Extracto
El cáncer de ovario sigue siendo el cáncer ginecológico más letal y nuevas terapias moleculares dirigidas contra esta enfermedad muy molesta continúan siendo un reto. En este estudio, se analizaron los patrones expresivos de la interleucina-6 (IL-6) y su receptor (IL-6R) expresión en tejidos de cáncer de ovario, evaluamos el impacto de estas expresiones en los resultados clínicos de los pacientes, y se encontró que un alto nivel de expresión de IL-6R, pero no IL-6 expresión en las células cancerosas es un factor pronóstico independiente. En
in vitro
análisis utilizando líneas celulares de ovario, mientras que seis (RMUG-S, RMG-1, OVISE, A2780, SKOV3ip1 y OVCAR-3) de siete sobreexpresada IL-6R en comparación con una primaria epitelio superficial ovárico normal , sólo dos (RMG-1, OVISE) de siete líneas celulares sobreexpresa IL-6, lo que sugiere que la IL-6 de señalización /IL-6R ejerce de una manera paracrina en ciertos tipos de células de cáncer de ovario. El cáncer de ovario ascitis se recogieron de pacientes, y hemos encontrado que CD11b primaria
+ CD14
+ células, que eran predominantemente macrófagos polarizadas-M2, son la principal fuente de producción de IL-6 en un microambiente del cáncer de ovario. Cuando CD11b
+ CD14
+ células fueron co-cultivadas con células de cáncer, tanto la invasión y la proliferación de las células cancerosas se robustamente promovidos y estas promociones se inhibió casi completamente por el pretratamiento con anticuerpo anti-IL-6R (tocilizumab ). Los datos presentados en este documento sugieren una base para la terapia anti-IL-6 /IL-6R para suprimir la propagación peritoneal de cáncer de ovario, y representan evidencia del potencial terapéutico de anti-IL-6R terapia para el tratamiento del cáncer de ovario.
Visto: Isobe A, Sawada K, Kinose Y, Ohyagi Hara-C, E Nakatsuka, Makino H, et al. (2015) La interleucina 6 receptor es un factor pronóstico independiente y una posible diana terapéutica del cáncer de ovario. PLoS ONE 10 (2): e0118080. doi: 10.1371 /journal.pone.0118080
Editor Académico: Goli Samimi, Instituto Garvan de Investigación Médica, AUSTRALIA
Recibido: 1 de octubre de 2014; Aceptado: January 5, 2015; Publicado: 6 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Isobe et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas a la investigación científica del Ministerio de Educación, Ciencia, Deportes y Cultura de Japón (21791555 y 23592447 de KS, 22.390.308 a HK y 23659779 a los conocimientos tradicionales). Este trabajo también fue apoyado en parte por la Fundación de Investigación Médica de Osaka para enfermedades intratables (KS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la principal causa de muerte por tumores malignos ginecológicos. datos convincentes recientes apoyan la implicación del microambiente estromal inflamatoria, causado por la sobre-expresión de citocinas o quimiocinas, en la promoción de tumorigénesis de ovario, la progresión del cáncer y la resistencia a la quimioterapia. [1] Por lo tanto, la orientación de estas citoquinas desde el microambiente del estroma puede ofrecer una prometedora estrategia terapéutica para mejorar la gestión de los pacientes con cáncer de ovario
Entre las citoquinas informado hasta el momento, la interleucina-6 (IL-6) es una de las citoquinas inmunorreguladoras fundamentales presentes en el microambiente del cáncer de ovario.; induce varias vías que conducen a tumor proliferación, angiogénesis y quimiorresistencia. [2] Superior de suero y ascitis niveles de IL-6 se han encontrado en pacientes con cáncer de ovario que en los pacientes con otros tumores malignos, y los niveles se ha demostrado que se correlaciona con el grado de la enfermedad y los pobres resultados clínicos. [3-5] Aunque Rath et al. mostró recientemente que IL6-R expresión es altamente expresado en tejidos de cáncer de ovario en comparación con tejidos normales o enfermedades benignas, [6] no se ha examinado el impacto clínico de IL6-R expresión en especies de cáncer de ovario. Por lo tanto, nos animaron a investigar los valores clínicos de IL-6 e IL-6R en tejidos de cáncer de ovario utilizando los microarrays de tejidos (TMA) que construimos y los datos clínicos correspondientes.
Parece que antagonizar IL-6 /señalización de IL-6R puede tener actividad terapéutica en pacientes con cáncer de ovario a través de la inhibición de una red de citoquinas que promueven tumor. De hecho, dirigido 6 anti-IL-terapia con anticuerpos se ha usado en los ensayos clínicos y se encontró que ser bien tolerado en pacientes de varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de ovario. [7] El tocilizumab (Chugai Pharmaceutical, Shizuoka, Japón), es un anti- humanizado anticuerpo y IL-6R humano se une al sitio de IL-6 de unión de IL-6R humano. Se sabe para inhibir competitivamente la IL-6 /señalización de IL-6R y neutraliza completamente IL-6 actividades. [8, 9] Una serie de estudios clínicos han demostrado con éxito que la supresión de la señalización de IL-6 /IL-6R por tocilizumab es terapéuticamente en efectivo a aliviar la enfermedad de Castleman y la artritis reumatoide. [10, 11] en vista de su éxito en el tratamiento de estas enfermedades, tocilizumab puede resultar útil en el tratamiento de cánceres relacionados con IL-6 y nos motivó a dilucidar el potencial terapéutico de tocilizumab contra el cáncer de ovario.
a pesar de que no sólo las células de cáncer de ovario, pero los macrófagos asociados a tumores se han reportado para producir IL-6, [12, 13] que sigue siendo discutible si el aumento de los niveles de IL-6 en pacientes con cáncer de ovario son producidas por el tumor sí o principalmente por los tejidos del huésped. La mayoría de los pacientes con cáncer de ovario en etapas avanzadas presentes enfermedades metastásicas peritoneales, a menudo acompañados por ascitis masiva. [14] ascitis masiva de pacientes consisten no sólo las células cancerosas, pero también fibroblastos, células endoteliales y predominantemente células inmunes, todos los cuales son cruciales para el crecimiento del cáncer, la progresión y la metástasis. se cree que [15] Los macrófagos peritoneales de jugar un papel fundamental en este contexto, como se evidencia por varios estudios que encuentran que el agotamiento de los macrófagos en modelos de cáncer de ovario peritoneales suprime la progresión del cáncer y la acumulación de ascitis. [16, 17] los macrófagos que se infiltran en los tejidos tumorales, que se conocen como los macrófagos asociados al tumor (TAM), son contribuyentes bien conocidos para la progresión del tumor y se asocian con el mal pronóstico de varios cánceres. [18, 19] Desde TAM son conocidos liberar varias citoquinas y factores de crecimiento proangiogénicos, la hipótesis de que los macrófagos podría ser una de las posibles fuentes responsables de la IL-6 enriquecido acumulación de ascitis de cáncer de ovario.
en este contexto, hemos intentado analizar el patrón de expresiva de IL 6R, así como el uso de cáncer de ovario TMA y para evaluar el impacto de estas expresiones en los resultados clínicos de los pacientes. ascitis de cáncer de ovario se recogieron de pacientes que se sometieron a cirugía y se encontró que primaria CD11b
+ CD14
+ células, que eran predominantemente M2 polarizado-TAM, eran la principal fuente de producción de IL-6 en un microambiente del tumor de ovario y robustamente promovido la invasión del cáncer de ovario y la proliferación. Los datos presentados en este documento sugieren una base para la terapia anti-IL-6 /IL-6R para suprimir la propagación peritoneal de cáncer de ovario y proporcionar evidencia del potencial terapéutico de la terapia anti-IL-6R a curar esta enfermedad miserable.
Materiales y Métodos
ética Declaración
las muestras de pacientes se obtuvieron con consentimiento informado por escrito de conformidad con los requisitos del comité de ética de los institutos y la Declaración de Helsinki. Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Osaka Escuela de Medicina aprobó este protocolo de estudio en 2011/02/15 (Nº 10064). IRB de la Universidad de Gifu Facultad de Medicina aprobó el 02.07.2012 (Nº 26-50).
Materiales
Los anticuerpos frente a IL-6 (R-49L), IL- 6R (C-20) y STAT3 total (C-20) eran de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Se obtuvo IL-6 humana recombinante de Chemicon (Temecula, CA) y humana recombinante sIL-6R era de amp I +; D Systems (Minneapolis, MN). Los anticuerpos contra-total p44 /42 MAPK (ERK 1/2) (3A7), fosforilada (Thr202 /Tyr204) p44 /42 MAPK (p-ERK 1/2) (E10), fosforilado (Tyr705) STAT3 (p-STAT3) y β-actina fueron de Señalización celular (Beverly, MA). anticuerpo humanizado anti-IL-6 humana del receptor, tocilizumab, fue proporcionado amablemente por Chugai Pharmaceutical Co. Ltd. (Shizuoka, Japón) y no inmune IgG humana se adquirió de Jackson Immuno Research (West Grove, PA). Anticuerpo contra CD68 (AP-25747-1) se adquirió de Proteintech Group Inc. (Chicago, IL, EE.UU.). proteínas de crecimiento reducida de factor-membrana basal (Matrigel) y las cámaras 24 transwell se compraron de BD Biosciences (Bedford, MA).
Cultivo de células
El ovario líneas celulares de cáncer, A2780 y CaOV3, fueron adquiridos de American Type Culture Collection (Rockville, MD). RMUG-S, OVISE y líneas celulares RMG-1 se obtuvieron a partir de la investigación de la ciencia Banco de Recursos de Salud (Osaka, Japón). OVCAR-3 células fueron desde el Centro de Recursos de la célula para la Investigación Biomédica, Instituto de Desarrollo, Envejecimiento y Cáncer de la Universidad de Tohoku (Sendai, Japón). SKOV3ip1 células fueron amablemente proporcionados por el Dr. Ernst Lengyel (Universidad de Chicago, Chicago, IL). Las células se cultivaron en DMEM suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1.000 U /ml de penicilina /estreptomicina, se incubó en 95% de aire /5% de CO
2 a 37 ° C. Se establecieron células A2780, CaOV3, OVCAR-3 y SKOV3ip1 de adenocarcinomas papilares serosos de ovario humano. células RMUG-S eran de una cystadenocarcinoma mucinoso de ovario humano. OVISE células y RMG-1 eran de carcinomas de células claras de ovario humano. células de ovario primario epitelio superficial (OSE) se obtuvieron a partir de muestras de ovarios normales de los pacientes que se sometieron a cirugía para condiciones benignas en el Hospital de la Universidad de Osaka. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente antes de su operación. El método de cultivo siguió el protocolo escrito por Shepherd TG, et al. [20] Los subcultivos se obtuvieron por tratamiento con tripsina y se utilizaron para experimentos en pasajes 3 a 5.
Pacientes y microarrays de tejidos
ovárico carcinoma de muestras se recogieron de pacientes tratados en el hospital de la Universidad de Gifu (Gifu, Japón) entre 2006 y 2011 y se utilizaron para construir las diapositivas de microarrays de tejidos (TMA). En pocas palabras, las piezas resecadas fueron fijadas en formalina al 10% y regiones representativas fueron procesados para su inclusión en parafina. De las regiones correspondientes en bloques de parafina, núcleos de tejido (diámetro, 3 mm) fueron eliminadas mediante una aguja hueca, dispuestos en bloques de parafina (TMA) y en rodajas (4 m de espesor) sobre portaobjetos. aprobación de la Junta de Revisión Institucional se obtuvo del Instituto. núcleos de tejido satisfactorios finalmente se obtuvieron de 94 pacientes, y se recogieron los datos clínicos correspondientes.
La inmunohistoquímica
Los TMA diapositivas se deparaffinized en xileno y se deshidrataron con etanol al 100% antes de desenmascaramiento de antígenos se realizó por hirviendo las diapositivas de Target Retrieval Solution (pH 9,0) (Dako, Glostrup, Dinamarca). Después de ser colocado en 3% H
2O
2 y ser bloqueado con la solución (Dako) de bloqueo, que se incubaron con el anticuerpo de IL-6 y IL-6R primario a 1: 200 durante 18 horas a 4 ° C y con el anticuerpo CD68 primario a 1: 200 durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, se tiñeron utilizando el sistema Envision (Dako) y después se contratiñeron con hematoxilina de Mayer. Placentario complicado con corioamnionitis se utilizaron como control positivo. Los portaobjetos se examinaron intensamente por dos patólogos cualificados independientes (EM, YK) sin el conocimiento de los resultados clínicos y cada muestra se puntuó basándose en el porcentaje de células positivas (0, & lt; 25%; 1, ≥25%) y la intensidad de la tinción (0, ninguno; 1, débil; 2, fuerte). "Alto" expresión de IL-6 se definió si la puntuación composición de la densidad y la intensidad fue ≥1. "Bajo" expresión se definió si la puntuación composición de las puntuaciones de densidad e intensidad era 0. "Alto" expresión de IL-6R se definió si la puntuación composición de la densidad y la intensidad fue = 2. "Bajo" expresión se definió si la puntuación composición de las puntuaciones de densidad e intensidad era ≤1.
Tiempo real de transcripción inversa (RT)-PCR análisis
El ARN total se aisló con Trizol reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uno g de ARN total fue inverso-transcrito con ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Japón). Para el análisis de la expresión de ARNm cuantitativa, TaqMan RT-PCR se realizó en el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus ™ siguiendo las instrucciones del fabricante. Ensayos de expresión génica basada en la sonda TaqMan se utilizaron para la IL-6; Hs 00174131_m1 e IL-6R; Hs 01075667_m1 (Applied Biosystems). GAPDH se utilizó como control interno. los niveles relativos de la expresión génica ARNm se calcularon utilizando el 2
-.
ΔΔCT
método como se describe anteriormente [21]
RT-PCR análisis
cDNA fue sintetizado a partir 1 g de ARN usando un Ace qPCR RT Master Mix ReverTra (Toyobo, Osaka, Japón) con cebadores aleatorios. Para la expresión de IL-6R, los cebadores fueron diseñados para hibridar con la región de corte y empalme de IL-6R a fin de detectar no sólo una forma unida a la membrana (IL-6R), sino también una forma soluble (sIL-6R). Las secuencias de los cebadores y los productos de PCR esperados fueron los siguientes; sentido IL-6R, 5'-TCCACCCCCATGCAGGCACT-3 '(bases 1419 a 1438) y anti-sentido IL-6R; 5'-GTGCCACCCAGCCAGCTATC-3 '(bases 1840 a 1859), el tamaño; IL-6R, 441 pb, sIL-6R, 341 pb. β-actina de sentido: 5'-CGTGACATTAAGGAGCTGTG-3 ', β-actina-anti-sentido: 5'-GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTGA-3', el tamaño de 376 pb. Las secuencias de ADNc se remitieron al GenBank (no la adhesión. X12830 para IL-6R y sIL-6R y NM_001101 para β-actina). Las plantillas de cDNA se amplificó por PCR con Taq PCR master mix (Qiagen, Valencia, CA) que contiene 1 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, y 2,5 U Taq ADN polimerasa, y cada cebador específico a 0.2 M en las condiciones siguientes : 35 ciclos de 94 ° C para 45 años, 60 ° C durante 45 años y 72 ° C durante 60 s. Los productos se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 2% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio e iluminación ultravioleta.
Análisis Western Blot
Un total de 4 × 10
Se sembraron células en 5 6- así las placas y se lisaron con 1 x tampón de lisis celular (Cell Signaling). Los lisados (30 g) se separaron por 5 a 20% SDS-PAGE y se transfirió a membranas de difluoruro de polivinilideno, seguido de incubación con los anticuerpos primarios (p-STAT3, 1: 1000 en 5% de albúmina de suero bovino (BSA); STAT3, 1 : 1000 en BSA al 5%; p-ERK, 1: 2000 en 5% de BSA, ERK, 1: 2000 en 5% de BSA; ß-actina, 1: 10.000 en BSA al 5%) y luego con una correspondiente peroxidasa de rábano picante secundario conjugado IgG. Las proteínas se visualizaron con Western ECL Plus relámpago (PerkinElmer Life Science, Waltham, MA).
Ensayo de proliferación celular
células
SKOV3ip1 o RMG1 se sembraron en placas de 24 pocillos (1 x 10
4 células /pocillo) en 10% de FBS /DMEM durante 24 h y después se incubaron en 0,1% de BSA /DMEM en presencia o ausencia de IL-6 con o sin anticuerpo anti-IL-6R de 72 h. La proliferación celular se evaluó mediante un ensayo de MTS modificado usando una celda de Titer 96AQ kit (Promega, Madison, WI), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En experimentos de co-cultivo, filtros de policarbonato con poros de 1 mm (células no pueden pasar a través de los filtros) se colocaron en placas de 24 pocillos y se sembraron como un estimulante igual número de células primarias. La proliferación celular se expresa como la relación entre el número de células viables.
Matrigel ensayo de invasión
Brevemente, filtros de policarbonato con poros de 8 micras fueron recubiertas con 25 mg Matrigel (BD Biosciences). células SKOV3ip1 o RMG1 (1 x 10
5 células /pocillo) se sembraron en las cámaras superiores en 0,1% de BSA /DMEM y se incubaron en el mismo medio que contiene IL-6 como un quimioatrayente en la cámara inferior para 72 h.Thereafter , los filtros se fijaron y se tiñeron con una solución de hematoxilina de Carazzi. células no invasora se retiraron usando un hisopo de algodón, y las células invasoras en la parte inferior del filtro se contaron usando un microscopio invertido. Cinco campos microscópicos orbitales de cada filtro fueron escogidos al azar. En experimentos de co-cultivo, el mismo número de células primarias fueron sembradas en la cámara inferior como un quimioatrayente.
ligado a enzimas ensayo inmunoabsorbente (ELISA)
Para el ensayo cuantitativo de VEGF-A humano, células SKOV3ip1 (1 x 10
5 células) se cultivaron en medio libre de suero en presencia o ausencia de IL-6 por 72 h. El anticuerpo anti-IL-6R (10 g /ml) o una cantidad equivalente de IgG de control se aplicó al mismo tiempo. A partir de entonces, se recogieron los medios de cultivo condicionados y se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis. se utilizó VEGF-A kit Platinum ELISA Humano (eBiosecience, SanDiego, CA) para determinar la concentración de VEGF-A, de acuerdo con el protocolo del fabricante, con una sensibilidad de 7,9 pg /ml. Para el ensayo cuantitativo de IL-6 humano o humano sIL-6R, 1 x 10
5 de las células SKOV3ip1 y células primarias se cultivaron en medio libre de suero durante 72 h y se midió estas concentraciones en medio de cultivo utilizando IL-humana 6 ELISA Ready-SET-IR con una sensibilidad de 2 pg /ml o humano sIL-6R ELISA instantánea (eBioscience) con una sensibilidad de 10 pg /ml.
el aislamiento de células primarias de cáncer de ovario ascitis
las muestras de pacientes se obtuvieron con consentimiento informado por escrito de conformidad con el hospital de la Universidad de Osaka requisitos de los comités de ética y de la Declaración de Helsinki. La ascitis se recogieron asépticamente, y las células se aislaron por gradiente de densidad estándar de Ficoll-Paque (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia). Posteriormente, las células CD11b positivo (CD11b
+), así como células CD14 positivas (CD14
+) se purificaron por selección positiva utilizando células magnético activado tecnología de clasificación (MACS) (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Por último, CD11b
- células, CD11b
+ CD14
- y células CD11b
+ CD14 se recogieron las células
+. Las células fueron cultivadas en 20% de FBS RPMI 1640 y se utilizaron para experimentos en los pasajes de 2 a 3.
celular activada por fluorescencia (FACS) el análisis
Para la tinción de la superficie celular, suspensiones de una sola célula se incubaron con ficoeritrina (PE) conjugado con anticuerpo anti-CD11b monoclonal (ICRF44) (BD Biosciences), aloficocianina (APC) conjugada con anti-CD14 anticuerpo monoclonal (M5E2) (BD Biosciences), Alexa Fluor-488 conjugado anti-CD68 monoclonal anticuerpo (y1 /82A) (Miltenyi Biotec) y eFluor-450 anticuerpo conjugado anti-CD206 (19,2) (eBioscience, San Die ir, CA) durante 30 minutos a 4 ° C. Después del lavado, las células se resuspendieron en 500 l de 1% BSA /PBS. Las células teñidas se ejecutan en un flujo FACSCanto II citómetro (BD Biosciences). Los datos fueron analizados utilizando el programa de software FlowJo (TreeStar, Ashland, Oregón).
El análisis estadístico
Statcel versión 3 (OMS-Publishing Inc., Saitama, Japón) y JMP versión 10.0.2 (SAS Institute Japan Ltd., Tokyo, Japón) se utilizaron para los análisis estadísticos. Las diferencias se analizaron mediante la prueba de Mann-Whitney. Supervivencia de las estimaciones se calcularon utilizando el método de Kaplan-Meier, y se analizaron las comparaciones entre los grupos utilizando la prueba de log-rank. El análisis multivariante se realizó mediante un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a la de dos colas
P Hotel & lt; 0.05.
Resultados
alta expresión del receptor de IL-6 es un marcador pronóstico independiente de los pacientes con cáncer de ovario
Con el fin de evaluar el potencial terapéutico de IL-6R, establecimos TMA diapositivas de 94 pacientes con cáncer de ovario japonés. Las características de los pacientes se resumen en la Tabla 1. expresión de IL-6R se evaluó por inmunohistoquímica y cada muestra se puntuó basándose en el porcentaje de células positivas y la intensidad de la tinción. Típicamente, clara tinción membranosa se observó en los casos de expresión positiva de IL-6R (Fig. 1A). De 94 pacientes, 32 (34,0%) mostraron expresión "alta" IL-6R, incluyendo 14 de 34 serosa (41,1%), 3 de 16 mucinoso (18,8%), 1 de 11 endometrioide (9,1%), 10 de 20 clara celular (50,0%) y 4 de 13 otros (30,8%) carcinomas de ovario. En contraste, 62 (66,0%) casos expresaron "baja" o negativo expresión de IL-6R. Entre los pacientes con cáncer de ovario, los que tenían la expresión "alta" IL-6R mostraron significativamente peor SSA que los que tenían "baja" o negativo expresión de IL-6R (PFS, 23,8 frente a 32,3 meses,
P =
0,0029, Fig. 1B). De manera similar, IL-6 expresión se evaluó por inmunohistoquímica y se anotó cada muestra. La tinción citoplasmática se observó en los casos de positivo IL-6 expresión (Fig. 1C). De 94 pacientes, 39 (41,4%) mostraron expresión "alta" IL-6, incluyendo 13 de 34 serosa (38,2%), 8 de 16 mucinoso (50,0%), 5 de 11 endometrioide (45,5%), 11 de 20 clara celular (55,0%) y 2 de 13 otros (15,4%) carcinomas de ovario. En contraste, 55 (58,5%) casos expresaron "baja" o negativo expresión de IL-6. Aunque el valor pronóstico de la IL-6 fue examinado por el método y las comparaciones realizadas mediante la prueba de log-rank de Kaplan-Meier, IL-6 expresión no mostró correlaciones significativas con el pronóstico de los pacientes (fig. 1D). Para un análisis multivariante se realizó para seleccionar un modelo para la supervivencia con varios predictores. La edad, el estadio FIGO, el tipo histológico, el tumor residual en el momento de la cirugía, la IL-6 expresión "alta" y la expresión "alta" IL-6R se introdujeron en este modelo. El modelo final incluyó la expresión "alta" IL-6R, pero no de IL-6 expresión es un importante predictor independiente para la reducción de la SLP en los pacientes con cáncer de ovario (
P = 0,017
,
HR
; 2.388 ( 1,171-4,895), Tabla 2), junto con el estadio clínico y cirugías.
(A) tinción inmunohistoquímica de microarrays de tejidos con secciones de tejidos ováricos malignos. cuatro áreas representativas de los cánceres de ovario diferentes teñidas utilizando un anticuerpo IL-6R anti-humana y calificó como "Bajo" o "Alto". Placentario complicado con corioamnionitis se utilizaron como control positivo. Las flechas indican la tinción membranosa en trofoblastos. Un control negativo es suero no inmune. (B) la IL-6 expresión del receptor se correlaciona con mal pronóstico en pacientes con cáncer de ovario. Las curvas de Kaplan-Meier de supervivencia libre de progresión (
la izquierda) y la supervivencia global (
derecha) de los pacientes con cáncer de ovario tratados en el Hospital de la Universidad de Gifu (n = 94). (C) áreas representativas de los cuatro tipos de cáncer de ovario diferentes teñidas utilizando un anticuerpo de IL-6 antihumano y la calificaron como "Bajo" o "Alto". Placentario complicado con corioamnionitis se utilizaron como control positivo. Las flechas indican la tinción citoplasmática en las células mesenquimales vellosos. Un control negativo es suero no inmune. (D) IL-6 expresión no afectó el pronóstico en pacientes con cáncer de ovario. Las curvas de Kaplan-Meier de supervivencia libre de progresión (
la izquierda) y la supervivencia global (
derecha) de los pacientes. Aumento original, × 200. La barra de escala en cada panel representa el 50 micras.
receptor de IL-6, pero no de IL-6 es altamente expresado en líneas celulares de cáncer de ovario
Desde "alto "la expresión de IL-6R, pero no de IL-6 afectaron el pronóstico de los pacientes con cáncer de ovario, se cuantificó la expresión de IL-6 e IL-6R en líneas celulares de cáncer de ovario en tiempo real RT-PCR. El nivel de expresión de OSE células primarias se fijó como 1,0. Mientras que sólo dos de los siete líneas celulares (RMG-1 y OVISE) expresaron altos niveles de IL-6 en comparación con las células de OSE (Fig. 2A), seis (RMUG-S, RMG-1, OVISE, A2780, SKOV3ip1 y OVCAR-3 ) de siete líneas celulares mostraron notablemente alta expresión de IL-6R (11,0 a 270,1 veces) (Fig. 2B). Tendencias similares fueron confirmados por Western Blot (Fig. 2C). La forma unida a membrana de expresión IL6R se limita en gran medida a los hepatocitos, las células inmunes y algunas células tumorales. [6] Por lo tanto, se considera la isoforma soluble (sIL-6R) para jugar un papel importante en contextos inflamatorios por lo que permite una mayor respuesta a IL -6 en todos los tipos de células. Con el fin de determinar si las líneas celulares de cáncer de ovario predominantemente expresan el de longitud completa (IL-6R) o la isoforma diferencialmente empalmados que carece del dominio transmembrana (sIL-6R), hemos diseñado cebadores que las lesiones código de empalme y se realizó RT-PCR (Fig . 2D). En todas las líneas celulares excepto OSE, se encontró que tanto la IL-6R y sIL-6R se expresaron. La expresión de sIL-6R se confirmó mediante ELISA cuantitativo. Todas las líneas celulares de cáncer de ovario ensayados producen una cierta cantidad de sIL-6R (6,3 a 94,0 pg /10
5 células, Fig. 2E). Por lo tanto, el tratamiento con IL-6 (100 ng /ml) inducida por sí solo drásticamente la fosforilación de STAT3, una molécula aguas abajo clave en el /IL-6R vía de señalización de IL-6, así como la de ERK en las células SKOV3ip1 (Fig. 2F), y la adición exógena de sIL-6R no haya sido necesaria para estas fosforilaciones. El pretratamiento de anticuerpo anti-IL-6R inhibe las reacciones de una manera dependiente de la dosis, lo que indica que la IL-6R es altamente expresado en ciertos tipos de células de cáncer de ovario y que la señalización de IL-6 /IL-6R ejerce de una manera paracrina en estas células, a pesar de que las células no producen IL-6.
real-time RT-PCR de IL-6 (A) y IL-6R (B). El ARN total se recogió de siete líneas celulares de cáncer de ovario diferentes utilizando TRIzol y se sometió a tiempo real de RT-PCR. El 2
método -ΔΔCT se utilizó para calcular la abundancia relativa con respecto a la expresión de GAPDH. Se presentan veces las diferencias relativas con respecto a la superficie del epitelio ovárico primario (OSE). (C) Western Blot. Los lisados celulares de siete células de cáncer de ovario se resolvieron mediante SDS-PAGE y a inmunotransferencia con un anticuerpo contra IL-6 y IL-6R. ß-actina se utilizó como control de carga. (D) RT-PCR. Se recogió el ARN y se examinaron las expresiones de longitud completa de IL-6R (IL-6R) y la expresión soluble de IL-6R (sIL-6R) en líneas celulares de cáncer de ovario. Las condiciones de PCR fueron como se describe en Materiales y Métodos. (E) del ensayo de ELISA sIL-6R. Siete células de cáncer de ovario (1 x 10
5 cada uno) se sembraron en placas de 24 pocillos y se cultivaron con 1 ml de medio libre de suero durante 72 h. Se recogieron los medios condicionados y la concentración de humano sIL-6R se midió por ELISA. Los experimentos fueron repetidos tres veces. Dakota del Norte.; no detectado. (F) Western Blot. tratamiento exógena de IL-6 se activa IL-6 /IL-6R de señalización en líneas celulares de cáncer de ovario. células SKOV3ip1 fueron estimuladas con IL-6 (100 ng /ml) durante 30 minutos con o sin pretratamiento con anticuerpo ranti-IL-6R (1-100 mg /ml) de IgG no inmune como control. Se recogieron lisados celulares y la misma cantidad de lisados celulares (30 g) se resolvió por 10% SDS-PAGE y se inmunotransfirieron con STAT3 anti-fosforilados de anticuerpos (p-STAT3) y p44 anti-fosforilado /42 MAPK (p-ERK1 /2) anticuerpo. Las membranas fueron despojados y se rehibridaron con anticuerpos que detectan las formas totales de la proteína. Las transferencias son representativos de tres experimentos.
tratamiento exógena de IL-6 induce la proliferación, la invasión y la producción de VEGF de las células de cáncer de ovario
Desde la señalización de IL-6 /IL-6R es conocida para actuar en un número de maneras para aumentar la progresión del cáncer, se examinó si el tratamiento exógeno de IL-6 aumenta la proliferación, la invasión y la angiogénesis relacionada con VEGF en las células de cáncer de ovario. Para este propósito, las células SKOV3ip1 que no expresan niveles detectables de la proteína IL-6 y RMG-1 en las células que expresan un cierto nivel de se emplearon IL-6. Ambas líneas celulares tienen altos niveles de expresión de IL-6R como se confirma en la Fig. 2A. tratamiento exógena de IL-6 invasión de células fuertemente inducida de células de cáncer de ovario en una forma dependiente de la dosis (IL-6 100 ng /ml; SKOV3ip1, 4,27 ± 0,53 veces, RMG-1, 2,99 ± 0,46 veces), mientras que la inducción fue casi completamente inhibido por el tratamiento previo con anti-IL-6R de anticuerpos (Fig. 3A). La adición exógena de sIL-6R no promover aún más la invasión de células de cáncer de ovario inducidas por IL-6, lo que sugiere que la IL-6R (IL-6R y sIL-6R) producido a partir de las células de cáncer son suficientes para activar IL-6 /IL -6R de señalización. tratamiento exógena de IL-6 también mejora de forma significativa la proliferación tanto de células de cáncer de ovario en una forma dependiente de la dosis (IL-6 100 ng /ml; SKOV3ip1, 1,60 ± 0,29 veces, RMG-1, 1,64 ± 0,39 veces) y el tratamiento previo de la lucha contra anticuerpo -IL-6R casi abolió estas mejoras (Fig. 3B). A continuación, se analizó la producción de VEGF a partir de células SKOV3ip1. tratamiento exógena de IL-6 (100 ng /ml, 72 horas) estimuló significativamente la producción de VEGF de células de cáncer (de control; 239,4 ± 16,3 pg /1x 10
5 células, IL-6; 322,4 ± 11,8 pg /1x10
5 células) y el tratamiento previo de las células cancerosas con anticuerpo anti-IL-6R inhibió significativamente la producción de VEGF (Fig. 3C). En conjunto, no se requiere un tratamiento exógeno con IL-6 inducida por la proliferación, invasión y VEGF producción de células de cáncer de ovario, a pesar de que no expresan IL-6, y co-tratamiento con IL-6R soluble. Estos datos sugirieron que, en ciertos tipos de células de cáncer de ovario, la señalización de IL-6 /IL-6R puede aumentar la progresión del cáncer de una manera paracrina.
(A) un ensayo de invasión de Matrigel se realizó utilizando un sistema de cámara de Boyden modificada . 1 x 10
5 de SKOV3ip1 (
la izquierda) o UDA-S (
derecha) las células se colocaron en la cámara superior en un medio libre de suero y se dejó invadir durante 72 h . Diversas concentraciones de IL-6 (1 a 100 ng /ml) o 60 ng /ml de sIL-6R se aplicaron en la cámara inferior como un quimioatrayente. 10 mg /ml de anticuerpo anti-IL-6R o IgG no inmune fue co-tratado. Las células no invasoras se eliminaron utilizando un hisopo de algodón, y se enumeraron las células invasoras en la parte inferior del filtro. se muestran los números relativos de células invasoras con respecto al control (sin tratamiento con IL-6). (B)
in vitro
ensayo de proliferación celular En. 1 x 10
4 células de SKOV3ip1 (
la izquierda) o RMG1 (
derecha) las células se sembraron en placas de 24 pocillos en un 10% de FBS /DMEM durante 24 horas y después se incubaron en medio libre de suero en presencia o ausencia de diversas concentraciones de IL-6 (1 a 100 ng /ml) con o sin anticuerpo anti-IL-6R o IgG no inmune como control para 72 h. La proliferación celular se evaluó mediante un ensayo de MTS modificado. La proliferación celular se expresa como la relación entre el número de células viables. (C) ELISA ensayo de VEGF-A. 1 x 10
5 células SKOV3ip1 se sembraron en placas de 6 pocillos y se cultivaron con 2 ml de medio libre de suero en presencia o ausencia de 100 ng /ml de IL-6 por 72 h. El anticuerpo anti-IL-6R o IgG control fue co-tratada. Se recogieron los medios condicionados y la concentración de VEGF-A humano se midió por ELISA. Los experimentos se repitieron tres veces y los valores son medias ± SD de triplicados. n.s .; insignificante, *; P & lt; 0,05, **; P & lt; 0.01.
CD11b
+ CD14
+ células mejoradas invasión y proliferación de células de cáncer de ovario a través de IL-6
de producción
Desde la señalización de IL-6 /IL-6R P & lt; P & lt;