRNA pueden ser independientemente predecir el resultado del paciente, después de ajustar por diversos parámetros, como la edad, el sexo, el tabaquismo, la histología del tumor y el estadio del cáncer. Como se muestra en la Tabla 3, los pacientes con el haplotipo no tenían ATA horas de 1.431 y 1.556 para el sistema operativo más corto y RFS, respectivamente, en comparación con los pacientes con haplotipo ATA (IC del 95%, 1,104-1,856; p = 0,007 para el sistema operativo; 1.200- 2,018, P & lt; 0,001 para RFS). La duración media de OS y RFS en pacientes con el haplotipo no ATA eran 24,1 y 16,8 meses, respectivamente, en comparación con 40,9 y 30,9 meses, respectivamente, para el haplotipo ATA. Las tasas de supervivencia a 5 años para los pacientes con haplotipos no son ATA y ATA eran 28,2% frente a 43,3% para el sistema operativo y el 22,2% frente a 36,2% para RFS. El valor pronóstico independiente de los niveles de ARNm de IL-10 también se demostró en un subgrupo de esta población de estudio. Los pacientes con niveles elevados de IL-10 mRNA tenían tasa de supervivencia menor supervivencia mediana y 5 años para el sistema operativo y RFS que los pacientes con niveles de ARNm de IL-10 baja (Tabla 3; 30,2 meses frente a 52,1 meses, 30,7% vs 48,7%, P = 0,017 para el sistema operativo; 17,2 meses frente a 35,9 meses, 19,2% frente a 45,1%, p = 0,001 para RFS). Las horas de la IL-10 mRNA para OS y RFS aumentaron en relación con los CRI de IL-10 haplotipo (1,553 vs 1,431 para el sistema operativo; 1,755 frente a 1,556 para RFS). Más interesante aún, los CRI de pacientes con linfoma no-ATA haplotipo más alto nivel de ARNm de IL-10 se incrementó 1,431 a 1,892 para el sistema operativo y 1,556-2,344 para RFS en comparación con los pacientes con haplotipo ATA más bajo nivel de ARNm de IL-10. El aumento de los CRI no se observó en los pacientes con el haplotipo más ATA-10 IL ARNm alta o en pacientes con linfoma no-ATA haplotipo y bajo nivel de ARNm de IL-10. Estos resultados parecen sugerir que la IL-10 o haplotipo de IL-10 mRNA nivel pueden predecir de forma independiente la supervivencia y la recaída en pacientes con CPNM resecado.
Discusión
Los SNP de IL-10 en -1082 G & gt ; A, -819 C & gt; T y -592 C & gt; A son las CGC, ACC, y haplotipos ATA, respectivamente [36], [40]. La expresión de IL-10 ARNm en células de sangre periférica es más alta en individuos con uno o dos haplotipos CCG, seguido por ACC portadores /ACC, y luego ATA /ACC y portadores ATA /ATA [36], [40], [41] . En el presente estudio, los haplotipos no son ATA y ATA se clasificaron por los tres GCC, ATA y ACC haplotipos de IL-10 promotor (Fig. 1). Se determinó un valor de mal pronóstico para el sistema operativo y RFS para el CCG, ACC, y los transportistas no-ATA (Tabla S1). Sin embargo, el significado pronóstico de las tres compañías aéreas no se reveló en pacientes en etapa tardía, no en pacientes en etapa temprana de esta población de estudio (Tabla S1). Por otra parte, la IL-10 niveles de expresión de mRNA fueron significativamente mayores en los portadores con ≥1 número de copias de GCC que en los portadores sin GCC (IL-10 mRNA para GCC frente a no-CCG: 147,90 ± 56,80 vs 31,72 ± 7,91, P & lt; 0,001). No hay diferencia en IL-10 expresión de mRNA se observó para los portadores ACC (IL-10 ARNm para ACC frente a no-ACC: 57,69 ± 15,43 vs 31,15 ± 11,36, P = 0,166). Esto es coherente con un informe anterior que indica que los portadores de haplotipos del CCG tuvieron un riesgo de cáncer de pulmón más alta que otras compañías [6]. Además, la IL-10 nivel de ARNm fue superior en haplotipo no ATA ATA que en haplotipo (Fig. 2). Por lo tanto, en el presente estudio, la IL-10 haplotipos fueron evaluados por su importancia pronóstica en pacientes con CPNM.
La asociación entre IL-10 y la progresión del tumor ha sido explicada con frecuencia por los cambios en la inmunosupresión y el tumor de la vigilancia inmune [ ,,,0],1] - [4], [42]. En el presente estudio, resultados consistentes se observaron en
in vitro
experimentos con PBMC co-cultivadas con células de cáncer de pulmón y en el
in vivo
observaciones de TIL en los tejidos tumorales (Fig. 4). Estudios anteriores utilizando ratones transgénicos que expresan IL-10 mostraron que estos ratones desarrollaron tumores más grandes que los ratones de control. Este resultado sugiere que la IL-10 evita que las respuestas inmunitarias eficaces contra la progresión del tumor [43]
Los informes anteriores han demostrado que la IL-10 tiene diferente significado pronóstico en pacientes con cáncer de pulmón temprana y la fase tardía [23]. - [25]. En la presente población de estudio, se observaron más pobre OS y RFS en etapa tardía (III) los pacientes con el haplotipo no ATA que en los pacientes con el haplotipo ATA (HR, 1,785, P & lt; 0,001 para el sistema operativo; HR, 2.071, P & lt; 0,001 para RFS; Tabla S1); Sin embargo, no se observó ningún valor pronóstico para la primera etapa (I + II) de los pacientes (Tabla S1). Cuando se compara con toda la población del estudio, los pacientes tenían la fase tardía de los CRI más altos para OS y RFS (1.785 frente a 1.431 para el sistema operativo; 2.071 vs. 1.556 para RFS; Tabla S1). Esto podría explicarse por los niveles de IL-10 mRNA significativamente mayor en los pacientes en etapa tardía con el haplotipo no ATA que con el haplotipo ATA (87,26 ± 28,83 vs 10,87 ± 4,53, p = 0,011); Sin embargo, la diferencia entre los haplotipos no son ATA y ATA se observó de forma marginal en pacientes en estadio temprano (54,13 ± 18,49 vs 14,52 ± 7,47, p = 0,050). Además, la importancia pronóstica de TIL en OS y RFS también se demostró en pacientes en etapa tardía, no en pacientes en estadio temprano (P = 0,012 para el sistema operativo, P = 0,003 para la RFS, el cuadro S2). Por lo tanto, sugerimos que el haplotipo-ATA no, con un IL-10 expresión mRNA nivel más alto, puede ser más importante en la promoción de la agresividad del tumor en pacientes en etapa tardía que en los pacientes en etapa temprana.
En resumen, IL-10 haplotipos se pueden determinar fácilmente a partir de muestras de sangre de pacientes y pueden ser útiles en la predicción de la supervivencia y la recaída en pacientes con CPNM resecables. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer informe que muestra que la IL-10 haplotipos se pueden utilizar para predecir OS y RFS en pacientes con CPNM. Por lo tanto, proponemos que los haplotipos de IL-10 promotor SNPs pueden ser potenciales biomarcadores para la predicción de la supervivencia y la recaída en pacientes con CPNM resecable.
Apoyo a la Información sobre Table S1. El análisis multivariado de
la influencia de la IL-10 haplotipos en la supervivencia global y la supervivencia libre de recaída en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas en función del estadio.
doi: 10.1371 /journal.pone.0039525.s001 gratis (DOC) sobre Table S2. El análisis multivariado de
la influencia de tumor infiltrante recuentos de linfocitos en la supervivencia global y la supervivencia libre de recaída en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas.
doi: 10.1371 /journal.pone.0039525.s002 gratis (DOC)
Reconocimientos
Los FASC Calibur se llevó a cabo en el Centro de Escritura de la Universidad Médica Chung Shan, que se apoya por el Consejo Nacional de Ciencia, Ministerio de Educación y la Universidad médica Chung Shan.