Extracto
La capacidad del tumor-homing de los monocitos los convierte en un sistema de liberación celular potencial de las terapias alternativas contra el cáncer, aunque su capacidad migratoria puede ser deteriorado después de la captación de reactivo. Los enfoques que mejoren la localización tumoral monocitos y promueven su migración mejorarán el valor clínico de estas células como compañías de telefonía celular. Estudios anteriores han demostrado que la irradiación (IR) puede promover la agregación de macrófagos en las regiones hipóxicas. Para investigar si la IR aumenta la infiltración de monocitos derivados de médula ósea (BMDMs) en tumores, la infiltración de BMDMs de ratones GFP-transgénico en un adenocarcinoma de próstata modelo TRAMP-C1 murino se examinó por microscopía de fluorescencia. IR no aumentó el número de BMDMs que se infiltraron en un principio, pero aumentó la retención de monocitos dentro de los tumores tratados con IR para un máximo de 2 semanas. También demostramos que BMDMs puede tomar hasta varias imágenes y agentes terapéuticos, aunque la movilidad de BMDMs disminuyó con el aumento de la carga. Cuando BMDMs se diferenciaron en tratados con IR-medio condicionado tumoral (IR-CM)
in vitro
, se atenúa la inhibición mediada por la carga de nanopartículas de la migración. Estos BMDMs diferenciados-IR-CM entregados vesículas polímero de encapsulación de doxorrubicina a la radioterapia (RT) inducida por regiones tumorales hipóxicas, y mejorar la eficacia de la RT. La retención prolongada de los monocitos dentro de los tejidos tumorales irradiadas y la capacidad de IR-CM para aumentar la capacidad migratoria de BMDMs de carga cargado sugieren que los monocitos pre-acondicionado por IR-CM potencialmente pueden actuar como portadores celulares para terapia dirigida siguiente RT convencional.
Visto: Jiang PS, Yu CF, Yen CY, Woo CW, Lo SH, Huang YK, et al. (2015) La irradiación aumenta la capacidad de los monocitos como portador de nanopartículas para la terapia del cáncer. PLoS ONE 10 (9): e0139043. doi: 10.1371 /journal.pone.0139043
Editor: Gabriele Multhoff, Universidad Técnica de Munich, Alemania |
Recibido: June 9, 2015; Aceptado: 7 Septiembre 2015; Publicado: 29 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Jiang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo es apoyado por NSC 101-2627-N-007-001, INDH-EX100-9827BI, y 102N2767E1 del Consejo Nacional de Ciencia, Salud Nacional Instituto de Investigación y Universidad Nacional Tsing Hua, respectivamente, Taiwán, Chi-Shiun Chiang, y CIRPG3D0141 y CMRPG3E1301 del hospital Chang Gung Memorial-a-Ji Hong Kong. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La tendencia de la sangre monocitos /macrófagos para infiltrarse en los tumores y de acumularse en regiones hipóxicas [1, 2] ha hecho que estas células un vehículo celular potencial para dirigir los agentes terapéuticos a sitios de tumor [3, 4] y por lo tanto impulsó investigación sobre el uso de los monocitos o macrófagos como vehículos de administración de antivirales [5] o la terapia contra el cáncer [3, 4, 6, 7]. El concepto de la transferencia adoptiva
ex vivo
-generated macrófagos en los pacientes con cáncer se propuso hace ya mucho tiempo. Este tipo de transferencia adoptiva se realizó por primera vez en el modelo de melanoma B16, donde la infusión de
ex vivo
activados por los macrófagos suprime la metástasis pulmonar [8]. Muthana
et al
. [4] ha demostrado recientemente una aplicación clínica prometedora para los macrófagos derivados de monocitos de sangre humana, que eran capaces de entregar virus oncolítico a las zonas hipóxicas de los tumores de próstata humanos después de la terapia en un modelo de xenoinjerto ortotópico. Esto indica que los monocitos se pueden utilizar como portadores celulares para el tratamiento de tumores hipóxicos. Aunque los informes han demostrado que los macrófagos asociados a tumores (TAM) se localizan preferentemente en las regiones hipóxicas [2], hemos demostrado que la asociación de TAM con hipoxia depende del tipo de señales microambientales locales [9, 10] tumor y. Enfoques que pueden mejorar el tráfico y el tejido retención de monocitos dentro de las regiones hipóxicas aumentarán el valor clínico de la utilización de los monocitos como compañías de telefonía celular en la terapia del cáncer.
La contratación de diversas células de la médula ósea procedentes de transmisión sanguínea (BMDCs) en los tejidos tumorales se ha informado en numerosos modelos de cáncer como una respuesta a las señales inflamatorias generados por los tejidos tumorales. Tras infiltrarse en los tumores, los monocitos /macrófagos luego migran a lo largo de gradientes quimiotácticos definidos [11], tales como gradientes de HIF-1 [2, 12], el VEGF [13], o SDF-1 [14], para apuntar a áreas. Los tratamientos que pueden provocar reacciones inflamatorias, así como señales de hipoxia se pueden utilizar para mejorar la eficacia de los monocitos como vehículos celulares. La terapia de radiación (RT) es un protocolo común en la terapia del cáncer y puede generar respuestas inflamatorias [15]. De hecho, ya hemos demostrado que las tratadas con agente de tumores, tratados con radiación, pero no anti-angiogénesis [10] o los tejidos [16] promover la acumulación de CD68
+ TAM en regiones hipóxicas avasculares [9]. Esto indica que los tumores o tejidos tratados con radiación producen factores específicos que atraen y retienen los macrófagos en avascular, los sitios tumorales hipóxicas.
La capacidad para fagocitar partículas de varios renders macrófagos superiores como portadores en comparación con otros tipos de células [17-20 ]; Por lo tanto, el uso de los macrófagos como vehículos celulares para nanopartículas terapéuticos o de formación de imágenes ha sido examinado en varios modelos [5, 6, 21-24]. Además del hecho de que son buenos portadores, la movilidad de las células siguientes pre-carga con reactivos es otro factor que determina su utilidad en la clínica; por ejemplo, la movilidad de los macrófagos alveolares disminuye después de la absorción de partículas [25]. Sin embargo, pocos estudios han investigado los cambios en la movilidad de los macrófagos después de la absorción de fármacos terapéuticos. A continuación, se analizó el cambio en la movilidad de los macrófagos después de la absorción de nanopartículas, y evaluamos los efectos de la irradiación (IR) sobre el reclutamiento y la retención de los monocitos derivados de médula ósea (BMDMs) en un modelo murino de tumor de próstata.
Materiales Métodos y
células y
la línea celular de cáncer de próstata TRAMP-C1 se adquirió de la Colección Americana de Tejidos Tipo (ATCC; CRL-2730) Animales
. De seis a ocho semanas de edad C57BL /6J o C57BL /6-Tg (CAG-EGFP) ratones 1Osb /J fueron adquiridos de la Nacional Centro de Animales de Laboratorio, Taiwán. Las recomendaciones de la guía aprobada para el cuidado y uso de animales de laboratorio por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad Nacional Tsing Hua, Taiwan (número de aprobados: CICUAL: 10012), fueron seguidos en todo momento. Los tumores se generan mediante la inoculación intramuscular de 3 × 10
6 células viables en el muslo. Los tumores en el muslo se midieron por el calibre grueso en tres ejes ortogonales para determinar los volúmenes tumorales.
Preparación de los monocitos derivados de médula ósea (BMDMs).
células de médula ósea fueron cosechadas de ratones C57BL /6J o ratones C57BL /6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb /J mediante el volcado de fémur y la tibia con 2% de suero bovino fetal (FBS) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medio. Las células fueron cultivadas en medio de diferenciación (medio RPMI que contiene 10% de FBS, 10 ng /ml de M-CSF recombinante de ratón (amp I +; D)) durante 24 h. Se recogieron las células no adherentes y se cultivaron en placas de cultivo de unión ultrabaja (Cat #:. 28009033, Corning). Las células se diferenciaron adicionalmente en medio de diferenciación durante 7 días. El medio de diferenciación se cambió cada 2 días. Las células se cultivaron a continuación una más días en medio condición antes del experimento. El medio de condición se hizo de 50% de medio de diferenciación y 50% de medio de células tumorales irradiadas o no irradiado. Las células fueron irradiadas en fase logarítmica de 70 Gy o simulada irradiaron usando una fuente de cobalto con una dosis de 10 Gy /minuto en el Centro de Desarrollo de Tecnología de la Ciencia Nuclear y de la Universidad Nacional Tsing Hua, Taiwan. Un día después de la irradiación, se recogió el medio, se centrifuga para eliminar los residuos, y se pasa a través del filtro 2 micras.
La citometría de flujo ensayo
Las alícuotas de células (5 x 10
5) fueron bloqueada en 10% de suero normal de cabra en PBS durante 15 minutos a temperatura ambiente seguido por incubación con anticuerpo colorante conjugado fluorescente anti ratón anticuerpos conjugados con FITC CD11b monoclonales, anti-ratón CD45 de anticuerpo monoclonal conjugado con PE, conjugado con FITC F4 anti-ratón /80 anticuerpo monoclonal, FITC-conjugado anti células CD68 anticuerpo monoclonal de ratón o anticuerpo monoclonal CD206 anti-ratón conjugado con PE durante 45 minutos en hielo. Todos los anticuerpos fueron adquiridos de BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.). Las células se lavaron tres veces en PBS y se analizaron por FACSCantoII citómetro de flujo (BD, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.)).
La adopción de las nanopartículas por BMDMs
Varios nanopartículas como perfluropentane marcado con Dio droplet preparado por el profesor Chi-Kuang Yeh [26], 3,3-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) burbujas de polímero -Laden PAAC-d25 y doxorubicina (Dox) RESORTE vesículas PAAC-d15 (PAAC-Dox) preparados por el Prof. Hsin -chen Chiu [27, 28] se cultivaron con BMDMs durante 4 h. BMDMs pre-cargado con PAAC-Dox se utilizaron para
in vitro
estudio.
in vitro la migración de ensayo
El ensayo de migración se realizó como los procedimientos descritos en la publicación anterior { Wang, 2012#250}. Cada ensayo se realizó por triplicado y se repitió 3 veces.
Modelo in vivo de tumores
Los tumores se dejaron crecer hasta un tamaño de 5 mm de diámetro y luego tratados por 6-MV rayos X de un acelerador lineal a una tasa de dosis de 2 a 3 Gy /min y un 1,5-cm bolo en la superficie. Los productos químicos o BMDMs (5 x 10
6 células /ratón) fueron por vía intravenosa (i.v.) inyectado a 1, 4 y 7 días después de una sola dosis de 25 Gy. La cantidad de Dox dentro de 5 x 10
6 células de BMDMs (es decir. BMDMs-PAAC-Dox) se determinó por la intensidad de fluorescencia DOX a 560 nm de los lisados de células y la concentración de Dox de todos los tratamientos se ajustó para asegurarse de que todos los ratones fueron inyectados con misma cantidad de Dox, que era equivalente a 1 mg Dox /Kg de peso corporal. El tamaño del tumor se midió dos ~ tres veces a la semana por pinzas antes del sacrificio para histología.
La inmunohistoquímica y análisis de imágenes
La preparación del tejido y los procedimientos de tinción fueron los mismos que se describe en la publicación anterior {Chen , 2009#176}. hipoxia tumoral se estudió mediante inyección i.p. inyección de 4 mg de hidrocloruro de pimonidazole (Hypoxyprobe ™ -1 Kit, Hypoxyprobe, Burlington, MA, EE.UU.) en 0,1 ml de solución 1 h antes de la cosecha tumor. Los tejidos se retiran y se colocan en frío paraformaldehído al 4% durante la noche y luego procesamiento y la inclusión en parafina u OCT. Diez micrómetros secciones de criostato se fijaron en metanol a -20 ° C durante 10 min, y después se rehidratan en PBS. La unión no específica fue bloqueada por secciones incubando en el 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS durante 30 min. Pimonidazole (PIMO) se detectó con anticuerpo de ratón (Hypoxyprobe) y de cabra anti-ratón IgGγ1 Alexa 488 (Invitrogen). Para detectar la hipoxia tumoral y su asociación con las células endoteliales vasculares, co-tinción se realizó con un anticuerpo monoclonal de ratón (Hypoxyprobe-1 Kit; Chemicon) y una rata anti-ratón de anticuerpos CD31 (BD Biosciences). Para identificar los macrófagos, rata anti-ratón de F4 /80 (Serotec, Oxford, Reino Unido), de rata anti-ratón CD68 (Serotec, Oxford, Reino Unido), de rata anti-ratón CD11b (BD biociencias), y de rata anti-ratón CD45 (BD se han usado Biosciences). Los anticuerpos primarios fueron detectados utilizando anticuerpos secundarios marcados con los fluorocromos Alexa Fluor 594 (Molecular Probes), Alexa 488, o anti-conejo FITC (BD Biosciences). Para cuantificar los acontecimientos positivos, cada tumor se seccionó en serie, 5 secciones 100 micras aparte estaban manchadas, las imágenes fueron capturadas por AxioCam cámara MRC-5 en un microscopio de fluorescencia Axiovert40 (Care Zeiss, Güttingen, Alemania) o un microscopio láser confocal de barrido (FluoView 1000, Olympus, Japón), y el número total de eventos positivos se analizó por Image-Pro 6 (Media Cybernetics) por ratón (n ≧ 3 ratones por grupo).
el análisis estadístico
los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 5 (GraphPad software, Inc., CA, EE.UU.). Para todas las comparaciones, la significación estadística se probó por ANOVA de una sola vía o el test T de Student, y
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
La infiltración y la diferenciación de BMDMs en tumores establecidos
Para examinar si BMDMs podría actuar como portadores celulares en la radioterapia del cáncer, GFP-BMDMs fueron por vía intravenosa (iv) se inyecta en ratones C57BL /6J con diámetro tumores TRAMP-C1-5 mm en el muslo después de una sola dosis de 25 Gy de radiación. Microscopía de fluorescencia del tumor mostró que GFP
+ células comenzaron a aparecer en los bordes del tumor 1 día después de la inyección (Fig S1), aunque no hubo una diferencia significativa entre el control y los tumores tratados con IR (Fig 1AA y 1AB). Una semana después de la inyección (Fig 1Ac y 1AD), el número de GFP
+ células aumentaron y se distribuyeron de manera indiscriminada en todo el tejido tumoral. Si bien estos GFP
+ células todavía podría ser detectada en los tumores tratados con IR después de dos semanas (Fig 1A-1F), sólo unos pocos permanecieron en los tumores de control (Fig 1A-1E). El recuento de las buenas prácticas agrarias
+ células confirmado que los tumores tratados-IR tenido más GFP
+ células que tenían los tumores de control después de dos semanas 1 y 2 (Figura 1B).
(A) Microscopía de fluorescencia de detección de GFP-BMDMs dentro de los tejidos tumorales cerebrales en el día 1 (a y B), una semana (C y D), o dos semanas (e y F) después de la inyección intravenosa de 2 x 10
6-GFP BMDMs. La flecha apunta a las células agrandadas en la plaza interior. La barra de susto = 50 micras. (B) La cuantificación de GFP + células dentro de los tejidos tumorales. Los datos representan el número promedio de células GFP + de cada sección del tumor entero de 3 tejidos tumorales se contó bajo 40X len objetivo. Bar: SE de 3 tumores de cada tratamiento. ***: P & lt; 0,005 por la prueba T de Student.
Para caracterizar mejor el fenotipo de la GFP-infiltrante BMDMs, citometría de flujo (Figura 2) e inmunohistoquímica (IHC) (Fig S2) se utilizaron para evaluar los cambios fenotípicos de GFP-BMDMs
in vitro
y
in vivo
, respectivamente. Después de 8 días de diferenciación
in vitro
, todo GFP-BMDMs expresaron CD45 y CD11b, mientras que el 85,4% ± 1,9% expresó F4 /80 y 61,0% ± 1,7% expresa CD68
+ (Figura 2A). La cuantificación de la tinción de los tejidos tumorales mostró que el 97% de las buenas prácticas agrarias
+ células en los tumores de control también expresó CD45, el 85% expresó CD11b, el 62% expresó F4 /80, y aproximadamente el 47% eran CD68
+ (figura 2B) . Estas proporciones no cambian con el tiempo, aunque estas proporciones fueron ligeramente inferiores en comparación con los
in vitro
resultados. tratamiento IR (25 Gy) no alteró significativamente la proporción de CD45
+ GFP
+ y CD11b
+ GFP
+ células, aunque hubo un aumento significativo en el número de CD68
+ GFP
+ y F4 /80
+ GFP
+ celdas de 1 semana después de IR (figura 2B).
El porcentaje de células GFP + (a) CD45 co-expresa, CD11b, antígeno F4 /80, o CD68 como se ensayó mediante citometría de flujo para los monocitos diferenciarse de las células de la médula ósea cosechadas a partir de ratones C57BL /6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb /J ratones
in vitro
. Bar: SE de 3 experimentos independientes. (B) El porcentaje de células GFP + CD45 co-expresa, CD11b, F4 /80, o antígeno CD68 examinado por inmunohistoquímica (IHC) dentro de los tumores tomados de un día o una semana después de 25 Gy de irradiación (IR) o vergüenza irradiado ( Controlar). El porcentaje promedio de cada marcador de superficie de células GFP + de 5 campos seleccionados al azar de cada tumor de 3 tejidos tumorales se sumará en 40X len objetivo. Bar: SE de 3 muestras tumorales. ***:. P & lt; 0,005 por una forma de prueba de ANOVA
irradiado TRAMP-C1-medio condicionado tumoral promueve la migración de BMDMs hacia acondicionado tumoral medio
Para examinar si microambientes tumorales producen factores que promueven la migración de monocitos, la capacidad migratoria de BMDMs en varios medios acondicionados se examinó mediante un ensayo de cámara de Boyden. medio acondicionado TRAMP-C1 (T-CM) fue más eficaz que medio normal de cultivo (CTRL) o medio que contiene 10 ng /ml rM-CSF en la obtención de la migración BMDM (Fig 3A). Sin embargo, la tasa de migración de BMDMs hacia irradiado medio acondicionado TRAMP-C1 (IR-CM) u otro medio acondicionado por ALTS1C1 línea celular de astrocitoma murino (A-CM) fue similar a aquella en la que estas células emigraron hacia T-CM. Esto indica que los microambientes tumorales expresan factores que atraen a los monocitos, y explica por qué GFP-BMDMs tienen una tasa de infiltración inicial similar en el control y tumores irradiados vagabundo-C1. Sin embargo, estos datos no pueden explicar por qué los tumores irradiados contienen más GFP-BMDMs a 1 y 2 semanas después de RT. Para examinar adicionalmente si los tejidos irradiados afectan BMDM capacidad migratoria, BMDMs fueron pre-acondicionado en diferentes medios acondicionados para 1 día antes del ensayo de migración. Se encontró que BMDMs pre-acondicionado en T-CM demostró un aumento en la capacidad migratoria hacia T-CM de medio de diferenciación normal (CTRL), y esta capacidad se mejoró aún más si BMDMs se cultivaron primero en el IR-T-CM (figura 3B). Sin embargo, ambas condiciones previas no afectaron a la migración de BMDMs hacia el medio de cultivo normal (figura S3). Además, este efecto era específico de tumor, como las células migraron más rápido hacia el medio acondicionado-TRAMP-C1 que hacia medio ALTS1C1 acondicionado (IR-A-CM * en la figura 3B). En conjunto, estos resultados indican que, después de entrar en microambientes tumorales irradiadas, los macrófagos pueden obtener una mayor capacidad de migrar dentro de los tumores.
(A) La comparación de la capacidad de migración de los monocitos hacia diferentes medio condición dentro de la cámara inferior. CTRL: medio de cultivo celular regular. RM-CSF: medio de cultivo celular regular que contiene 10 ng /ml de RM-CSF. T-CM: medio-TRAMP C1condition irradiados. IR-T-CM: 70 Gy irradiado TRAMP-C1 medio condición. A-CM: irradiados condición ALTS1C1 medio. (B) La influencia de la condición previa de la capacidad de migración BMDM. CTRL *: BMDMs fueron pre-acondicionado en el suero diferencial normal y luego se examina para su migración hacia el medio de cultivo normal y regular. CTRL: BMDMs fueron pre-acondicionado en medio diferencial normal y luego examina para su migración hacia T-CM. T-CM: BMDMs fueron pre-acondicionado en T-CM durante 24 horas y después se examinan para su migración hacia T-CM. IR-T-CM: BMDMs fueron pre-acondicionado en irradiado T-CM durante 24 horas y después se examinan para su migración hacia T-CM. IR-A-CM *: BMDMs fueron pre-acondicionado en irradiado T-CM durante 24 horas y después se examinan para su migración hacia A-CM. Bar: SE para 8-10 campos seleccionados al azar de cada pocillo de 3 experimentos independientes. **: P & lt; 0,01; ***: P & lt; 0,005; ns:. P & gt; 0,05 por ANOVA de una manera
Para estudiar más a fondo los efectos de pre-acondicionamiento de la capacidad migratoria de los macrófagos, citometría de flujo se utilizó para examinar la expresión de la diferenciación de los macrófagos asociada marcadores CD45, CD11b, CD68, F4 /80, y CD206 para caracterizar los fenotipos de los macrófagos. El porcentaje de cada marcador de superficie no difirió significativamente entre los BMDMs de control y los pre-acondicionado en el IR-T-CM (figura 4A). Además, el flujo de los histogramas de citometría de muestran que la intensidad de fluorescencia media (MFI) de estos marcadores de superficie en BMDMs control frente a IR-CM BMDMs también no difirió significativamente (S4 Fig), con la excepción de CD68 (Fig 4B) y F4 /80 ( Fig 4C). El pico CD68 solo (IMF: 770) en BMDMs de control aumentó y se dividió en dos picos, es decir, CD68
mediados y CD68
altas cumbres, con las IMF de 787 y 4337, respectivamente (Figura 4B). El MFI de F4 /80 se redujo de 9.7 a 5.7. Aunque no hemos sido capaces de identificar el principal factor que contribuye a esta diferencia, estos resultados indican que la cultura de un día en la TR-CM durante la diferenciación puede alterar las características fenotípicas y migratorias de BMDMs.
(A) La porcentaje de células que contienen BMDM CD45, CD11b, CD68, F4 /80, o antígenos de superficie CD206 fue examinado por citometría de flujo. CTRL: las células derivadas de la médula ósea se diferencian en un medio ordinario de la diferenciación BMDM durante 8 días. IR-T-CM: las células derivadas de la médula ósea se diferencian en un medio ordinario de la diferenciación BMDM durante 7 días y después cultivados in irradiado condición TRAMP C1-medio (IR-T-CM) durante 24 horas. (B) El histograma de la intensidad de anticuerpo anti-CD68 conjugado con FITC para BMDM diferenciada de diferentes condiciones. (C) El histograma de la intensidad de anti-F4 /80 anticuerpo conjugado con FITC para BMDM diferenciada de diferentes condiciones. Bar:. SE de 3 experimentos independientes
BMDMs pre-acondicionado recuperados de captación inducida por la pérdida de la migración
Muchos estudios han demostrado que los monocitos y macrófagos tienen una gran capacidad para el acceso a diversos nanopartículas [17-20]. En este estudio, BMDMs fueron capaces de tomar hasta nanopartículas (Fig S5), tales como burbujas dio-cargados PAAC-D25 de polímeros, cargados-Dox vesículas PAAC-d15, y las gotitas de perfluoropentano marcadas con DiO. En modelos experimentales con vesículas PAAC-D15 cargados-Dox y gotitas de perfluoropentano marcadas con DiO, la movilidad BMDM disminuyó después de tomar las partículas (Fig 5A), como se muestra por medio de ensayos de migración, y un ensayo de titulación mostró que la movilidad BMDM negativamente correlacionada con la cantidad de partículas cargadas previamente (figura 5B y 5C). Mientras que estos datos confirman que BMDMs pueden ser portadores celulares para la formación de imágenes o nanopartículas terapéuticas, también indican que la migración BMDM se deteriora después de la absorción de carga. Sin embargo, la pérdida de carga útil migración inducida fue mitigada en BMDMs derivados-IR-T-CM, aunque estas células eran aún más lento que BMDMs un-cargado, pre-acondicionado (Figura 5D).
(A) La tasa de migración de BMDM se disminuye después de uptaking hasta las vesículas cargadas PAAC-d15-Dox o gotitas de perfluoropentano lableled-Dio. (B) Un ensayo de valoración para la relación inversa entre la cantidad de vesículas PAAC-D15 cargados-Dox (como se muestra por la IMF de Dox en el eje izquierdo medida por citometría de flujo) y el número de BMDM migran a través de la cámara de Boyden (como se muestra por las cuentas /de campo en el eje de la derecha). (C) Un ensayo de valoración para la relación inversa entre la cantidad Dio marcado con gotitas de perfluoropentano (como se muestra por la IMF de DiO en el eje de la izquierda) y el número de BMDM migra a través de la cámara de Boyden (como se muestra por la cuentas /campo en el eje derecho ). (D) Comparación de la tasa de migración de BMDM pre-cultivaron en regular (CTRL) frente a IR-T-CM (Pre-condición) durante 24 hrs. Bar: SE para 8-10 campos seleccionados al azar de cada pocillo de 3 experimentos independientes. ***: P & lt; 0,005; **: P & lt; 0,01 por ANOVA de una manera
BMDM la entrega de nanopartículas terapéuticas mejora la eficacia de la radiación therap
y
Para determinar si previamente. BMDMs acondicionado pueden llevar nanopartículas cargadas con fármaco como un adyuvante para la radioterapia, doxorubicina (Dox) fue encapsulado por primera vez en vesículas PAAC-d15, que puede prevenir la citotoxicidad inducida por Dox en los macrófagos por hasta 72 h
in vitro
( datos no mostrados). BMDMs eran primera pre-cultivaron en IR-T-CM durante 1 día, luego con vesículas PAAC-D15 encapsulados-Dox (PAAC-Dox) para 4 h antes de la inyección. La concentración de vesículas PAAC-Dox se determinó mediante una curva de valoración (Fig 5) para optimizar la carga Dox contra la atenuación de la tasa de migración. La concentración de Dox dentro BMDMs se cuantificó espectrofotométricamente, y se utilizó para evaluar la cantidad de Dox y PAAC-Dox administrado (equivalente a 1 mg Dox /kg de peso corporal). Libre de Dox, PAAC-Dox, BMDMs, o BMDMs cojinete PAAC-Dox (BMDMs-PAAC-Dox) se inyectaron por vía intravenosa en ratones con 5 mm de diámetro tumores TRAMP-C1 después de 1, 4, y 7 días de una dosis única de 25 radioterapia Gy. La curva de crecimiento del tumor muestra que el libre Dox, PAAC-Dox, y BMDMs-PAAC-Dox sola (Figura A y B en S6 Fig), pero no PAAC, BMDMs, o BMDMs-PAAC (datos no mostrados), reducen el crecimiento del tumor. Una sola dosis de 25 Gy entregado a un tumor de aproximadamente 5 mm de diámetro (IR) retrasa el crecimiento del tumor durante aproximadamente 4 días (Fig 6A). Este efecto de IR se mejoró aún más cuando Dox, PAAC-Dox, o BMDMs-PAAC-Dox se administraron después de IR. La comparación de los volúmenes tumorales después de cada tratamiento al final de la experimentación (Fig 6B) demostró que los adyuvantes, DOX libre, PAAC-Dox, y BMDMs-PAAC-Dox, mejora de forma significativa el retraso del crecimiento tumoral IR inducida. la supresión del crecimiento tumoral máxima se consigue después de IR con la administración de BMDMs-PAAC-Dox.
(A) curva de crecimiento del tumor de los tumores TRAMP-C1 crecientes por vía subcutánea en el muslo después de diversos tratamientos de combinación. IR: 25 Gy de radiación se administra cuando el diámetro del tumor es de alrededor de 5 mm. PBS, Dox, PAAC-Dox o BMDMs-PAAC-Dox se administró por vía intravenosa a 1, 4, y 7 días después del tratamiento de radiación. Los datos representan la media de tres a cinco ratones de cada grupo de una información representativa conjunto de 3 experimentos repetidos e independientes. (B) Comparación del volumen del tumor al final de los experimentos. Bar: SE. **: P & lt; 0,01; ***: P & lt; 0,005; n.s .: P & gt; 0,05 por una forma de prueba de ANOVA. (C) y (D) de imagen fluorescente Representante de tejidos tumorales obtenidos de un día después de la última administración de PAAC-Dox. (E) y (F) de formación de imágenes fluorescentes Representante de tejidos tumorales obtenidos de un día después de la última administración de BMDM-PAAC-Dox. barra de escala = 50 um. La comparación de la intensidad de fluorescencia DOX dentro PIMO negativo frente región PIMO positivo después de una inyección (G) o tres inyecciones (H) de PAAC-Dox frente BMDMs-PAAC-Dox entre tumor con (IR) y sin (w /o IR) 25 Gy de la irradiación. Los datos representan la intensidad de fluorescencia media dentro Dox PIMO- o PIMO + región de 5 campos seleccionados al azar de cada tumor de 3 tejidos tumorales se analizó mediante Image Pro 6 bajo mismo tiempo de exposición de 40X de formación de imágenes de la lente objetivo. Bar: SE. ***: P & lt; 0,005; **: P & lt; 0,01; *: P & lt; 0,05 por ANOVA de una manera
A fin de examinar la distribución espacial de Dox entregado bajo diferentes protocolos, los tejidos tumorales 1 día después de cada inyección se sometieron a tinción inmunohistoquímica (IHC).. PAAC-d15 vesículas encapsuladas Dox entregado por BMDMs co-localizada con CD11b
+ macrófagos en el día 1 después de la primera inyección (Figura C en S6 figura), lo que confirma que las vesículas PAAC-d15 pueden prevenir la citotoxicidad mediada por Dox en el portador para un máximo de 72 h. IHC mostró además que Dox con o sin encapsulación polimérico vesícula, a cargo de la circulación, fue distribuido principalmente dentro de un rango de 100 micras de CD31
+ vasos (Figura 6C) y en las regiones negativas Pimo (figura 6D). Cuando Dox se encapsuló dentro de las vesículas PAAC-D15 y llevado por BMDMs, sin embargo, la señal de Dox se pudo encontrar en lo que 100 micras de distancia de los vasos (Fig 6E) y dentro de la PIMO
+ región hipóxica (Fig 6F). Para confirmar si el efecto aumentado de IR y BMDMs-PAAC-Dox se asoció con el tropismo de hipóxico BMDMs, la intensidad de la señal de Dox fluorescente en PIMO
+ y PIMO
- las regiones 1 día después de la primera o la última inyección (figura 6G y 6H) se comparó en los grupos de tratamiento con y sin radiación pre-exposición. Se encontró que la Dox entregado por vesículas poliméricas se distribuyó homogéneamente dentro de los tumores de tratamiento único (es decir, sin IR). No se observó ninguna diferencia significativa entre PIMO
+ y PIMO
- regiones en los tumores con tratamientos individuales después de 1 ó 3 inyecciones. Por otra parte, la intensidad de fluorescencia Dox en los tumores de tratamiento único entregados por BMDMs-PAAC fue mayor en PIMO
+ regiones independientemente del punto de tiempo después del tratamiento. Pre-exposición de los tumores a IR aumento de la distribución de Dox entregado por vesículas PAAC-D15 a la PIMO
- regiones 1 día después de la primera inyección, pero tuvo un efecto menor después de 3 inyecciones. Por el contrario, previa a la exposición de los tumores a RT no afectó la acumulación de Dox en PIMO
+ regiones de tejidos obtenidos 1 día después de la primera inyección, aunque la intensidad relativa Dox en PIMO
+ regiones se mejoró aún más después de 3 inyecciones .
Discusión investigadores
La capacidad de los macrófagos para fagocitar partículas extrañas y de infiltrarse en los tumores se llevó a investigar los macrófagos como posibles portadores celulares para agentes terapéuticos o de diagnóstico por imágenes. Aunque un reciente informe de Choi
et al
. [21] confirmó el potencial terapéutico de los macrófagos peritoneales cargados-LP-Dox en el retraso del crecimiento tumoral, el efecto era todavía muy limitada. En el estudio actual, se demuestra que BMDMs pre-cultivaron en medio condicionado por células tumorales irradiadas puede mejorar la administración de un fármaco terapéutico a las regiones hipóxicas, y que estas células puede ser un adyuvante eficaz para la terapia de radiación en un modelo de tumor de próstata murino.
el primer
in vivo
experimento usando BMDMs BPA de etiquetado demostró que la GFP-BMDMs fueron capaces de infiltrarse en los tumores en crecimiento, a pesar de que estaban situados principalmente en el borde del tumor, es decir, áreas con una mayor perfusión [29]. El número de infiltrarse en GFP-BMDMs en los tumores de control sigue siendo el mismo en la semana 1, pero se redujo en la semana 2 después de la inyección. Esto puede explicar por qué las inyecciones semanales de BMDMs durante un período de 5 semanas fueron requeridos para observar retraso en el crecimiento significativo en el estudio anterior [21].
En el presente estudio, IR no afectará a la infiltración inicial BMDM, pero los tumores irradiados fueron capaces de atraer constantemente BMDMs por un período de tiempo más largo y en los tejidos más profundos, que eran tumores de control, para un máximo de aproximadamente 1-2 semanas. Esto podría ser una de las ventajas de la combinación de administración de fármacos mediada por BMDM con RT. Nuestro modelo terapéutico demostró que la eficacia de la RT se incrementó después de 3 inyecciones de BMDMs cargados-PAAC-Dox. Comparación de la densidad de Dox en PIMO
+ frente PIMO
- regiones muestra claramente que BMDMs pre-acondicionado pueden suministrar fármacos a las zonas hipóxicas más eficazmente que a las regiones no hipóxicas (Fig 6). De interés, la última inyección fue menos eficaz que la primera inyección (día 2 días frente a 8 de la figura 6G y 6H, respectivamente), y IR redujo significativamente la acumulación de Dox en los tejidos cuando el fármaco no fue entregado por BMDMs. Esto probablemente se asocia con la reducción mediada por IR en la densidad de microvasos [10]. En contraste, IR no influyó en la acumulación de Dox cuando fue entregado por BMDMs, y de la última inyección fue más eficaz que la primera. Estos datos indican que los tejidos irradiados expresan factores que promueven la infiltración BMDM, así como factores que pueden mejorar la focalización de estas células a las regiones tumorales hipóxicas.