Extracto
La capacidad de la interleucina-15 (IL-15) para activar muchos mecanismos inmunes antitumorales hace que el citoquinas un buen candidato para la terapia de tumores sólidos, particularmente carcinoma de células renales. Aunque la IL-15 está siendo utilizado actualmente en ensayos clínicos, la función de la citoquina en los componentes de los riñones no se ha estudiado de forma exhaustiva; de este modo, investigó el papel de IL-15 en las células epiteliales renales normales y tumorales. En esto, se analizó la expresión y las funciones biológicas de la IL-15 en los túbulos renales normales proximal (RPTEC) y en sus homólogos neoplásicas, los carcinomas de células claras renales (RCC). Este estudio muestra que RPTEC expresar un heterotrimeric complejo IL-15Rαβγc funcional cuya estimulación con concentraciones fisiológicas de rhIL-15 es suficiente para inhibir el compromiso del epitelio mesenquimal (EMT), la preservación de la expresión de E-cadherina. De hecho, la IL-15 no es sólo un factor de supervivencia para las células epiteliales, pero también puede preservar el fenotipo epitelial renal a través de la vía de señalización? C, lo que demuestra que la citoquina poseen una amplia gama de acción en la homeostasis epitelial. En contraste, en RCC
in vitro
y
in vivo
estudios revelan un defecto en la expresión de? C-receptor y JAK3 quinasa asociada, que fuertemente impactos IL-15 de señalización. En efecto, en ausencia de la? C /par JAK3 se demuestra el montaje de una alta afinidad de IL-15Rαβ heterodímero funcional sin precedentes, que en respuesta a concentraciones fisiológicas de IL-15, que desencadena una señal no balanceada causando la baja regulación del supresor de tumores gen E-cadherina, favoreciendo proceso de RCC EMT. Sorprendentemente, el rescate de la señalización /? C dependiente de IL-15 (STAT5), por co-transfección de? C y JAK3 en RCC, inhibe la reversión EMT. En conclusión, estos datos ponen de relieve el papel central de la IL-15 y? C-receptor de señalización en la homeostasis renal a través del control de la expresión de E-cadherina y la preservación del fenotipo epitelial tanto en RPTEC (regulación) y RCC (baja regulación).
Visto: Giron-Michel J, S Azzi, Khawam K, E Mortier, Caignard A, Devocelle A, et al. (2012) La interleucina-15 juega un papel central en la fisiología del riñón humano y el cáncer a través de la vía de señalización? C. PLoS ONE 7 (2): e31624. doi: 10.1371 /journal.pone.0031624
Editor: F. Eliane Meurs, Instituto Pasteur, Francia |
Recibido: 15 Abril, 2011; Aceptado 16 de enero de 2012; Publicado: 21 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Giron-Michel y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Agencia Francesa de Biomedicina, ARC (Asociación para la Investigación sobre el cáncer) (N ° RAC11005LLA), Inca, NRB-Vaincre le Cancer, AIRC proyecto (Associazione italiana per la Ricerca sul Cancro) IG 5642 y Ministerio italiano de salud. S.A. era un recipiente de Arco y NRB-Vaincre le Cancer becas de doctorado. K. K. era un destinatario de las becas de doctorado de la Société Française de Néphrologie, ARC y NRB-Vaincre le Cancer. M. C. era un beneficiario de una beca de la Fundación Italiana per la Lotta al neuroblastoma. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la interleucina-15 (IL-15) es una citoquina pleiotrópica que participan en la inmunidad innata, así como en funciones ajenas al sistema inmune. IL-15 diversidad funcional se explica en parte por sus complejos mecanismos de acción [1], [2] que implican no sólo las formas solubles y de membrana de la citoquina, sino también diferentes IL-15 receptores (IL-15R) con afinidades específicas y la transducción de señales vías [3], [4]. De hecho, la IL-15 se une a la cadena privada IL-15Ra con alta afinidad (Kd≥10
-11 M), que entrega una señalización específica en respuesta a IL-15 (NF-kappa B, Syk). IL-15 comparte con IL-2 de la IL-2Rβ (CD122) e IL-2Rγ (CD132,? C) subunidades, que forman o bien un receptor funcional de alta (IL-15Rαβγ, Kd≥10
-11 M) o afinidad intermedia (IL-15Rβγ, Kd = 4 nM) para la IL-15, lo que permite la señalización a través de una cascada que implica la vía JAK /STAT, MAPK y las vías de transducción de PI3-K
.
la cadena del receptor? c común es una componente clave de la familia de citocinas de cuatro hélices-paquete, lo que permite a través de su asociación con la Janus quinasa 3 tirosina (JAK3), la activación de las moléculas STAT (transductores de señal y activadores de transcripción) [5]. JAK3 fosforila diferentes STAT aguas abajo, en relación con el tipo de complejo receptor en cuestión. Por lo tanto, IL-4 indica predominantemente a través de STAT-6, mientras que la IL-2, IL-7, IL-9 e IL-21 actúan a través de STAT-1 y STAT-3 e IL-15 principalmente activa STAT-5 [6], [7], [8]. Tanto el? C y JAK3 son esenciales para la función de todos los receptores de citoquinas de esta familia y se requieren para el desarrollo del sistema de células linfoides. De hecho, los defectos genéticos de? C o JAK3 resulta en una deficiencia inmune combinada severa (SCID), caracterizada por la falta de T, B y células NK en ratones y seres humanos [9], [10], [11]. Sin embargo, hay que señalar que en los pacientes con SCID, la terapia génica correctiva para? C puede actuar como factor que contribuye a la génesis de los linfomas de células [9], [11]. La cadena IL-2Rγ también se expresa en células no linfoides y se detecta, por ejemplo, en ciertas células epiteliales tumorales [12], [13], [14], donde la cantidad de? C está implicada en los mecanismos que regulan el crecimiento celular. IL-2Rγ también se encuentra en las células epiteliales normales en los que modula la transducción de señales de los diferentes miembros de la familia? C incluso si sus funciones biológicas específicas todavía no se han definido claramente [13], [15], [16].
las células epiteliales humanas de diversos tejidos producen IL-15, que actúa no sólo en las células inmunitarias (por ejemplo, IELs en el intestino), sino también en las células epiteliales, principalmente a través de su acción anti-apoptótica [17], [18] , [19], [20]. Por lo tanto, se demostró que las células epiteliales tubulares de ratón renal humana y (RPTEC) expresan constitutivamente el receptor de IL-15Rαβγ [15] y secretar la citoquina IL-15 [21], que desempeña un papel importante en la fisiología renal como un factor de supervivencia autocrina . De hecho, el aumento de sensibilidad de las células a la apoptosis que se observa en el riñón dañado de IL-15 - /-, IL-15Ra - /- ratones knockout o durante la lesión renal aguda inducida por diferentes protocolos que inducen una disminución en la producción de IL-15 por epitelial las células [20], [22]. IL-15 mejora la función de barrera intestinal mediante la promoción de la formación de uniones estrechas entre las células epiteliales [23]. Estos resultados sugieren que el factor de supervivencia de IL-15 puede tener otras funciones, que aún no se han explorado en las células epiteliales renales [15], [24], [25], [26].
Debido a su inmuno actividad -Estimular en varios modelos preclínicos, el uso de IL-15 podría ser una citoquina útiles para el tratamiento de los cánceres de riñón. Aunque la IL-15 está siendo probado en ensayos clínicos para el tratamiento de cáncer de riñón (Protocolo NCT01021059) [2], las funciones de la citocina en las células epiteliales normales, así como las células tumorales siguen siendo poco estudiados. A fin de comprender mejor las funciones de la citoquina, se propone para estudiar el sistema de IL-15 /IL15R en las células epiteliales de riñón humano de origen normal (RPTEC) y en células de origen tumoral (RCC).
Nuestra datos muestran que tanto
in vitro y células in vivo
primarios normales renales proximales tubulares (RPTEC) expresan el receptor de IL-15Rαβγ, mientras que la expresión de la cadena? c y JAK3 está gravemente deteriorada en células de cáncer claras renales (RCC) . La expresión diferencial de la cadena? C y JAK3 tiene un impacto marcado en la homeostasis renal desde soluble IL-15 en RPTEC a través de la vía de señalización de la cadena? C conserva la expresión del gen supresor tumoral E-cadherina, la inhibición de su transición compromiso epitelial-mesenquimal (EMT) . Por el contrario, la pérdida de la cadena? C y JAK3 en RCC primario conduce a la formación de un funcional IL-15Rαβ heterodímero alta afinidad sin precedentes, cuya estimulación con soluble IL-15 provoca la baja regulación de la expresión de E-cadherina favoreciendo el proceso de EMT .
Materiales y Métodos
Los anticuerpos, citoquinas, y Reactivos
Los anticuerpos (Acs) contra IL-15 (I-20), IL-15Ra (sc-9172) , IL-2Rβ (sc-1046), IL-2Rγ (sc-670), JAK3 (sc-513), y vimentina (sc-73260) se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Delaware, CA). Los anticuerpos contra ERK fosforilado (4377), I? B fosforilada (4921), STAT5 (9358) STAT5 fosforilada (9356), y el anticuerpo monoclonal de conejo fluor conjugado con Alexa contra se obtuvieron de Cell Signaling (Beverly, MA) STAT5 fosforilada (3939). Los anticuerpos contra IL-15Ra (AF247), E-cadherina (AF648) y PE-conjugado anti-E-cadherina (FAB18381P) se obtuvieron a partir amp I +; D Systems Europe Ltd (Abingdon, Oxon, Reino Unido), así como la neutralización de anti IL-2Rγ (mAb2842) mAb. El ASO2 anti-fibroblastos conjugado con FITC era de
Dianova
GmbH (Hamburgo, Alemania) y el pan-citoqueratina (CK) Ab de EXBIO (Praga, República Checa). faloidina conjugada con rodamina para la detección y zonula F-actina occludens-1 (ZO-1) se obtuvieron de Invitrogen (Cergy Pontoise, Francia). Anticuerpo contra JAK3 (07-1488) fue de Millipore (de Saint-Quentin-en-Yvelines, Francia) y anti-IL-2Rβ (AB364) era de Assay Biotech (Innovaciones Interchim BioScience, Francia). El anticuerpo monoclonal anti-β-actina (A1978) fue de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Recombinante IL-15 humana no glicosilada (rhIL-15) y la neutralización de Mikβ1 mAb anti-IL-2Rβ se obtuvieron de ImmunoTools (Friesoythe, Alemania) y peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con y fluorescentes conjugado Abs secundarias eran de Jackson ImmunoResearch. inhibidor de JAK3 (CP-690, 550) y el inhibidor de STAT5 (573108) se adquirieron de Calbiochem (SD, CA). Anti-IL-15Ra M161 mAb fue proporcionado por Amgen (Thousand Oaks, CA).
células y líneas celulares primarias
humana normal de la célula primaria renal proximal tubular epitelial (RPTEC) deriva de un no cancerosa del riñón (Lonza, Verviers, Bélgica) y ampliado
in vitro
siguiendo las instrucciones del fabricante. REGM medio de cultivo de RPTEC se cambió diariamente para mantener características epiteliales. células tumorales primarias se obtuvieron por digestión enzimática de fragmentos de carcinomas renales de células claras (RCC) como se describe anteriormente [27]. Posteriormente, las suspensiones celulares digeridos fueron sembradas en placas de Petri de plástico utilizando RPMI 1640 suplementado con 10% de suero de ternero fetal, 1% de piruvato de sodio MEM, 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies). En estas condiciones de cultivo, sólo una fracción de las células se adhiere a la superficie de plástico y prolifera, generando RCC cultivos primarios y posteriormente célula líneas (RCC5, RCC7, RCC8).
El carcinoma de riñón humano ACHN (ATCC, CRL- 1611), MCF-7 (células de cáncer de mama humano) y U937 (células de leucemia monocítica humana) líneas de células se cultivaron como se describe anteriormente. La línea celular de eritroleucemia TF1β se mantuvo en medio RPMI 1640 suplementado con 5 ng /ml de GM-CSF y /G418 250 mg ml de geneticina. Los linfocitos de sangre periférica (PBL) se prepararon como se describe anteriormente [28]. Las muestras humanas fueron recogidas y manipuladas en el pleno respeto de la Declaración de Helsinki.
transcripción inversa (RT)-PCR análisis.
con transcripción inversa (RT)-PCR análisis se realizó como se descrito anteriormente [29]. Específicos cebadores de RT-PCR se detallan a continuación
IL-15Ra F 5'-GGCGACGCGGGGCATCAC.; R 5'-TGCCTGTGGCCCTGTGGATA; IL-2Rβ F 5'-GAATTCCCTGGAGAGATGGCCACGGTCCCA; R 5'-GAATTCGAGGTTTG GAAATGGATGGACCAAGT; cadena? c F 5'-CCAGGACCCACGGGAACCCA; R 5'-GG TGGGAATTCGGGGCATCG; JAK3 F 5'-CGTTCATGCAGCCTCTTGTTC; R 5'-GCGCA CCGTCCTCCGAATAC; β-actina F 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA; R-5 'CTCCTTA ATGTCACGCACGATTTC.
IL-15 ensayos de unión
Humano RIL-15 fue radiomarcado con yodo (radiactividad específica de aproximadamente 2.000 cpm /fmol), utilizando un método de cloramina T y la unión de los experimentos se realizaron como se describe anteriormente [30]. La unión no específica se determinó en presencia de un exceso de 100 veces de citocina sin marcar. Para los experimentos de unión de IL-15, las células RCC7 se incubaron con concentraciones crecientes de rIL-15 marcada. El análisis de regresión de los datos de unión se llevó a cabo usando una ecuación de equilibrio de unión de un sitio (Grafit, Erithacus Software, Staines, Reino Unido), y los datos se representaron gráficamente en el sistema de coordenadas de Scatchard. Para la inhibición de IL-15 experimentos de unión, se incubaron las células RCC7, en presencia de concentraciones crecientes de yodado rIL-15, y las concentraciones de anticuerpos neutralizantes contra IL-2Rβ (Mikβ1, 10 g /ml) o IL-2Rγ fijos (mAB2842 , 1 mg /ml) cadenas. El análisis de regresión de los datos se realizó usando un 4-parámetro ecuación logística (Grafit, Erithacus Software).
Plásmidos y transfección transitoria
etiquetado-Myc-DDK
pCMV6 vector de codificación de longitud completa de ADNc de ORF de interleuquina 2 receptor gamma (IL2Rγ) se adquirió de Origene Technologies Inc (Rockville, MD, EE.UU.) y humano de longitud completa de cDNA JAK3 subclonó entre los sitios de restricción EcoRI-XhoI del
pcDNA3.1
vector de expresión eucariota fue una especie de regalo del Dr. Franck Gesbert (UMR1004, INSERM, Francia). Los plásmidos se transformaron en 10 células de las bacterias competentes Top de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA), se extrajo utilizando un kit de maxiprep (Qiagen, Valencia, CA), y se amplifican por cultivo en caldo de Luria-Bertani-ampicilina. ADNc se transfectaron transitoriamente en células de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron en placas de seis pocillos (0,25 × 10
6 células /pocillo) y cultivadas durante la noche en medio completo. La mezcla de transitorio, que contenía 1,0 g de ADN plásmido y 6 l de Fugene 6 reactivo de transfección (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) en 100 l de medio libre de suero DMEM (Invitrogen), se mezcló durante 20 min a temperatura ambiente y después se añadió a cada pocillo con medio completo durante 48 h. El vacío
pcDNA3.1 Gráficos vectoriales se transfectó como control.
Los análisis de citometría de flujo
Para todos los ensayos descritos a continuación, se adquirieron los datos de fluorescencia para 10.000 células en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences) y los datos se analizaron utilizando el software CellQuest (BD Biosciences). Se utilizaron tres réplicas para cada condición y el experimento se repitió al menos tres veces.
Expresión de antígenos celulares.
La expresión de la superficie celular (E-cadherina) e intracelular (vimentina, Pan CK) antígenos se analizó por citometría de flujo como se describe anteriormente [29], [31], [32]. Brevemente, las suspensiones de células enzimáticamente separados se permeabilizaron o no con BD Cytofix /Cytoperm reactivo (BD Pharmingen, Le Pont de Claix, Francia), y 10
5 células se suspendieron en medio RPMI suplementado con 1% de FCS y se tiñeron con conjugado anticuerpos dirigidos contra los marcadores de células mencionados anteriormente. Posteriormente, las células se fijaron mediante incubación con 1% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 20 minutos a temperatura ambiente y se analizaron por citometría de flujo.
STAT5 de activación.
Hemos investigado la activación de STAT5 en RCCWT (RCC tipo salvaje) y la IL-2Rγ y /o RCC JAK3 transfectadas mediante el tratamiento de las células con 10 pg /ml de rhIL-15 durante 40 minutos. Tratadas y las células no tratadas fueron separadas por la tripsina, se lavaron y se fijaron mediante incubación con 1% de paraformaldehído en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se permeabilizaron mediante la resuspensión, con agitación, en metanol enfriado con hielo y se incubaron a 4 ° C durante 10 minutos. Se lavaron las células en 1% de BSA en PBS y se incubaron con un anticuerpo monoclonal de ratón Alexa Fluor 488-conjugado contra STAT5 fosforilada durante 60 minutos a 4 ° C.
inmunoprecipitación e inmunoblot análisis
Todo inmunotransferencia (BM) se realizaron como se describe anteriormente [29]. Para la inmunoprecipitación, sedimento celular PBS-lavada se lisaron en 1 ml 1% NP-40 y 0,1% de SDS, 50 mM de tampón de fosfato de sodio de pH 7,8, NaCl 150 mM, ortovanadato de sodio 1 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, 1 mM AEBSF, aprotinina, leupeptina y pepstatina (5 mg /ml cada uno). Después de 15 min de agitación a 4 ° C, se centrifugó la suspensión (30 min a 14.000 rpm, 4 ° C). El sobrenadante se añadió a 20 l de Sepharose conjugada-M161 (anti-IL-15Ra, 2 g /l). Después de 4 h de agitación a 4 ° C, los complejos inmunes se lavaron 5 veces con 1 ml de tampón de lisis y se aplican en 10% PAGE-SDS. Las transferencias se procesaron como se describe anteriormente [29].
inmunocitoquímica
Las células se distribuyeron en ocho pocillos compartimentos de Lab-Tek cámara de diapositivas de cultivo de tejidos (1 x 10
5 células por pocillo ;. Nunc, Naperville, Illinois) y en la confluencia, tratados o no con 10 pg /ml de rhIL-15 durante 5 días. Para la tinción de membrana, las células se fijaron con methanol:acetone frío (01:01) a -20 ° C durante 10 min, después se lavó bloqueados con PBS 3% de BSA durante 60 min. Las células se incubaron con anticuerpos anti-E-cadherina ASO2 anti-humano o conjugados con FITC durante la noche a 4 ° C. Posteriormente, se lavaron las células, se incubaron durante 30 min con un anticuerpo anti-cabra de conejo conjugado con AlexaFluor488. Para la tinción intracelular, las células fueron fijadas con 4% (peso /vol) de paraformaldehído en PBS y se permeabilizaron mediante incubación durante 1 minuto con 0,5% Triton X-100 en PBS. Las células se incubaron con solución de bloqueo (BSA 3% en PBS) y se incubaron durante la noche a 4 ° C con los diferentes anticuerpos. Después, las células se lavaron y se incubaron con Alexa Fluor 488 de conejo conjugado con anti-ratón o anti-IgG de cabra diluido en solución de bloqueo y se incubaron durante 30 minutos. organización F-actina se reveló la tinción de las células con 0,2 mg /ml de faloidina conjugada con rodamina durante 20 minutos. Las células se lavaron con PBS, montado en 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI, Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia), y se visualizaron por microscopía de fluorescencia (Leica, Alemania).
inmunohistoquímica en parafina tumor renal incorporado y muestras normales
Las biopsias de 3 normal y 10 secciones de tumores de los riñones nefrectomizadas con carcinoma de células renales se seccionaron a 4 micras en Superfrost además de toboganes. diapositivas Deparaffinized se rehidrataron en alcoholes graduados, y se somete a calor inducida por recuperación del epítopo sumergiéndolos en /L de tampón de citrato 0,01 mol (pH 6,0). Las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con anti-IL-2Rβ (AB364), anti-IL-2Rγ (sc-670) o anti-JAK3 (07-1488) Abs, PBS-aclararon y se incubaron con Ab-HRP secundario para 45 min. El análisis se realizó por métodos estándar utilizando diaminobencidina después de la contratinción de las secciones con hematoxilina. El control negativo fue sometido a todos los tratamientos de omitiendo el anticuerpo primario. Las láminas fueron escaneados utilizando un escáner de Aperio (Vista, CA) y la tinción se cuantificó usando un software TRIBVN morfométricos (Montrouge, Francia).
Resultados
expresión en RPTEC IL-15R y RCC cultivos primarios
con el fin de arrojar luz sobre la función de la IL-15 en el modelo humano renal, se determinó la expresión de IL-15 subunidades del receptor (IL-15Rαβγ) en cultivos primarios de células renales normales proximal tubular epitelial ( RPTEC) y carcinomas de células claras renales (RCC).
análisis de RT-PCR (Figura 1, panel superior) muestra que RPTEC, de acuerdo con el control positivo PBL, expresan diferentes transcripciones de la cadena de IL-15Ra ( 432 y 531 pb), la transcripción de la IL-15Rβ (542 pb) y la transcripción de la cadena? c (480 pb). En contraste, sólo el cadenas beta IL-15Ra y, pero no la cadena? C, se detectaron, ya sea en RCC (RCC5 y RCC7) o línea de células ACHN. Desde JAK3 quinasa interactúa específicamente con su cadena? C receptor afín, y la expresión de ambas moléculas es interdependiente [33], que además analiza, por RT-PCR, la expresión de JAK3 en las células renales normales y tumorales (Figura 1A, panel inferior). JAK3 quinasa se detectó en la línea celular de control positivo hematopoyética TF1β y RPTEC, mientras que una cantidad mensajero débil o ausente (RCC8) se detectó en RCC analizadas. No mensajero JAK3 se detectó en la célula de control MCF-7 [34]
.
Análisis de IL-15R y la expresión de JAK3 se realizó por RT-PCR (A) e inmunotransferencia (B) en Normal primaria (RPTEC) y tumoral (RCC5, RCC7, RCC8) las células epiteliales y la línea celular ACHN. Los datos muestran que RPTEC expresan las tres cadenas de la IL-15R (αβγ) y JAK3 mientras que las proteínas? C y JAK3 no se detectaron en RCC. primers específicos o Abs contra IL-15Ra (AF247), IL-2Rβ (sc-1046), IL-2Rγ (sc-670) y se utilizaron JAK3 (SC-513). PBL, TF1β, MCF7 y células U937 activadas con IFN se utilizaron como controles. La limpieza β-actina se utilizó como control de carga.
Para confirmar la expresión diferencial de las subunidades del receptor y la quinasa JAK3 a nivel de proteínas, la inmunotransferencia se realizó tanto en células normales y tumorales. El análisis confirmó que RPTEC, RCC y células TF1β expresan dos bandas principales de 46 y 56 kDa específico para la IL-15Ra (Figura 1B, panel superior) y una banda de 75 kDa para la cadena IL-15Rβ (Figura 1B, panel central) . La ausencia de la cadena? C en RCC se confirmó ya que la banda de 64 kDa se detecta exclusivamente en las líneas de control positivo de células (TF1β y U937 tratadas con IFN-γ) y RPTEC (Figura 1B, panel central). se detectó molécula de JAK3 (116 kDa) en TF1β y las células RPTEC, mientras que inmunotransferencia no detectar la quinasa en RCC, así como en las células MCF-7 y IFN-γ tratada líneas celulares de control de U937 como se informó anteriormente [34], [35] (Figura 1B, panel inferior). En todos los experimentos antes mencionados, también estudiamos renales línea celular ATCC CRL-1611-(ACHN) que muestran IL-15R y la expresión homóloga JAK3 a los observados en las muestras primarias RCC.
Pérdida de la cadena? C en renal las muestras de tejido de carcinoma de células claras
con el fin de confirmar nuestros
in vitro
datos, la cadena IL-2Rβ, cadena? c JAK3 y coloraciones de inmunohistoquímica se realizaron en secciones normales y tumorales de riñón nefrectomizadas con células renales carcinoma. Hematoxilina tinción de secciones de riñón humano incluidos en parafina reveló bajo microscopio de luz la presencia de glomérulos (Gl) y los túbulos varios distal (Dt) y proximal (PT) en las muestras de tejido normal (Figura 2). Por el contrario, estas estructuras renales ya no están presentes en la sección de carcinoma renal, que muestra células tumorales con morfología de células claras, caracterizado por citoplasma ópticamente claro y la membrana celular claramente delineada.
hematoxilina tinción de las biopsias de 2 muestras normales revela la presencia de las estructuras normales del riñón (glomérulo (Gl), distal (Dt) y proximal (Pt) túbulos), mientras que el análisis de dos muestras de cáncer de diferentes muestra que la arquitectura del tejido normal es totalmente perdido y se sustituyen por las células tumorales con células claras morfología, que se caracteriza por citoplasma ópticamente claro y la membrana celular claramente delineada. Considerando que no se observa diferencia en IL-2Rβ entre las muestras normales y tumorales de tejido, la tinción de IL-2Rγ, localizado en tanto proximal y distal túbulos en muestras de tejido normal, no se encuentra en las muestras tumorales. Una fuerte tinción JAK3 se localiza en tanto las células tubulares proximales y distales de los tejidos normales, mientras que una expresión de la proteína JAK3 muy débil se detecta en muestras de tumores. Dos muestras representativas de un total de diez se muestran para cada tinción. El control negativo fue sometido a todos los tratamientos de omitiendo el anticuerpo primario. Las barras de escala, 50 m. La tinción se cuantificó usando un software TRIBVN morfométrico (Montrouge, Francia) y los resultados se presentan como histogramas.
La tinción inmunohistoquímica en dos muestras renales normales diferentes revela que la cadena, la cadena? C IL-2Rβ y un fuerte JAK3 expresión se detectó en las células tubulares proximales y distales. Por el contrario, el análisis de diferentes muestras de tumores reveló la ausencia de tinción de la cadena? C (P & lt; 0,01) con una expresión de la proteína JAK3 muy débil (P & lt; 0,01), mientras que, no hay diferencias significativas (P & gt; 0,05) en la expresión de la IL-2Rβ se observaron en cadena entre los tejidos normales y tumorales, por tanto, que confirman los resultados obtenidos
in vitro Hoteles en cultivos primarios de células normales y cancerosas.
soluble de IL-15 dispara una señal diferencial de células en el RCC y RPTEC
a nuestro entender, el heterodímero IL-15Rαβ sólo fue descrito en la IL-2Rγ - /- ratones knockout, que exhibe una unión endocitosis y eficiente de radiomarcado IL-15 [36]. Sin embargo, los autores no investigaron si existe el heterodímero IL-15Rαβ como un complejo preformado o se forman después de la unión de la IL-15 con ello la generación de un heterodímero funcional.
Para evaluar la unión de IL-15 en la RCC? C-negativas, se analizaron primero radiomarcado recombinante humano IL-15 (rhIL-15) la unión a células RCC7 por análisis de la representación de Scatchard (Figura 3A). Los datos revelan la presencia de una sola clase de receptores de alta afinidad (Kd = 375 pM, 413 IL-15 sitios de unión por célula). IL-15 La unión específica fue completamente abrogada por la anti-IL-2Rβ mAb Mikβ1 (Figura 3A, inserción), mientras que la neutralización de anti-IL-2Rγ mAb no tuvo efecto sobre específico IL-15 de unión, lo que sugiere que la unión de hecho refleja la presencia de un complejo de IL-15Ra /IL-2Rβ
a) análisis de la representación de Scatchard:. Los efectos de anti-IL-15Rβ y mAb? c de IL-15 de la unión a CCR. Para los experimentos de unión de IL-15, las células RCC7 se incubaron con concentraciones crecientes de rIL-15 radioyodado en presencia o no de los siguientes mAbs neutralizantes anti-IL-2Rβ y IL-2Rγ. La célula de unión no específica se determinó en presencia de radioyodado rhIL-15 y un exceso de 100 veces de no marcado rhIL-15. Unida a la célula fracciones libres (gratis, F) (B) y se midieron, y la fracción unida específica se calculó restando la unión no específica de la fracción unida a las células. En el eje de ordenadas se representa la relación de la fracción unida específica (expresada en sitios por célula) sobre la concentración total (unida más libre) de radioyodado rIL-15 (expresado en horas). En la fracción unida abscisa (expresada en sitios por célula). La alta afinidad específica de unión a IL-15 (Kd = 375 pM, 413 IL-15 sitios de unión por célula), que fue completamente abrogada por anticuerpos neutralizantes en contra de la IL-2Rβ (recuadro), pero no la cadena? C, sugirió la presencia de RCC de un complejo de IL-15Ra /IL-2Rβ. B) Detección del complejo de IL-15Rαβ por inmunoprecipitación (IP) con anti-IL-15Ra (M161) o proteína IgG de ratón G-Sepharose-conjugado en el total de lisado (TL) de RCC7. complejos inmunoprecipitadas fueron borrados o bien con anti-IL-2Rβ (sc-1046) y anti-IL-15Ra (sc-9172). C) Estimulación de 10 y 40 min con fisiológica (10 pg /ml) y supra-fisiológica (10 ng /ml) concentraciones de rhIL-15 induce la fosforilación de la MAPK ERK1 /2 y I? B? En RPTEC y RCC7, mientras que la activación STAT5 era sólo se observa en RPTEC. Los histogramas representan comparación densitometría de cada factor normalizado a ß-actina en 3 diferentes RCC (RCC5, RCC7, RCC8) y 3 lotes RPTEC. * P & lt; 0,05 frente al control, prueba de Mann-Whitney. Se muestra un experimento representativo de un total de tres.
Para confirmar la presencia de un complejo heterodímero IL-15Ra /IL-2Rβ, las interacciones potenciales entre las cadenas de IL-15Ra e IL-2Rβ en RCC se investigó la realización de experimentos de co-inmunoprecipitación de lisados de células RCC7 por inmunoadsorción a Sepharose conjugada con anti-IL-15Ra (M161) (Figura 3B). Anti-IL-2Rβ inmunotransferencia revela la presencia de una proteína específica 75 kDa (panel superior), mientras que anti-IL-15Ra blot, realizado en la misma membrana, muestra la expresión de las bandas específicas de 56 y 46 kDa (panel inferior), indicando que IL-2Rβ y IL-15Ra subunidades del receptor son constitutivamente asociada, la formación de un heterodímero IL-15Rαβ en ausencia de la citoquina.
con el fin de determinar si el complejo IL-15Rαβ expresa en RCC es funcional, se investigó activación de transducción de señales en las células renales normales y tumorales tratados con fisiológica (10 pg /ml) y supra-fisiológica (10 ng /ml) concentraciones de rhIL-15 (Figura 3C). La estimulación con rhIL-15 (10-40 min) inducida en RCC7 la fosforilación de la MAPK ERK1 /2 en ambas concentraciones, mientras que no fosforilación STAT5 se observó incluso en presencia de 10 ng /ml de rhIL-15 (Figura 3B, panel superior ). En contraste, en RPTEC que expresa el complejo receptor heterotrimeric, se indujo la activación de la MAPK ERK1 /2 y STAT5 en respuesta a 10 pg /ml y 10 ng /ml de rhIL-15. Por otra parte, hay una rápida fosforilación de I? B?, Un evento clave en la activación del factor de transcripción NF-kB, en RPTEC y RCC7 en respuesta a fisiológica concentración rhIL-15 (Figura 3B, panel inferior), indicando que la IL-15Rαβ complejo se une a IL-15 en la alta afinidad y es funcional.
soluble de IL-15 controla la expresión de e-cadherina en las células epiteliales renales
e-cadherina es responsable del mantenimiento de las interacciones de las células epiteliales y es con frecuencia las reguladas durante la progresión tumoral [37]. Por lo tanto, se investigaron los efectos de la rhIL-15 sobre la expresión de E-cadherina en tanto RCC7 y RPTEC por análisis de inmunofluorescencia (Figura 4A) e inmunotransferencia (Figura 4B). Para evaluar el efecto de rhIL-15 en RPTEC normales, se utilizó un modelo celular cuando la privación de corticosteroides, que son potentes inductores de la E-cadherina [38], junto con la ausencia de renovación del medio diario lleva un plazo de cinco días a la disminución de E-cadherina expresión, sin afectar la viabilidad celular (97%, datos no mostrados). El análisis de inmunofluorescencia (Figura 4A) muestra que las células epiteliales normales RPTEC en los primeros pasajes (p2) muestra una morfología de tipo epitelial que se caracteriza por un alto nivel de expresión en la membrana de E-cadherina (d0 basal) en contraste con cinco días de edad RPTEC (d5 basal ) que exhiben una baja expresión de E-cadherina en ausencia de renovación del medio día. La adición de 10 pg /ml de rhIL-15 durante cinco días conserva el nivel de E-cadherina inicial y por lo tanto, una morfología de tipo epitelial. En contraste con RPTEC, RCC7 en el día 0 y el día 5 muestran una expresión de E-cadherina débil, que desaparece después de 5 días de tratamiento rhIL-15 (Figura 4A). Análisis de inmunotransferencia (Figura 4B) muestra claramente los efectos opuestos de rhIL-15 en la expresión de la forma de 120 kDa E-cadherina madura en RPTEC frente RCC (día 5).
El análisis de inmunofluorescencia (A) y (inmunoblot B) muestran que 5 días rhIL-15 de tratamiento (10 pg /ml) conserva la membrana expresión de E-cadherina en la normal de las células epiteliales RPTEC primaria, mientras que induce su baja regulación de RCC7. El medio de cultivo de RPTEC no se ha modificado con el fin de inducir a la disminución de la expresión de E-cadherina. El tratamiento con rhIL-15 se renovó en el día 3. Los histogramas representan la comparación de densitometría inmunotransferencias E-cadherina se normalizaron a ß-actina en 3 diferentes células RCC (RCC5, RCC7, RCC8) y 3 lotes RPTEC.