Extracto
cáncer de ovario
epitelial es una de las neoplasias de incidentes cada vez más que es notoria por su actitud evasiva para el diagnóstico precoz y las altas tasas de mortalidad. cánceres de ovario epiteliales son dependientes de la vasculatura patológica altamente y Vascular factor de crecimiento endotelial es conocido por ser uno de los factores angiogénicos más eficientes. Los polimorfismos del gen de VEGF, en este estudio, se evaluaron para la asociación con la malignidad y otros factores clínico-patológicas. 300 muestras de casos y 320 controles emparejados por edad y estado mensus fueron inculcados en el estudio. rs699947, rs833061, rs1570360, rs2010963, rs1413711 y rs3025039 eran las seis polimorfismos de nucleótido único que se examinaron. La genotipificación se llevó a cabo por reacción en cadena de la polimerasa y de longitud de fragmentos de restricción polimórficos. rs 3025039 mostraron grandes promesas como marcador de agresividad de la enfermedad y la recurrencia y un factor de mal pronóstico. rs699947 mostró menos asociación con la enfermedad y los factores clínico-patológicos estudiados. rs833061, rs 1570360 mostraron asociación significativa con algunos factores clínico-patológicas tales como la aflicción bilateral de los ovarios y los niveles post operatorio CA-125. rs2010963 asocia con la presencia de ascitis en volúmenes más altos. Los SNPs en estudio no mostraron ninguna vinculación formidable en nuestro estudio las muestras. Un análisis de haplotipos (excluyendo rs699947 y rs1413711) reveló que está presente en & gt 5 principales candidatos, el 85% de la población con TGGC y CGCC asocia significativamente a medida que los factores protectores y de riesgo, respectivamente. Estos haplotipos mostraron una dependiente de la dosis efecto aditivo de su funcionalidad aparente. Este estudio es único y el primero de este tipo realizado en la población indígena del Sureste de Asia
Visto:. Janardhan B, Vaderhobli S, R Bhagat, Chennagiri Srinivasamurthy P, Venketeshiah Reddihalli P, R Gawari, et al. (2015) La investigación de impacto del factor de crecimiento endotelial vascular Polimorfismos en los cánceres epiteliales de ovario: Un estudio en la población india. PLoS ONE 10 (7): e0131190. doi: 10.1371 /journal.pone.0131190
Editor: Chih-Hsin Tang, de la Universidad Médica de China, Taiwán
Recibido: 27 Febrero, 2015; Aceptado: 30-may de 2015; Publicado: 9 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Janardhan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo indio de Investigación médica, Ref No: 5/13/28/2010-NCD-III. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario, la principal causa de muerte por tumores malignos ginecológicos es la quinta causa más común de mortalidad en las mujeres de la raza caucásica. La supervivencia está directamente relacionada con el estadio con una supervivencia a los 5 años en el 93% de las personas diagnosticadas con enfermedad localizada, pero sólo el 31% para aquellos con la enfermedad a distancia. Lamentablemente, dos tercios de los pacientes presentan metástasis a distancia en el momento del diagnóstico. En la India, se ha producido una baja incidencia, pero un aumento constante de la tasa de prevalencia estandarizada por edad de cáncer de ovario en un 3% por año en los diferentes registros estatales durante un período de tiempo [1].
La mayoría de ovario cánceres (80-90%) son los tumores de ovario epiteliales (COE). El origen y la patogénesis de la EOC de gallingly siguen siendo difícil de alcanzar, en parte debido a que es raro encontrar lesiones precursoras bien definidos, y en parte porque los EOC tienden a tener una histología compleja y heterogénea que desafía una explicación biológica sencilla. A falta de métodos de cribado funcional y la ausencia de síntomas claros en las primeras etapas de la progresión tumoral han hecho EOC difícil de tratar con éxito. Paclitaxel (Taxol) y la quimioterapia basada en platino (cisplatino o carboplatino) representan la terapia estándar después de la citorreducción quirúrgica. Desafortunadamente, incluso con la quimioterapia moderna, la mayoría de los pacientes con recaída de la enfermedad avanzada y mueren de la enfermedad.
Una condición inevitable que se desarrolla en microambientes tumorales es la hipoxia. Este es un factor estimulante importante para la angiogénesis, que es un factor de propulsión de las neoplasias malignas agresivas. Hay varios factores angiogénicos y, sin embargo vascular factor de crecimiento endotelial (VEGF-A) ha sido promocionado como la molécula más robusta única en el proceso de la angiogénesis. VEGF-A es secretada por muchas células tumorales in vitro y es altamente upregulated en la mayoría de los cánceres humanos. La expresión de VEGF-A se correlaciona con la densidad de los vasos intratumoral y de mal pronóstico en pacientes con cáncer y la inhibición se conoce para disminuir la densidad de los vasos del tumor y el crecimiento de tumores [2, 3].
El VEGF-A gen se localiza en el cromosoma 6p12 e incluye una región de codificación de 14 kb, se compone de ocho exones y exhibe splicing alternativo para formar una familia de proteínas. El gen VEGF-A contiene elementos de respuesta a la hipoxia (HRE) en sus 5`and 3`UTRs. VEGF-A es upregulated bajo condiciones de hipoxia por la unión de HIF-1 (factor inducible de hipoxia -1) a la HRE [4]. La hipoxia también media la estabilización de VEGF-A mRNA por la unión de factores no identificados en su 3`UTR. VEGF-A también es modulada por una variedad de factores de crecimiento y citoquinas. Así, el gen está sujeta a modulación multinivel de expresión en condiciones de hipoxia [5]. El gen es altamente polimórficos y un buen número de estudios han mostrado algunos de los SNPs para modular la expresión génica e inducir niveles de VEGF-A en plasma más altas.
Muchos estudios han investigado el papel de los polimorfismos VEGF-A como un determinante genético para la susceptibilidad y el resultado de mama, de próstata, de células no pequeñas de pulmón Carcinoma (NSCLC) y cáncer colorrectal. A nivel mundial, se realizaron varios estudios sobre la asociación de estos polimorfismos con resultado del riesgo y el tratamiento, pero los resultados obtenidos entre diferentes razas y tipos de cáncer fueron muy variables. Por ejemplo, el alelo rs3025039 'T' imparte protección contra el cáncer de mama, pero por el contrario, el aumento de riesgo de cáncer colorrectal. Asimismo, el rs2010963 alelo 'C' predijo mayor riesgo de NSCLC y el cáncer de próstata, pero predijo riesgo reducido de cáncer de colon, [6]. La falta de consenso acerca del papel de estos SNP podría ser debido a su vinculación con otros factores oscuros o porque dichos SNPs modulan la expresión del gen como un todo, que tiene varias isoformas que incluyen ambas isoformas pro y anti-angiogénicos que hacen un 2 modulación -way factible por estos SNPs. Tal vez, la asociación con haplotipos será más predictiva que los SNPs. Una mayor comprensión de la funcionalidad de estos polimorfismos y su papel en la biología del tumor es esencial para discernir las razones de las inconsistencias en la literatura, que también pueden ayudar en el diseño de los estudios de asociación en el futuro
.
Los polimorfismos incluidos en este estudio se rs699947, rs1570360, rs833061, rs2010963, rs1413711 y rs3025039 y se conocen comúnmente como VEGFA-2578 A /C, 1154G /A, -460 C /T, 405 G /C, 674 C /T y 936 C /T, respectivamente. VEGFA-2578 A /C es el nombre de su posición con respecto al sitio de inicio de la traducción (-1540 pb en relación al sitio de inicio de transcripción), y está situado en la región promotora. Asimismo 405 G /C también se conoce como -634 G /C. Los nombres de otros polimorfismos se basan en las posiciones relativas a la iniciación de la transcripción (-460, 405) o al final (936) del sitio, y por lo tanto estos SNP se encuentran en el promotor, 5 'no traducida (UTR) y 3' regiones-UTR, respectivamente. 674 C /T está presente en la región del intrón 1 del gen. Los SNPs en este documento se denominan con sus respectivos números de identificación dbSNP. Estos SNPs están en estrecha proximidad a la región HRE y la secuencia de señalización del péptido en el gen. Esto los pone en el candelero para las posibilidades de modulación de la expresión génica en función del alelo presente.
Las 6 polimorfismos del gen VEGF-A se han incluido en nuestro estudio de casos y controles de cáncer de ovario epitelial con el objetivo de investigar el papel de las variantes genéticas como herramientas de diagnóstico o pronóstico y su correlación con el estado de la enfermedad y los factores clínico-patológicos. Presentamos una primera investigación de este tipo de población que emplea desde el subcontinente indio del sudeste asiático.
Resultados
Asociación de polimorfismos con enfermedad
Los seis polimorfismos genotipo en 300 casos y 320 controles fueron encontrados para estar en equilibrio de Hardy-Wienberg. La distribución alélica y de asociación se muestra en las figuras 1 y 2, en términos de O y el intervalo de confianza del 95%. rs 1570360, RS 833061, rs rs 2010963 y 3025039 mostraron asociación muy fuerte (valor de p & lt; 0,001) con el estado de la enfermedad. rs 1413711 mostraron asociación significativa con la enfermedad, así (valor de p 0,01). RS 699947 mostraron ninguna asociación con la condición de enfermedad en el estudio de cohortes. La distribución genotípica de los SNPs se muestra en la figura 3 y se calcula una evaluación con arreglo tanto los modelos dominantes y recesivos de asociación. Entre los modelos probados, el modelo dominante mostró una mayor importancia de la asociación con la enfermedad (los datos se muestra en la Tabla S1).
Asociación de polimorfismos con malignidad y otros factores clínico-patológicas
Un total de once factores clínico-patológicos se incluyeron en el estudio como la edad al momento del diagnóstico, el estado menstrual, estadio FIGO, el grado, la histopatología, la aflicción bilateral de los ovarios, antes de la operación de plasma niveles de CA-125, tipo de tumor , presencia o ausencia de la ascitis, la presencia o ausencia de enfermedad residual y la recurrencia en un plazo de cirugía post-operatorio de un año. (S2 tabla enlista los factores clínico-patológicos incluidos en el estudio). niveles de CA125 después de la operación también se evaluó la asociación con los polimorfismos que se correlacionan con el pronóstico junto a la recurrencia, aunque no se han podido recuperar los datos de todas las muestras. Sin embargo, se llevó a cabo una prueba de asociación de subconjunto de datos disponibles. En un análisis de asociación para toda la cohorte caso entre los polimorfismos y los factores clínico-patológicos, rs rs SNPs 699947 y 1413711 mostraron ninguna asociación con enfermedades malignas o de estado. Todos los otros SNPs mostraron asociación significativa con la malignidad con un valor de p & lt; 0,001. La Tabla 1 resume los resultados obtenidos para la asociación del polimorfismo con cada uno de los factores clínico-patológicos.
vinculación de datos y asociaciones de haplotipos
No pudimos observar ninguna vinculación significativa entre cualquiera de los polimorfismos (figura 4). Aunque rs1413711 y rs3025039 exhibición en un grado razonable de vinculación con una D 'valor de 0,605, sin embargo, es muy por detrás de la norma de corte asumido en D' de 0,8 o más allá. La evaluación de los haplotipos que incluyen todos los SNPs no dió ningún precursor claro también. Cuando se llevó a cabo un análisis de haplotipos excluyendo rs699947 y rs1413711, un conjunto de 5 haplotipos de 16 generada por la fase tenía una frecuencia de & gt; 5%. Los haplotipos bajo escrutinio incluyeron la rs833061 SNPs, rs1570360, rs2010963 y rs3025039. TGGC (37%), CGGC (19%), CGCC (9%), TGCC (12%) y TAGC (8%) representaron el 85% de la población estudiada. Tabla 2 conjetura estos haplotipos, su frecuencia en las cohortes de casos y controles y la asociación p-valor probado de estos haplotipos con la enfermedad. De estos TGGC se observó en el 50% de la población total en los controles, pero sólo 24% en los casos y significativamente asociado como factor de protección. CGCC se observó que en el 11% de los casos, pero sólo en el 6% en los controles y significativamente asociado con el estado de la enfermedad.
Impacto de haplotipos en la agresión de la enfermedad y los tumores malignos
los haplotipos mencionados fueron analizadas por cualquier asociación con la agresividad de la enfermedad y los tumores malignos. Haplotipo TGGC asocia de forma muy significativa como factor de protección (valor de p & lt; 0,001) en su estado homocigoto. La condición heterocigótica TGGC no mostró ningún impacto o asociación. CGCC significativamente asociada con la malignidad (valor p 0,0198). También se observó que la alta potencialidad maligna fue observado en los portadores de haplotipos CGCC en su estado homocigoto pero heterocigosidad no tuvo un impacto significativo. Esto da lugar a la idea de que los haplotipos TGGC y CGCC pueden tener un número de copias o la dosis efecto dependiente. Hemos observado que la acogida a los pacientes a CGCC mostró una mayor incidencia de la presencia de & gt; 500 ml ascitis (significación estadística no se alcanza) y de plasma CA-125 mayores niveles preoperatorios (valor de p 0,017). Los anfitriones de haplotipos CGCC y CGGC también mostraron una mayor propensión a la enfermedad agresiva y los tumores malignos. La Tabla 3 da una visión general de las frecuencias de haplotipos en su homocigotos y heterocigotos condiciones y su asociación con la aparición de la enfermedad se matriculó con corrección de Yates aplicado. No hubo asociación observada entre cualquiera de los haplotipos con la recurrencia de la enfermedad dentro de un período de un año ni se asocia con el estado de la enfermedad residual en el estudio actual.
Discusión
La la necesidad de un sistema de apoyo vascular es esencial para el crecimiento, ya sea células tumorales o células normales. angiogénesis del tumor es un evento principal que satisface esta necesidad, sin que las células tumorales no pueden crecer más allá de 2 mm y permanecer en estado latente [7]. Un intrincado equilibrio entre los factores angiogénicos pro y anti-angiogénesis es necesaria para la salud. EOC, siendo dependiente de la angiogénesis, requiere un cambio angiogénico que se inclina la balanza a favor de la angiogénesis [8]. En el cáncer de ovario avanzado, el VEGF-A angiogénesis patológica inducida conduce a la producción de ascitis maligna y progresión de la enfermedad y el eventual fracaso del tratamiento. Una plétora de SNPs en el gen de VEGF-A se han descubierto que se han asociado con la modulación de los niveles de VEGF A-expresión de la proteína y la susceptibilidad a diversos carcinomas [9-13]. Estudios interrogar el efecto de los polimorfismos y pruebas de su validez como marcadores de pronóstico o factores de riesgo son muy pocos y la mayoría de ellos en las carreras de raza blanca. Los estudios que emplean el subconjunto de Asia son escasos.
Entre los pocos estudios en los cánceres de ovario, se observó rs3025039 estar asociado como factor de riesgo en un estudio [14] y se asoció con un mejor pronóstico en otro estudio [15] . Nuestro estudio implicó el SNP con mal pronóstico y los factores de riesgo como en el estudio anterior. rs2010963 asocia fuertemente con mejor pronóstico pero débil asociación en caso de rs803361 [16]. El estudio también mostró que la cigocidad tenido un significado pronóstico independiente. Un estudio que incluyó rs2010963, rs1570360 y rs699947 indica ninguna asociación significativa de los polimorfismos con los parámetros clínico-patológicas, pero asociada con una alteración significativa de VEGF-A expresión, pero ninguna asociación con la supervivencia o el pronóstico libre de progresión y sugirió desequilibrio de ligamiento significativo entre estos polimorfismos [17 ]. El análisis de haplotipos en el estudio no mostró una asociación significativa con los parámetros clínico-patológicas, aunque uno de sus haplotipos AGCGC (rs699947, rs1570360, rs833061, rs2010963 y rs3025039) mostró una asociación significativa con la supervivencia libre de progresión.
El SNPs en nuestra estudio, aunque exhibió una fuerte asociación con el estado de la enfermedad, no mostró ninguna vinculación significativa entre sí como se informó en otros estudios [18-22]. Varios de los SNPs incluidos mostraron asociación significativa con ciertos parámetros clínico-patológicas. rs3025039 mostró una asociación significativa con la potencialidad maligna, estadio de FIGO, aflicción bilateral, los niveles plasmáticos CA125 después de la operación, la ascitis y la recurrencia indicando que sea prometedor marcador de mal pronóstico. rs1413711 y rs2010963 asociado significativamente con la presencia de ascitis, pero no tuvo significación estadística con un aumento de los niveles de ascitis. rs833061 asociada con aflicción bilateral de los ovarios e incluso con más fuerza dentro del subconjunto de muestras de casos malignos. rs699947 no mostró asociación con el estado de la enfermedad o de otros parámetros clínico-patológicas
.
La ambigüedad en el polimorfismo de datos a través de poblaciones en parte, podrían ser explicados en términos de las posiciones de estos polimorfismos bien comunicados y de las isoformas del VEGF-A que se sabe que son anti-angiogénica. Por mucho que se produce un cambio angiogénico en favor de la angiogénesis en el caso de la tumorigénesis, también hay un mecanismo de autorregulación con respecto al VEGF-A gen que mantiene un buen equilibrio entre la pro- y anti-angiogénicos de isoformas del VEGF -A gen.
el exón 8 del gen VEGF-a tiene una capacidad única de producir ambas isoformas angiogénicos favor y en contra de VEGF-a. Mientras 8a exón confiere pro-angiogenecity, el exón 8b confiere anti-angiogenecity. splicing alternativo que produce ARNm con 8b codones producen todo un conjunto de isoformas del VEGF-A, que se contradicen por completo los efectos del ARNm de subconjuntos 8a. Perrin et al han informado de que la expresión de VEGF-A
XXXB isoformas contribuir a la inhibición competitiva mediante la unión a los receptores pero no la estimulación de la fosforilación de tirosina esencial para la actividad angiogénica de aguas abajo como es causada por VEGF-A
xxxA isoformas. El VEGF-A
XXXB isoformas son por lo tanto agentes anti-angiogénicos endógenos formadas por corte y empalme alternativo y se dice que ser influenciado por otras condiciones de factor de crecimiento y la disponibilidad de factores de empalme. El VEGF-A
se han reportado 165b isoformas que las reguladas en varios tipos de cáncer, como el carcinoma de células renales, de próstata y carcinoma de colon [23-25].
Este aspecto particular de VEGF-A empalme y la producción isoforma alternativa es definitivamente vale la pena un estudio detallado ya que los estudios exploratorios sobre SNPs en todo el mundo no ha dado como resultado un consenso de que los datos es implicativo. Parte razón para esto es la condición que varían en-vivo en pacientes con cáncer. EOC son aún más complicado ya que un informe reciente mostró que eran de origen más mixtos en lugar de sólo el epitelio [26] la superficie. Este mileu in vivo heterogéneo hace que la modulación de la expresión de VEGF-A gen altamente compleja.
Los SNP rs rs 699947, 833061 y rs 1550360 en la región del promotor son comunes tanto para el VEGF-A
xxxA y VEGF -A
isoformas XXXB y, por tanto, una asociación de estos SNPs con la enfermedad podría significar que existen maneras. Uno, que podría coincidir en que las isoformas pro-angiogénicos se expresan cada vez o también podría significar que las isoformas anti-angiogénicos están siendo suprimidas. SNP rs 2010963 está dentro de la región 5 'UTR. El VEGF-A gen es singular en el hecho de que tiene una región 5'UTR 1038bp que tiene 2 IRES (sitios interno de entrada ribosomal (IRES) Elementos-A y IRES-B) que se pone en uso diferencialmente dependiendo de las condiciones intracelulares de normoxia e hipoxia [27]. Por lo tanto el efecto de rs 2010963 podía convertir indistinta teniendo en cuenta el hecho de que la novela una forma larga de ARNm de VEGF-A (con una secuencia de 180 aminoácidos en el original) es producida que modula la expresión adicional de ARNm de VEGF-A. rs 1413711 es decir, incluidos en este estudio, no está bien estudiados como los otros polimorfismos, pero es todavía vale la pena ver, estar en la región del intrón 1. En nuestro estudio, no se ejerce ninguna asociación significativa con los factores clínico-patológicos, pero se asociaba con una considerable significación (p = 0,01) con el estado de la enfermedad. rs 3025039 SNP está bien documentada, siendo en la región 3 'UTR del gen VEGF-A. Se sabe que influyen en los niveles secretados de proteína VEGF-A y se ha demostrado que tienen una asociación significativa en la mayoría de los estudios de casos y de cohorte. Este SNP, en nuestro estudio también mostró muy fuerte asociación con el estado de la enfermedad y el pronóstico más pobre.
Este estudio de investigación es un primer en su intento en esta población y en resumen muestra rs3025039 que se asocia como un marcador muy prometedor para pronóstico, mientras que otros polimorfismos en el estudio se asociaron con unos parámetros clínico-patológica y no fueron concluyentes acerca de sus capacidades de pronóstico. Los polimorfismos mostraron una fuerte asociación con la malignidad y, por tanto, pueden estar implicados como factores de riesgo. Este sumario es el único periódico que aborda el efecto de los polimorfismos VEGF-A en el cáncer epitelial de ovario en la población del sudeste asiático, específicamente pan-india.
Materiales y Métodos
Recogida de muestras
Un total de 300 pacientes diagnosticados con tumores epiteliales de ovario primarios en el Instituto Memorial Kidwai de Oncología, Bangalore, India, fueron incluidos en el estudio
.
el diagnóstico institucional inicial de cáncer de ovario epitelial fue confirmada por revisión de diapositivas patológicas por los patólogos de alto nivel. De los 300 casos, 202 (67,3%) fueron casos malignos, 31 (10,3%) eran tumores borderline o de bajo potencial maligno (LMP) y 67 (22,4%) eran tumores benignos. De éstos, el número de muestras pre-mensus se situó en 88 (29,3%) y post-mensus muestras a 212 (70,7%). 320 sujetos de control sanos, emparejados por edad y estado menopáusico, fueron reclutados para el estudio. La edad promedio de los casos cohorte fue de 51 ± 12 años y 48 ± 17 años para los controles. 30,9% (99/320) de los controles eran pre-menopáusicas y el 69,1% (221/320) fueron post-menopáusica. 65,8% de los casos eran de la etapa alta y alto grado, y el 63,8% de los casos eran serosos cáncer ovárico epitelial. 64,9% de los casos tenían afección bilateral y 86,6% de los casos mostraron niveles altos de CA125. La ascitis se observó en el 80% de los casos. Tabla S2 en el da una visión en detalle de la demografía de los casos que se tienen en el estudio. 5 ml de sangre fue recolectada de todos los temas, antes del tratamiento, en tubos al vacío con heparina y se procesa inmediatamente después de allí. El sedimento celular se almacena en -20 ° C para el aislamiento de ADN y genotipado
.
Todos los tumores fueron clasificados de acuerdo a criterios de la OMS y por etapas de acuerdo con la Federación de Ginecología y Obstetricia de clasificación (FIGO). La información sobre el diagnóstico de cáncer, estadio de la enfermedad (FIGO), el grado histológico y el subtipo, pre operatorios niveles de CA-125, la enfermedad residual y la recurrencia fueron extraídos de los registros médicos.
Estudio aprobación fue dada por la Junta de Revisión Institucional y el Comité de Ética médica y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los participantes.
aislamiento del ADN
ADN genómico fue extraído de muestras de sangre periférica usando kits de extracción de ADN QIAamp® (Qiagen) según el protocolo del fabricante. La concentración de ADN se midió por nanogota de Thermo Scientific.
El genotipado se utilizó
Reacción en Cadena de la Polimerasa-Fragmentos de Restricción de longitud polimórfica (RFLP-PCR) para determinar los polimorfismos 6 VEGF-A, utilizando protocolos previamente publicados con modificaciones menores.
La PCR se llevó a cabo en una mezcla de reacción de 30μl con ADN molde 50-100ng, 1U de Taq polimerasa enzima (Bangalore Genei) y tampón 1X proporciona junto con la enzima. 0.3μM de respectivos cebadores (Sigma), 0,5 mM dNTP mix y de 1,5 a 2 mM de MgCl
2 constituyó la mezcla de PCR. La PCR se realizó en un termociclador Eppendorf PCR con una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 5 minutos, seguido de 35-40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 40 segundos, hibridación durante 40 segundos, extensión a 72 ° C durante 20 -40 segundos y una extensión final durante cinco minutos a 72 ° C. Los cebadores de PCR y temperaturas de recocido respectivos utilizados para cada SNP en una lista en la Tabla 4.
Los amplicones de ADN obtenidos se digirieron durante la noche con la enzima de restricción. Las enzimas de restricción se adquirieron de New England Biolabs y condiciones de temperatura de restricción seguido el protocolo del fabricante. Las enzimas utilizadas fueron BglII (rs699947), BstUI (rs833061), MnlI (rs1570360), BsmFI (rs 2010963), BaeGI (rs 1413711) y NlaIII (rs3025039). BstUI se utilizó a una concentración de 2U mientras que el resto de las enzimas se usaron a una concentración de 1 U en un volumen de mezcla de reacción de 25 l. Los amplicones digeridos se separaron en un gel de bromuro de etidio que van desde 1,5 a 3% de agarosa en función del tamaño de amplificación. Los tamaños de las bandas se determinaron con el uso de una escalera de 50 pb y 100 pb.
Vinculación, haplotipos y análisis estadístico
El análisis de ligamiento y haplotipo se realizó utilizando la versión 4.2 y Haploview fase 2.1.1. Se aplicó la χ
2 prueba para determinar si las distribuciones de genotipo estaban dentro del equilibrio de Hardy-Wienberg. Chi cuadrado y análisis de regresión logística se aplicaron para examinar la asociación entre el carro de los marcadores y el estado de la enfermedad y otros factores clínico-patológicos. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS versión 21.
Apoyo a la Información
S1 tabla. Un análisis de los polimorfismos en virtud de los modelos dominantes y recesivos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0131190.s001 gratis (DOC) sobre Table S2. Demografía y aspectos clínico-patológicas de los casos (en total 300)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0131190.s002 gratis (DOC)
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos a los pacientes con cuya colaboración este estudio fue posible. Se agradece al Dr. V. Shanmugam, Lakshmi Subramaniam y la Sra Anisha Raju por sus entradas y asistencia en el análisis de datos valiosos.