Extracto
Antecedentes
Fomitopsis pinicola (Sw ex Fr.. m) Karst gratis (FPK), que pertenece a la clase de hongos Basidiomycota es uno de los hongos médicos más populares en china. Se ha utilizado para muchas enfermedades: cáncer, enfermedades del corazón, diabetes y así sucesivamente. Sin embargo, pocos estudios sobre el efecto de inhibición de la migración y pro-apoptótica de extracto de cloroformo FPK (FPKc) ha sido reportado y el posible mecanismo implicado no ha sido iluminada.
Metodología /Principales conclusiones
Química análisis se realizó por HPLC que mostró ergosterol (ES) concentración fue de 105 g /mg. ensayo de MTT reveló que FPKc podría inhibir selectivamente la SW-480 células viabilidad con el IC
50 de 190,28 g /ml. La cicatrización de heridas y el ensayo transwell indicaron que FPKc podría inhibir la migración de células SW-480, obviamente, FPKc también podría disminuido dramáticamente las metaloproteinasas de matriz, 2-9 (MMP-2 y MMP-9) de expresión. Anexina V-FITC /PI tinción, Hoechst 33342 tinción y análisis de la fragmentación del ADN nuclear reveló que FPKc y ES podrían inducir a las células SW-480 apoptosis. El proceso de apoptosis estrechamente implicado en la acumulación de ROS y el agotamiento de GSH, la activación de la caspasa 3, poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) degradación. FPKc también podría hasta de regular la expresión de p53 y por lo tanto dar lugar a detención en la fase G1. Cuando las células SW-480 fueron pretratados con N-acetilcisteína (NAC), la generación de ROS, la viabilidad celular y la relación de apoptosis fueron disminuido parcialmente, lo que indica que las ROS fue vertical en el proceso pro-apoptosis inducida por FPKc. Además, en todo el proceso, ES que se ha encontrado previamente en FPKc tuvo el efecto similar a FPKc. Por lo tanto podemos concluir que ES, como uno de los componentes más altos abundantes en FPKc, también podría ser uno de los componentes activos.
Conclusión /Importancia
FPKc podría inhibir la migración de SW-480 células, inducir SW-480 células de detención en la fase G1 y causar efecto la apoptosis mediada por ROS. Y ES podría ser uno de los componentes eficaces en todo el proceso
Visto:. Wang Y, X Cheng, Wang P, L Wang, Fan J, Wang X, et al. (2014) La investigación de Inhibición de Migración y efectos apoptóticos de
Fomitopsis pinicola
Cloroformo Extracto de cáncer colorrectal humano SW-480 células. PLoS ONE 9 (7): e101303. doi: 10.1371 /journal.pone.0101303
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 19 de diciembre de 2013; Aceptado: June 3, 2014; Publicado: 3 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es un tumor con ligereza aumentando en todo el mundo cada año. Cada año, casi la mitad de los pacientes diagnosticados estaría muerto de la enfermedad [1]. CRC es considerada como la tercera tumor maligno más común y la tercera causa de muerte por cáncer en los EE.UU. [2]. Aunque la incidencia de CRC es mucho menor en comparación con Asia que en los EE.UU., se ha aumentando rápidamente en China [3]. Mientras que el tratamiento tradicional para el CDN incluyendo cirugía, radioterapia, quimioterapia y las opciones actuales han estado fuera de la eficiencia y tienen muchos efectos secundarios [4]. Todos estos problemas destacan la importancia de encontrar un nuevo agente para el CDN. A medida que la medicina tradicional china ha sido cada vez más popular, ha sido considerada como potencial agente terapéutico debido a su alta eficiencia y seguridad [4].
Fomitopsis pinicola (Sw. Ex Fr.) Karst
(FPK), que pertenece a la clase de hongos Basidiomycota es una de las maderas enraizamiento hongos más común y ampliamente distribuida en muchos países del mundo, como Japón, Corea, china y Suecia [5]. FPK se ha utilizado tradicionalmente como fuente de alimentos saludables para la regulación del crecimiento de las plantas y la diabetes en Japón [6], [7]. FPK como un producto natural no tóxico ha sido cada vez más atractivo para los estudiosos, y se ha informado de sus extractos que tienen efectos anti-inflamatorios, anti-microbianas, anti-hongos y contra el cáncer efecto [8], [9], [10]. Para el efecto anticancerígeno de FPK, la investigación se centró principalmente en su acetato de etilo y los extractos de etanol. Por ejemplo, Ren G demostrado tanto de éter y acetato de etilo extractos de gasolina de FPK tienen la citotoxicidad frente a algunas líneas de células tumorales tales como Hela y SMMC-7721 [11]. Hung-Tsung Wu de Taiwán ha demostrado F. pinicola extracto de etanol tiene efecto contra el cáncer en las células S180 in vitro e in vivo. También demuestra que podría desencadenar Homo sapiens hepatoma (HepG2), cáncer de pulmón (A549), cáncer colorrectal (HCT-116) y cáncer de mama células (MDA-MB-231) la apoptosis [12]. Y para FPK extracto de cloroformo (FPKc), sólo hay un informe para demostrar su efecto anti-hongos [10]. Para nuestro mejor conocimiento, poca información sobre el efecto anticancerígeno de FPKc ha sido publicada. Por lo tanto, el primer objetivo de nuestro estudio fue evaluar si FPKc puede ejercer su efecto anticancerígeno en nuestro sistema experimental, a continuación se centran principalmente en la investigación de los efectos de inhibición de la migración y pro-apoptosis de FPKc y el potencial de los mecanismos implicados.
además, el análisis químico de FPK extractos, que principalmente apuntan los extractos de n-hexano y metanol de FPK contiene algunos triterpenoides como ergosterol, derivados de ergosterol, triterpenos lanostano y así sucesivamente [13], [14]. Aunque nunca se ha estudiado el análisis químico sobre FPKc. Debido ergosterol (ES, Figura 1) se ha reportado que distribuir ampliamente en muchos tipos de hongos y mostrar algún efecto contra el cáncer [15], [16]. Por lo tanto el otro objetivo de este estudio fue explorar los componentes químicos de FPKc e investigar si ES funcionaba cuando FPKc llevó a cabo su efecto contra el cáncer.
Métodos y materiales
Recogida y preparación de cloroformo extraer
no se necesitaron permisos específicos para la ubicación en la que se recogió FPK y este estudio no implicaba peligro o protegidas especies.
el fresco FPK se recogió en julio de 2011 de Pingheliang, el sur de las Montañas Qinling, provincia de Shaanxi, china (latitud, 33 ° 27'N; longitud, 108 ° 30 'E, la altitud, 2305 m). Se fue autenticado por el profesor Xiao Yaping y depositado en el Ministerio de Educación, clave Laboratorio de Recursos de Plantas Medicinales (MPR) y natural de Química Farmacéutica de la Universidad Normal de Shaanxi, Xi'an, Shaanxi, República Popular de China.
La se obtuvo el extracto de etanol de FPK a través del método de extracción por ultrasonidos y después se concentró con un evaporador rotatorio (RE-2000 a; Belong, Shanghai, china). En tercer lugar, se secó con un secador por congelación (ALPHA1-2, CHRIST, Alemania) y finalmente se liofilizó. A continuación, el extracto de etanol se fraccionó por cloroformo (CHCl
3). La fracción de cloroformo se homogeneizó en 70% de etanol y el sobrenadante se filtró utilizando 0,22 filtros mm.
HPLC análisis
Se evaluó la determinación de FPKc y ES a través de la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) método analítico. El sistema LC constaba de Shimadzu LC-20AT (Shimadzu Corp., Kyoto, Japón) con una bomba cuaternaria, un compartimento de la columna termostato y software solución Shimadzu LC. La separación de fitoquímicos se logró en una columna Cuña-pack VP-ODS C18 (Shimadzu, 1.504,6 mm; tamaño de partícula 5 mm). La fase móvil consistía en acetonitrilo y agua. Un programa de elución en gradiente se utilizó como 10 a 100% de acetonitrilo (v /v) a 0-80 min, 100% -85% en 80 a 90 min, manteniendo 85% a 90 hasta 100 min. La temperatura de la columna se mantuvo constantemente a 40 ° C, y el caudal de la fase móvil fue de 0,8 ml /min. La longitud de onda de detección era 254 nm y se inyectaron 20 l de muestras. Re-equilibrio duración fue de 15 minutos entre las corridas individuales.
Las curvas de calibración estándar
ES fue traído en Sima, Tianjin, China. La pureza se demuestra que es mayor que 98%. Las curvas de calibración se construyeron con diluciones de 2.000, 1.000, 500, 250, 125 mg /ml en metanol. Un volumen de 20 l se inyectaron por triplicado y curvas de calibración se basaron en las superficies medias de pico de cada cromatograma. Las curvas de calibración mostraron un R
2 de 0.993 para ES.
Cultivo de células
El SW-480, SW-620, células Caco-2 y células HEK-293 se adquirieron en el banco de células de la Academia de Ciencias de china, Shanghai, china. El SW-480, SW-620 Caco-2 y células HEK-293 líneas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640, L-15 y medio DMEM, respectivamente. Todos ellos se cultivaron con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina-estreptomicina (/ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina 100 U) y 1% de glutamina en 100 cm
2 frascos de cultivo de tejido bajo un humidificado 5% de CO
2 atmósfera de aire y 95% a 37 ° C.
la viabilidad celular
Para evaluar el efecto de FPKc en SW-480, SW-620 y Caco-2 células viabilidad, las células se sembraron en placas de 96 pocillos (5 x 10
4, 1 × 10
5 y 1 × 10
5). Varias concentraciones de FPKc fueron utilizados en SW-480 (120, 160, 200, 240 mg /ml, 70% de etanol fue utilizado como el disolvente de control) y SW-620 (40, 80, 120, 160, 200, 240 mg /ml) y Caco-2 (40, 80, 120, 160, 200, las células 240, 280 g /ml). Diferentes dosis de ES (0, 12, 24 mg /ml; 100% de etanol) se añadieron a las células SW-480. Después de eso se incubaron todas las células durante 48 y 72 h, respectivamente. De riñón embrionario humano
293
(HEK-293) se utilizaron las células como las células normales por el contrario para evaluar la actividad citotóxica contra el cáncer de FPKc. La viabilidad de las cuatro líneas celulares se determinó usando el ensayo de MTT [17]. La absorbancia a 570 nm se registró usando un lector de microplacas (Bio-Tek ELx800, EE.UU.). La viabilidad celular de FPKc y ES trata a continuación las muestras se obtuvo por comparación con el control. (Toda la concentración mencionada en este artículo se hace referencia al peso en seco).
motilidad celular
motilidad celular se evaluó por la herida cero y transwell ensayo. Para el ensayo cero herida: las células SW-480 se sembraron en placas de 24 pocillos durante 24 h, luego las células en pocillos individuales fueron heridos por el rascado con una punta de pipeta y las células se incubaron con la concentración indicada de FPKc y ES para 12 y 24 h. Las células se fotografiaron bajo microscopía de contraste de fase (× 200 aumentos).
Para el ensayo transwell, 5 × 10
5 células se sembraron en la cámara superior con medio libre de suero que contiene 0,3% de BSA y medio que contiene 10% de suero se añadió a la cámara inferior de la cámara de Corning (filtro de policarbonato con inserciones de tamaño de poro de 8 mm, Corning Pharmingen, San Diego, CA). Después de la incubación durante 36 h, las células se trasladaron a la parte inferior de la membrana se detectaron limpiando la parte superior con un hisopo de algodón y tinción de las células superficie inferior con solución 0,1% de cristal violeta. Células se ha movido a la parte inferior de la membrana se observaron por microscopio, y el violeta cristal adherido en las células superficie inferior se disolvieron en ácido acético 33%, la relación de OD de la solución se midió a 570 nm mediante un lector de microplacas.
inmunofluorescencia
Después de FPKc de incubación de 24 h, las células fueron dispuestas como folowing: fija con 4% de paraformaldehído, se permeabilizaron con 0,1% Triton X-100 y se bloquearon con 5% de albúmina de suero bovino (BSA), entre cada paso las células se lavaron por PBS por tres veces. Después se bloquearon las células, se incubaron con anti-MMP-9 y -MMP-2 anticuerpos (adquirido de Santa Cruz) durante la noche y teñidas con el anticuerpo secundario correspondiente realizado por inmunoglobulina FITC (Zhong Shan puente Golden Biotecnología Co., Pekín, China ) a 37 ° C en la oscuridad durante 1 h, y después las células se obtuvieron imágenes con microscopio de fluorescencia (Nikon e 600).
Hoechst 33342 tinción
Hoechst 33342 tinción se realizó para detectar alteraciones de la morfología de los núcleos de las células SW-480 después del tratamiento FPKc y ES. Las células tratadas se tiñeron por 10 M Hoechst 33342 durante 15 min a 37 ° C, a continuación, las células teñidas se lavaron tres veces con PBS y se observaron utilizando un microscopio de fluorescencia con filtros de excitación estándar (Nikon, Japón). longitud de onda de excitación era de 346 nm y longitud de onda de emisión fue de 460 nm
La citometría de flujo análisis de la fragmentación del ADN
El método para analizar la fragmentación del ADN era el flujo de la detección de fluorocytometric hipodiploidía ADN después de la adición de yoduro de propidio (PI.; Sigma, St. Louis, EE.UU.) a las células que mueren y permeabilización de ellos por congelación-descongelación [18]. Para investigar el efecto de FPKc y ES en el daño del ADN de SW-480 y las células HEK-293, se realizó la fragmentación del ADN por oligonucleosomal fluorocytometry flujo. Las células en placas de 24 pocillos se trataron con varias concentraciones de FPKc y ES durante 12 h, respectivamente. Las células fueron teñidas con 5 mg /ml PI y se analizaron para el contenido de ADN por citometría de flujo.
ciclo celular análisis
SW-480 se sembraron en placas de 24 pocillos, y después se trató con FPKc y ES (0, 240, y 24 mg /ml) durante 24 h. Entonces se recogieron las células y eliminarse como pasos siguientes: se lavaron dos veces con PBS frío que contiene 1% de BSA (Sigma, St. Louis, EE.UU.), se fijaron con etanol al 70% enfriado con hielo a -20 ° C durante la noche, después se lavaron dos veces con PBS frío , se incubaron con 100 mg /ml de RNasa a (Sigma, St. Louis, EE.UU.) durante 30 min a 37 ° C, después de que se tiñeron con 50 mg /ml PI durante 30 min en la oscuridad y finalmente se analizaron por citometría de flujo (Millipore, EE.UU.).
Anexina V-FITC /PI tinción experimento
la fosfatidilserina sirve como un marcador sensible de las células sometidas a la apoptosis cuando se exterioriza a la cara externa [19]. Por lo tanto la proporción de células apoptóticas se midió con un kit de detección de apoptosis V-FITC Anexina (Invitrogen, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. Brevemente, SW-480, SW-620 y las células HEK-293 fueron tratados con varias concentraciones de FPKc y ES durante 24 horas a 37 ° C, a continuación, se recogieron las células tratadas y re-suspenden en 200 l de tampón de unión. Después de la adición de 2 l de Anexina V-FITC y PI 2 l en la suspensión de células, las muestras se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. El índice de apoptosis se determinó inmediatamente por citometría de flujo.
Detección de la generación intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS)
Algunos hongos comestibles, tales como Pleurotus abalonus, podría provocar la apoptosis mediada por ROS [20] . En este estudio también se midieron los cambios de nivel de ROS celular a través de la conversión oxidativa de la sonda fluorescente sensible 2 ', 7'-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA) en Fluorescente 2', 7'-diclorofluoresceína (DCF). DCFH-DA se difunde fácilmente a través de la membrana celular y es enzimáticamente hidrolizado por esterasas intracelulares para formar DCFH no fluorescente, que luego se oxida rápidamente para formar altamente fluorescente DCF en presencia de ROS, y la intensidad de fluorescencia es proporcional a la producción de ROS. células SW-480 y HEK-293 en placas de 24 pocillos se trataron con la concentración mencionada de FPKc y ES para 3 y 6 h (HEK-293 células sólo para 6 h). Las células se recogieron y se lavaron dos veces con PBS, se resuspendieron en 500 l de 10 mM DCFH-DA (adquirido de Molecular Probes Inc., Invitrogen, CA, EE.UU.) y se incubaron a 37 ° C durante 30 min en la oscuridad. Las muestras se detectaron entonces inmediatamente por citometría de flujo. Los histogramas se analizaron utilizando FCS expreso V3.
determinación de glutatión
células SW-480 se incubaron en placas de 24 pocillos, y después se trataron con FPKc y ES durante 3 horas y 5 horas. Después de eso, se recogieron las células tratadas y se lavaron dos veces con PBS. Las concentraciones de glutatión total se llevaron a cabo por el glutatión Kit (Nanjing Instituto Jiancheng bioingeniería, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Por fin, se midieron las muestras a 405 nm con lector de microplacas (Bio-Tek ELX 800, EE.UU.).
tinción Western Blot
SDS-PAGE y la inmunotransferencia se realizaron de acuerdo con procedimientos estándar. En resumen, después se trató con FPKc (240 g /ml) y ES (24 mg /ml) durante 0 h, 12 h, 24 h y 48 h, las células se lisaron mediante tampón RIPA en hielo. Las muestras de proteína se separaron en un gel de poliacrilamida SDS 10%, y luego el gel se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Millipore, MA, EE.UU.) y se transfirieron con anticuerpos primarios (caspasa-3, escindido con RARP, Bcl-2, P53 se compraron de Señalización celular Tecnología, EE.UU.) durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos primarios unidos se entonces etiquetados con IRDye 680 conjugado IgG (Li-cor, Biosciences) a temperatura ambiente durante 1 h. Y la fluorescencia infrarroja se detectó con el sistema de imágenes de infrarrojos Odyssey (Li-Cor Bioscience, Lincoln, NE).
El análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron por triplicado, y los datos se expresaron como medios ± SD. Los valores de CI50 se calcularon por análisis de regresión. Los datos fueron sometidos a un análisis de la prueba de rangos múltiples de Duncan (SPSS, versión 18.0). Una diferencia significativa fue juzgado de existir a un nivel de p **. & Lt; 0,01
Resultados
HPLC
El ensayo de HPLC ha sido visitada identificar ES y los componentes químicos de FPKc. Los datos se muestran en la Figura 2, en las mismas condiciones experimentales, estándar ES mostró su tiempo de retención en 83,8 min (Figura 2B); FPKc muestra seis picos principales y se incluye un pico con el mismo tiempo de retención de ES, lo que implica ES podría ser uno de los principales componentes de FPKc (Figura 2A); Desde el área de los picos, que reveló ES clasificado como el segundo en FPKc; A partir de la determinación cuantitativa de la ES en FPKc con HPLC, se especuló ES poseía 105 g /mg (alrededor de 10% en el FPKc total).
FPKc y estándar ES se identificaron mediante HPLC-PDA a 254 nm como se describe en la sección experimental.
los efectos citotóxicos de FPKc y ES
Figura 3A-C demostró la citotoxicidad de FPKc en SW-480, SW-620 y células Caco-2, respectivamente, que estaba en una dosis-y tiempo- manera dependiente. Cuando las células SW-480 fueron tratados con 120 y 240 g /ml FPKc durante 48 h, la pérdida de la viabilidad celular fue 34,99 ± 1,08% y 65,20 ± 2,34%, el IC
50 valor se calculó como 190,28 g /ml; Para las células SW-620, la viabilidad celular se redujo a 74,61 ± 0,99% y 29,52 ± 1,28% cuando la concentración fue de 80 y 160 g /ml, respectivamente, la IC
50 valor se calculó como 143,26 g /ml. Caco-2 realiza menos sensibles que las líneas celulares anteriores 2. Después de 72 h de incubación con FPKc, Caco-2 comenzado a realizar la pérdida de la viabilidad, la viabilidad celular fue 71,65 ± 0,003% con 200 mg /ml FPKc, y cuando la dosis se incrementó a 280 g /ml de la viabilidad de las células disminuyó a 47,16 ± 0,011% y el IC
50 era 371,5 g /ml.
SW-480, SW-620, Caco-2 y células HEK-293 células viabilidad después FPKc (A, B, C, D) y ES (E) de tratamiento se midió por el ensayo MTT. Cada valor se expresó como media ± S. D. de al menos tres determinaciones independientes. Utilizó un modelo lineal se utilizó para las comparaciones de grupo de múltiples medios seguido por la prueba t de Dunnett. * P & lt; 0,05 y ** P & lt; 0,01 frente al control. (barras de error = S. D., n = 3).
Figura 3D mostraron la actividad citotóxica de ES, y dañan las células fue 34,52 ± 0,58% cuando la dosis ES fue de 24 mg /ml después de 48 h de incubación. En comparación, en las mismas condiciones experimentales, 240 mg /ml FPKc causada 65,20 ± 2,34% de pérdida de viabilidad de las células, lo que sugiere algunos otros componentes citotóxicos existentes en FPKc.
Para comparación, la Figura 3E refleja la citotoxicidad de FPKc en humanos de riñón embrionario normal 293 (HEK-293), se observó un daño celular relativamente más débil en las células HEK-293 en comparación con las células SW-480 en virtud de la misma dosis de FPKc, lo que sugiere FPKc tiene algún efecto matando selectiva de células tumorales.
inhibición de la migración de FPKc y ES en células SW-480 in vitro
Para determinar si FPKc afectó a la capacidad de migración de las células SW-480, cicatrización de heridas y se llevaron a cabo transwell ensayo (Figura 4A). La herida capacidad de las células de curación refleja su movimiento y la migración en la superficie sobre la que se anclan a para el crecimiento. En las células SW-480, en comparación con 0 h después de la herida, después de 12 h de incubación, cada células densas en el control crecieron gradualmente al espacio intermedio de la herida; Las células en el grupo tratado /ml FPKc 120 mg mostraron una ligera diferencia con el control; mientras que las células en 240 mg /ml FPKc y 24 g /ml ES tratados grupos rara vez crecieron al espacio intermedio de la herida. Cuando el tiempo de incubación se incrementó a 24 h, la capacidad de migración de las células se redujo con cada dosis de FPKc. Y el número de células con /ml FPKc y 24 mg /ml ES 120 mg no cambió mucho en comparación con el control, mientras que el grupo de 240 mg /ml tratados disminuyó visiblemente.
SW-480 células en 24 así placas fueron heridos por el rascado con una punta de pipeta y las células se incubaron con FPKc y ES de 12, 24 horas. Las células se fotografiaron bajo microscopía de contraste de fase (x 200 aumentos). Figura 4B, Análisis del cambio en la migración de células SW-480 por transwell ensayo. Las células en cada grupo de movimiento a la superficie inferior del filtro se tiñeron con violeta cristal y se fotografiaron con un microscopio de luz a 200 ×. b) Se midió la relación de OD de cristal violeta. Las barras de error representan SD de los medios de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 y ** p & lt;. 0.01 versus control sin tratar
se empleó ensayo
Transwell para confirmar aún más inhibición de la migración inducida por FPKc sobre células SW-480. Y la figura 4B indica que después de 24 h de incubación con FPKc, la capacidad de migración de células se redujo a 28,28 ± 0,07% en comparación con el control; y para el grupo ES, la migración fue 51,92 ± 0,85%, lo que confirmó el ensayo de curación de la herida. Los resultados indicaron ambos FPKc y ES podrían inhibir la migración celular, obviamente.
inmunofluorescencia
Las MMP son verticales en la migración celular y el movimiento. MMP-2 y MMP-9 se detectaron por inmunofluorescencia experimento en este estudio. Figura 5 reveló MMP-2 y MMP-9 se expresaron alta con fluorescencia verde brillante en el grupo control. Y para los grupos ES y FPKc, ambas enzimas se redujo drásticamente en comparación con el control.
células SW-480 se fijaron y procesaron para inmunofluorescencia, MMP-9 y MMP-2 se visualizaron utilizando FITC-label segundo anticuerpo ( verde). Barras de escala, 100 m.
Los cambios morfológicos inducidos por FPKc y ES en células SW-480
El examen morfológico fue realizado por Hoechst 33342. Como se muestra en la Figura 6, los núcleos de las células de control se tiñeron uniformemente, y la fase de contraste indican la morfología normal de las células SW-480 con pequeñas islas de células epiteliales. Sin embargo las células después del tratamiento FPKc y ES durante 48 h mostraron cambios morfológicos significativos: la cromatina condensada y fragmentada punctuate fluorescencia nuclear azul se observaron en una forma dependiente de la dosis. Cuando la dosis fue de 240 FPKc g /ml, la tinción nuclear fue obviamente y las imágenes de fase reveló que las células transformadas en tipo redondo anormal, y el número de células se redujo claramente.
SW-480 células tratadas durante 48 h se tiñeron con Hoechst 33342. No se observaron cambios morfológicos bajo el microscopio fluorescente.
se utilizó la fragmentación del ADN inducida por FPKc y ES
PI tinción por citometría de flujo para evaluar el daño en el ADN causada por FPKc y ES. Como se muestra en la Figura 7A, FPKc a 120 mg /ml provocaron un aumento de 1,8 veces en el daño del ADN en las células SW-480, y 240 mg /ml de FPKc condujeron a un aumento dependiente de la concentración de la fragmentación del ADN por 7,2 veces, en comparación las células no tratadas (p & lt; 0,01). Un incremento similar de 4,2 veces en la intensidad de la fluorescencia roja de las células SW-480 también se obtuvo a través de la incubación con ES (24 mg /ml). La figura 7B mostró 240 mg /ml FPKc inducida 18,26 ± 0,28% de daño de ADN en células HEK-293 (alrededor de 1,6 veces de control) que indicó HEK-293 realiza mucho menos daño en el DNA (p & gt; 0,01) que el de las células SW-480 (p & lt ; & lt;.. 0,01) a la misma dosis de tratamiento FPKc
Tanto las células se trataron con FPKc y ES para 12 (PI) y se analizaron por citometría de flujo
detención del ciclo celular inducida por FPKc y ES
Para el tratamiento del cáncer, la detención del ciclo celular ha sido considerado como uno de los objetivos más importantes. Como todos sabemos, las células cancerosas siempre mantienen la proliferación celular incontrolada debido a que su mutación gen que controla la división celular [21]. Para evaluar el efecto del tratamiento FPKc sobre la distribución de células en el ciclo celular, se realizó el análisis del ciclo celular de ADN por citometría de flujo. La Figura 8 muestra los efectos de FPKc y ES en la fase del ciclo celular (G1, S, y G2 /M) de distribución de las células SW-480. Después de FPKc tratamiento de 24 h, la acumulación de células SW-480 en el G1 aumentó de 39,27 ± 0,56% a 56,77 ± 0,5%; mientras que el tratamiento con EE, la acumulación fue hasta 65,22 ± 0,54%. Los resultados mostraron que FPKc y ES podrían inducir la detención del ciclo celular SW-480 células en la fase G1.
SW-480 se recogieron las células y se fijaron en alcohol 70% y teñidas con PI. Finalmente se analizaron las células teñidas utilizando un citómetro de flujo.
efecto de la apoptosis inducida por FPKc y ES
detención del ciclo celular está estrechamente relacionado con la apoptosis, y la interrupción de la progresión del ciclo celular y finalmente se pueden llevar a la muerte necrótica /apoptosis [22]. A fin de evaluar el índice de apoptosis que FPKc y ES podrían provocar, se utilizó el doble tinción con anexina V-FITC /PI. De la Figura 9A, estaba claro para ver FPKc podría desencadenar SW-480 células apoptosis de una manera dependiente de la dosis después de la incubación durante 24 h. La relación de la apoptosis tardía (superior derecha) aumentó de 15,40 ± 0,53% a 31,82 ± 0,93% acompañado por el aumento de la concentración FPKc de 120 a 240 g /ml, mientras que el control fue sólo 6,42 ± 0,5%. Curiosamente, ES (24 mg /ml) también podría inducir la externalización de fosfatidilserina, la proporción de finales y principios de la apoptosis fago fue 28,90 ± 0,63% (superior e inferior derecha).
Las células se tiñeron con doble Anexina V FITC y PI, y después se analizaron por citometría de flujo. Todos los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado por cada punto experimental, y se muestran los resultados representativos. Los resultados representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. * P & lt; 0,05 y ** p & lt; 0,01 indican diferencias estadísticamente significativas en comparación con el grupo control
Figura 9B muestran la apoptosis dirigida por FPKc en células HEK-293.. Después de la incubación con 240 mg /ml FPKc durante 24 h, la tasa de apoptosis de las células tratadas fue 11,83 ± 3,2% y el grupo control fue de 9,63 ± 3,7%, lo que reveló que no había mucha diferencia en los dos grupos.
Las células en este documento SW-620 también se ensayaron mediante ensayo /PI AnnexinV, y la figura 9C revelaron que FPKc podría inducir SW-620 apoptosis de las células de la apoptosis especialmente al principio. Después de 24 h de incubación con FPKc, la proporción de células apoptosis temprana eran de 3,13 ± 0,40% a 12,23 ± 0,51% y 15,20 ± 0,40% como el FPKc aumento de la dosis de 0 a 80 y 160 mg /ml.
la acumulación de ROS inducida por FPKc y ES en las células SW480
La producción intracelular de ROS se analizó mediante citometría de flujo con tinción DCF. Los datos mostrados en la Figura 10A sugieren los niveles de ROS intracelulares se aumentaron después del tratamiento FPKc y ES. A las 3 h, alrededor del 34,33 ± 0,45%, 82,77 ± 1,05% y 50,33 ± 0,53% de las células en 120 y 240 mg /ml FPKc y 24 mg /ml ES grupos tratados mostraron una brillante fluorescencia DCF, mientras que sólo el 5,40 ± 0,45% de las células en el grupo control mostró brillante fluorescencia DCF. Cuando el tiempo de incubación se incrementó a 6 h, el porcentaje de células con fluorescencia brillante DCF no cambió mucho en FPKc células tratadas, las células tratadas ES aumentó a 71,10 ± 1,7%. Y la Figura 10B después del tratamiento mostró FPKc, HEK-293 mostró poca acumulación de ROS en comparación con el control.
SW-480 (A) y células HEK-293 (B) las células se trataron con FPKc y ES y el ROS niveles se midieron por citometría de flujo después de teñir con DCFH-DA. células SW-480 fueron pretratados con NAC (5 mM) durante 1 h, a continuación intracelular de ROS generación (C), daño en el DNA (D), la viabilidad celular (E) y la apoptosis (F) fueron detectados.
a fin de validar que las ROS participó en FPKc apoptosis efecto inducido de las células SW-480, carroñeros ROS-NAC se trató previamente con células SW-480. Como se esperaba, en presencia de 5 mM antioxidante NAC, la acumulación de ROS disminuyó a 4,26 veces más que el control, mientras que el grupo FPKc fue 10,15 veces sobre el control (Figura 10C).
Se ha informado de que el exceso de cantidades de ROS pueden causar daño oxidativo a lípidos, proteínas y ADN, que conduce a la tumorigénesis o la muerte celular [23]. En este estudio, se midió el daño del ADN después de co-tratamiento con NAC. Y los resultados mostraron que el daño del ADN podría obviamente revertido por NAC: índice de daño en el ADN fue 38,85 ± 2,7% cuando las células se trataron con 240 mg /ml FPKc durante 24 h, el grupo de co-tratamiento con NAC sólo era 8,20 ± 0,71%, mientras el control fue sólo 6,50 ± 0,5% (Figura 10D). Los resultados revelaron que el daño del ADN inducido por FPKc podría estar asociado con la acumulación de ROS
El efecto de citotoxicidad de FPKc en células SW-480 se invirtió en gran medida por NAC (p & lt; 0,01, Figura 10E).. Las células viables fue de aproximadamente 85,73 ± 0,14% y 69,62 ± 0,21% por el pretratamiento con NAC, en comparación con alrededor de 55,42 ± 2,00% y 39,44 ± 0,64% en el tratamiento con 120 y 240 mg /ml FPKc, respectivamente.
Anexina V-FITC /PI ensayo de doble tinción también reveló que el pretratamiento con NAC podría proteger parcialmente células SW-480 de la apoptosis inducida FPKc (Figura 10F). Estos resultados indican que la acumulación de ROS intracelulares participó en la apoptosis inducida por las células SW480 de FPKc.
Las alteraciones de la concentración de glutatión intracelular causados por FPKc
A medida que el agotamiento de GSH ha sido considerado como uno de los importantes se evaluó factor que causa la acumulación de especies reactivas del oxígeno (ROS) [24], la concentración de GSH en las células SW-480 después de FPKc y tratamiento ES (Figura 11). Cuando las células fueron tratadas durante 3 h, la concentración de GSH intracelular disminuyó a 70,38 ± 1,50%, 29,23 ± 1,00% y 50,14 ± 1,70% de control con 120, 240 mg /ml FPKc y 24 g /ml ES, respectivamente. Y cuando el tiempo de incubación se incrementó a 5 h, el contenido de GSH en las células SW-480 no cambió mucho después del tratamiento FPKc; mientras que para las muestras tratadas ES, GSH celular se redujo a 42,18 ± 1,00%, lo que estaba de acuerdo con la generación de ROS.
La concentración intracelular de GSH de las células SW-480 después de los tratamientos FPKc y ES se midió a 405 nm con una microplaca lector.
el examen de los niveles de proteínas asociadas con el ciclo celular y la apoptosis
el mecanismo subyacente de la alteración inducida por FPKc de la expresión de la proteína involucrada en el ciclo celular y la apoptosis en el células SW-480 fue dilucidado aún más mediante ensayo de transferencia Western (Figura 12). Los niveles de actina sirvió como un control interno. Se encontró que la expresión de la proteína anti-apoptótica de Bcl-2 se redujo cuando las células fueron tratadas con 240 mg /ml FPKc durante 48 h; y para los ES (24 g /ml) tratamiento de las células, el nivel de Bcl-2 se redujo cuando se incubaron durante 24 y 48 h. En este estudio, la caspasa-3 escinde y se evaluaron PARP escindida, y los resultados mostraron ambos estaban regulados por incremento después se incubaron con FPKc y ES durante 24 hy 48 h.