Extracto
Un microambiente hipóxica en tumores ha sido reconocida como una causa de enfermedad maligna o resistencia a diversas terapias contra el cáncer. En contraste con los recientes avances en la comprensión de la respuesta aguda de las células cancerosas a la hipoxia, las características de las células tumorales en la hipoxia crónica siendo difícil de alcanzar. Hemos identificado una línea celular de cáncer de páncreas, AsPC-1, que es excepcionalmente capaces de sobrevivir durante semanas en condiciones de oxígeno 1% mientras que la mayoría ensayaron líneas celulares de cáncer mueren después de sólo algunos días en estas condiciones. En la hipoxia crónica, las células AsPC-1 entró en un estado de latencia que se caracteriza por la proliferación no, no hay muerte, y la supresión metabólica. Ellos cambiaron de forma reversible al estado activo después de ser colocado de nuevo en condiciones óptimas de cultivo. recambio de ATP, un indicador de la demanda de energía, fue notablemente disminuido y acompañado por la reducción de la fosforilación de AKT. la activación forzada de AKT resultó en un aumento del recambio de ATP y la muerte celular masiva
in vitro Opiniones y una disminución del número de células latentes
in vivo
. En contraste con la mayoría de las líneas celulares de cáncer, células de cáncer colorrectal primario-cultivadas entraron fácilmente el estado latente con supresión de AKT en condiciones de hipoxia en combinación con condiciones de los factores de crecimiento-agotado. células de cáncer colorrectal primario en la latencia fueron resistentes a la quimioterapia. Por lo tanto, la capacidad de sobrevivir en un microambiente deteriorada por entrar en latencia bajo hipoxia crónica podría ser una propiedad común entre las células cancerosas. La orientación del mecanismo de regulación inducir este estado latente podría proporcionar una nueva estrategia para el tratamiento del cáncer
Visto:. Endo H, H Okuyama, Ohue M, Inoue M (2014) La latencia de las células cancerosas con supresión de la actividad AKT Contribuye a La supervivencia en hipoxia crónica. PLoS ONE 9 (6): e98858. doi: 10.1371 /journal.pone.0098858
Editor: Pankaj K. Singh, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 27 de enero de 2014; Aceptado: May 8, 2014; Publicado: 6 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Endo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por KAKENHI (25461937) (www.jsps.go.jp/j-grantsinaid/, HE, MI), el Fondo Caritativo cáncer Osaka Investigador-Found (HE), Fundación Japonesa para la Enzimología Aplicada (www.mt- pharma.co.jp/jfae/, HE, HO, MI), Science Foundation Takeda (www.takeda-sci.or.jp/, MI), y la Fundación Naito (www.naito-f.or.jp/, MI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El microambiente dentro de un tumor sólido puede ser muy heterogéneo [1]. Debido a redes de vasos sanguíneos incompletos y el desequilibrio entre la proliferación y la angiogénesis, el microambiente en algunas partes de un tumor sólido puede ser hipóxico y mal suministrado con nutrientes [2], [3]. Dependiendo de su microambiente, las células cancerosas pueden mostrar bastante diferentes características de la actividad de células incluyendo la proliferación, activación de la vía oncogénica, y el metabolismo de [4]. Las células tumorales hipóxicas en una región distante de los vasos sanguíneos muestran una disminución de la proliferación [5] y la resistencia a la quimioterapia o la radioterapia [6], [7]. Recientemente, el uso de un
in vivo
método de marcación de genes en, se demostró que las células tumorales en regiones hipóxicas podrían ser el origen de recurrencia después de la radioterapia [8]. También se informó de que el cambio de la expresión génica en la hipoxia crónica se asocia con altas tasas de recurrencia en pacientes con cáncer colorrectal [9]. La investigación de la biología de las células tumorales en condiciones de hipoxia podría ser crítica para mejorar la eficacia terapéutica y para la erradicación del cáncer. Después del descubrimiento del factor-1α inducible por hipoxia (HIF-1α), regulación de la transcripción en respuesta a la hipoxia aguda ha sido bastante bien dilucidado [10]. En contraste con las respuestas de las células cancerosas a la hipoxia aguda, sin embargo, cómo las células cancerosas responden a la condición importante pero diferente de la hipoxia crónica [11] sigue siendo difícil de alcanzar.
señalización PI3K /AKT desempeña un papel central en la supervivencia, proliferación, y el metabolismo en las células del cáncer [12]. Debido a la activación inapropiada de los receptores de tirosina quinasa (RTK) o PI3K, o pérdida de la función PTEN, la activación constitutiva de AKT se observa con frecuencia en múltiples cánceres humanos [12]. AKT activado promueve vías glicolíticas o biosintéticos mediante la activación de GLUT1, hexoquinasa 2, o ATP-citrato liasa. Una de las moléculas de aguas abajo de PI3K /AKT es complejo mTOR 1 (mTORC1), que promueve la síntesis de proteínas y el crecimiento celular. Por lo tanto, Akt /vías mTORC1 juegan un papel importante para el crecimiento del tumor y el metabolismo; Sin embargo, los materiales disponibles para la biosíntesis no siempre son abundantes en el microambiente tumoral heterogénea. En la región hipóxica distante de los vasos sanguíneos, sostenida activación de la vía AKT /mTORC1 podría conducir a un agotamiento crítico de nutrientes y la crisis energética.
La capacidad de suprimir la tasa metabólica basal y entrar en un estado hipometabólico es una salvavidas para muchos organismos, cuando la fuente de energía, como el oxígeno y nutrición están limitados [13], [14]. De hecho, la regulación por disminución de la actividad mTORC1 en hipoxia aguda es ampliamente conocido [15] - [17], y la supresión de mTORC1 se informa, importante para la supervivencia de las células tumorales en condiciones estresantes [4], [18], [19]. Sin embargo, como se ha señalado, la respuesta crónica de las células cancerosas es menos conocida.
Uno de los factores que dificulta una mejor comprensión de la respuesta de las células cancerosas a la hipoxia crónica es la falta de establecidos
in vitro y modelos . La mayoría de los estudios que utilizan líneas celulares de cáncer han llevado a cabo dentro de las 24 h o hasta unos pocos días porque la mayoría de líneas celulares de cáncer no pueden sobrevivir a la grave agotamiento de oxígeno o de nutrientes para un período más largo. En el presente estudio, se encontró que una línea celular de cáncer de páncreas, AsPC-1, puede sobrevivir de forma estable al entrar en un estado de inactividad, letargo, durante semanas bajo condiciones de hipoxia. En el examen de la respuesta celular a este hipoxia crónica, se encontró que la fosforilación de AKT se downregulated, permitiendo células AsPC-1 para reducir la demanda de energía y sobrevivir en condiciones de estrés. Además, se encontró que las células de cáncer colorrectal primario podrían fácilmente entrar en dormancia bajo condiciones de los factores privados de hipoxia y de crecimiento, en el que mostraban caracteres chemoresistant notables.
Resultados
La supervivencia de células líneas bajo crónica hipoxia
para investigar el efecto de la hipoxia prolongada en las células cancerosas
in vitro
, hemos examinado el cáncer de páncreas y varias líneas celulares de cáncer colorrectal se cultivaron en 1% de oxígeno durante más de una semana para representar a la crónica condición, a diferencia de la estructura de menor de un día o así para la condición aguda (Figura S1). La mayoría de las líneas celulares ensayadas no mostraron notable disminución en la proliferación celular y murieron dentro de los 7 días. Por lo tanto, era generalmente difíciles de líneas celulares de cáncer de cultivo más de una semana en condiciones de hipoxia.
En contraste, AsPC-1, una línea celular de cáncer de páncreas, era excepcionalmente capaces de sobrevivir en condiciones de hipoxia prolongados (Figura 1A y DO). En la fase aguda, las células AsPC-1 en la hipoxia crecieron, así como en condiciones de normoxia, pero la tasa de proliferación disminuyeron gradualmente hasta el día 7, y el número de células se estabilizaron alrededor de 10 días a menos de 80% de confluencia en las condiciones experimentales. Las células en normoxia mostraron muerte celular masiva después de 14 días, probablemente debido al agotamiento de factores de crecimiento o nutrientes (Figura 1B y C). En contraste, las células en hipoxia eran viables durante más de tres semanas sin ningún signo de la muerte celular, mientras que el medio no se ha modificado en absoluto. Análisis del ciclo celular reveló que las células en fase S se redujeron drásticamente en el día 7 en la hipoxia en comparación con al día 1 en normoxia o hipoxia (Figura 1D). Las células se acumulan, ya sea en G0 /1 o fase G2 /M. Esta disminución de la proliferación era reversible; una vez que vuelva a oxigenarse y re-sembraron en el medio fresco, las células AsPC-1 mostraron una recuperación de la tasa de proliferación para controlar los niveles con un poco de retraso, incluso después de haber sido cultivados durante 14 días en la hipoxia (Figura 1E). Estos resultados indicaron que las células AsPC-1 podrían entrar de forma reversible un estado inactivo, la latencia, en condiciones de hipoxia prolongados.
número viable de células (A) y la muerte celular por ciento (B) de las células AsPC-1 cultivadas en normoxia ( 20% de o
2) o hipoxia (1% o
2). C) de contraste de fases y las imágenes PI-manchado de células ASPC-1 cultivadas en las condiciones indicadas. Barra de escala = 50 micras. D) Análisis del ciclo celular de las células AsPC-1 en el día 1 en normoxia o el día 1 y el día 7 en la hipoxia. Las células se pulsaron con BrdU durante 2 h y se analizaron por citometría de flujo después de teñir con anticuerpo anti-BrdU y PI. Los porcentajes de las células en fase S se indican. E) Re-crecimiento de las células ASPC-1 en un estado latente. células AsPC-1 fueron cultivadas en hipoxia durante 14 días, y se monitorizaron los recuentos de células después de re-siembra en condiciones de normoxia.
Debido a que la mayoría de los medicamentos de quimioterapia se dirigen a la proliferación de células cancerosas, las células persistentes en la latencia sería resistentes a estos reactivos citotóxicos. De hecho, las células AsPC-1 cultivadas en condiciones hipóxicas fueron resistentes a los tres medicamentos de quimioterapia examinados (Figura S2A). Tanto los niveles de oxígeno y la tasa de proliferación influyen en la efectividad de la radioterapia [20]. ASPC-1 en las células en estado inactivo eran más resistentes a la irradiación de rayos X en comparación con células en normoxia o en hipoxia aguda (Figura S2B). Por lo tanto, ASPC-1 en las células en estado inactivo fueron resistentes a la quimioterapia convencional o terapia de radio.
Evaluación del metabolismo energético en condiciones de hipoxia crónica
Se evaluó además el estado del metabolismo energético de las células cancerosas en el estado latente. Como era de esperar, las células AsPC-1 consumen más glucosa y produjeron más de lactato en la fase aguda de la hipoxia en comparación con la normoxia. Por el contrario, después de 7 días de la hipoxia, la captación de glucosa y producción de lactato atenuadas gradualmente (Figura 2A, S3A y S3B). La tasa de consumo de oxígeno también se redujo en condiciones de hipoxia crónica (Figura 2A). Se calculó el recambio de ATP a partir de la tasa de producción de lactato y la tasa de consumo de oxígeno (Figura 2A) y encontramos que el recambio de ATP disminuye en condiciones de hipoxia crónica. Este hallazgo también fue apoyada por una disminución más lenta en los niveles celulares de ATP después de la adición de un cóctel de inhibidores de la glucólisis y la fosforilación oxidativa (Figura S3C y S3D) [21].
A) Lactato tasa de producción (izquierda) se calculó a partir concentración de lactato y el número de células integral en los períodos indicados. O
2 tasa de consumo (en el medio) se midió usando un electrodo de tipo Clark oxígeno. recambio de ATP (derecha) se calcula a partir de la tasa de producción de lactato y O
2 tasa de consumo (gris oscuro: lactato; gris claro: oxígeno). N1, normoxia 1 día; H1, hipoxia 1 día; H7, hipoxia 7 días. **
p Hotel & lt; 0,01, ***
p Hotel & lt; 0,001. B) RT-PCR cuantitativa de un transportador de glucosa y las enzimas glucolíticas en las células AsPC-1 cultivadas en hipoxia para los días indicados.
Además de estos ensayos, se examinaron los niveles de expresión génica de enzimas glucolíticas y transportadores (Figura 2B). Después de la exposición a la hipoxia aguda, la expresión de
GLUT1
,
HK2
, y
PDK1
aumentado. En contraste, los niveles de expresión de estos genes se redujo en las células de cáncer en la latencia. Estos resultados fueron consistentes con la absorción de glucosa disminuido en hipoxia crónica (Figura S3A). Tomados en conjunto, los resultados indican que las células cancerosas latentes produjeron menos ATP con un menor consumo de ATP en comparación con las células que se dividen activamente, lo que sugiere una disminución de la demanda de energía. Por lo tanto, la supresión del proceso metabólico es otra característica de las células cancerosas en el estado latente.
señalización en las células en el estado inactivo
intracelular
continuación, se investigó la señalización intracelular en el cáncer-estado latente células (Figura 3A). La fosforilación de AKT disminuyó después de 7 días de la hipoxia, incluso bajo la activación sostenida de las RTK aguas arriba (Figura S4A). La fosforilación de S6, una molécula aguas abajo de mTORC1, se redujo desde un punto de tiempo anterior, como se informó anteriormente [15], [16]. Regulación por incremento de fosfo-p38MAPK y regulación a la baja de fosfo-ERK se han notificado a ser un interruptor molecular para la inducción del estado latente en varias líneas celulares de cáncer [22], [23], pero se observó poco cambio en sus niveles, y fosfo-p38MAPK fue más bien la disminución en la hipoxia crónica. La fosforilación de eIF2α, que posteriormente se regula a la baja la síntesis de proteínas mundial [24], se upregulated en la hipoxia aguda, pero reducida en la hipoxia crónica (Figura S4A), lo que sugiere una diferencia crítica en la respuesta de células bajo estas dos condiciones. Los niveles de PHLPP, una fosfatasa AKT Ser473-específico [25], [26], se incrementaron recíprocamente con AKT de-fosforilación (Figura 3A).
A) por inmunotransferencia de la AKT /mTORC1 o ERK /p38 vía MAPK en las células AsPC-1 cultivadas en hipoxia. B) por inmunotransferencia de la señalización de AKT y HIF-1α en las células AsPC-1 que expresan el control de vectores, AKT-peso, o AKT-3A (inactivo). C) el estado del ciclo celular de las células en el día 7 en la hipoxia. Los porcentajes de las células en la fase S se indican encima de la trama y en el gráfico de la derecha. rotación D) ATP se mide mediante la adición de cóctel inhibidor de la glicolisis y la fosforilación oxidativa. N1, normoxia 1 día; H1, hipoxia 1 día; H7, hipoxia 7 días. E, F) número de células viables (E) y la muerte celular por ciento (F) de las células AsPC-1 cultivadas en hipoxia. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01, ***
p
. & Lt; 0,001
Debido a que la disminución de la fosforilación de AKT coincidió con la inducción del estado de latencia, hemos examinado el papel funcional de la fosforilación de AKT en la latencia. Transduced tres AKT construye en AsPC-1 en las células: peso-AKT, AKT-3A (forma inactiva de AKT), y AKT-mΔPH (forma activa constitutiva de AKT) [27]. Cuando se sobreexpresa en peso-AKT o AKT-mΔPH, la fosforilación de Akt se mantuvo incluso en hipoxia crónica (Figura 3B, S4B). En las células de control, la expresión de GLUT1 aumentó en la hipoxia aguda, pero disminuyó en la hipoxia prolongada, de nuevo destacando una respuesta opuesta en las dos condiciones. Por el contrario, en las células que sobreexpresan-AKT-wt, GLUT1 niveles se mantuvieron altos incluso en hipoxia crónica (Figura 3B), acompañado por el consumo continuo de glucosa (Figura S4C). Por otro lado, S6 fosforilación en la hipoxia crónica se redujo incluso en las células WT-AKT-overexpressing (Figura 3B). Análisis del ciclo celular reveló que en peso-AKT-overexpressing células en hipoxia crónica mostró una mayor tasa de proliferación en comparación con las células control (Figura 3C, Figura S4D). En las células ASPC-1 que expresan el vector de control o inactivo AKT-3A, el recambio de ATP disminuyó después de 7 días de cultivo en hipoxia (Figura 3D); Sin embargo, las células que expresan AKT-wt sostenidos alta rotación ATP incluso en hipoxia crónica. Estos resultados indicaron que la activación sostenida de AKT señalización células inhibidas AsPC-1 de entrar en un estado latente en la hipoxia crónica, lo que implica un papel para la supresión de AKT en entrar en latencia. El número de células viables disminuyó mientras que la tasa de mortalidad aumentó después de 14 días en las células WT-AKT-expresión (Figura 3E y F). AKT-células que expresan mΔPH mostraron la muerte celular masiva en los puntos de tiempo tempranos bajo condiciones de hipoxia (Figura S4E y S4F). Finalmente, cuando PTEN, una fosfatasa de PI3K, fue derribado, se observó un ligero aumento en la fosforilación de AKT, acompañado por un aumento en la muerte celular en la hipoxia crónica (Figura S5). Tomados en conjunto, estos resultados indican que la supresión de la fosforilación de AKT es funcional en la supervivencia de las células cancerosas en el estado inactivo.
HIF-1a contribuye en parte a la inducción de estado latente en la hipoxia crónica
a continuación, se examinó la contribución de HIF en las células cancerosas inactivos (Figura S6). Los niveles de proteína de HIF-1α se incrementaron después de la exposición a la hipoxia y se mantienen hasta el día 7 (Figura S6D). Cuando los niveles de HIF-1α se redujeron por la fuerza por shRNA (Figura S6A), el número de células viables disminuyó después de 7 días, mientras que la tasa de mortalidad se incrementó (Figura S6B y S6c), lo que sugiere que sostenida HIF-1α también contribuyó a la supervivencia celular en condiciones de hipoxia crónica. Desmontables de HIF-1α tenido poco efecto en AKT /señalización mTORC1 y algo aumento de los niveles PS6 (Figura S6D), pero la sobreexpresión de AKT no tuvo ningún efecto sobre la inducción de HIF-1α (Figura 3B). Estos resultados indican que HIF-1α y AKT regulados independientemente el estado latente en la hipoxia crónica.
in vivo fotos: por la activación forzada de AKT
A continuación, examinó alteración del estado latente las características de los tumores derivados de AKT-mΔPH que expresan AsPC-1 en las células
in vivo gratis (Figura 4). La fosforilación de AKT era detectable sólo en los tumores AKT-mΔPH pero no en los tumores de control (Figura 4A). Hemos observado la regulación por disminución de la fosforilación S6 y bromodesoxiuridina captación (BrdU) en el área pimonidazole-positiva y su zona proximal de los tumores de control, de acuerdo con nuestro informe anterior utilizando otra línea celular de cáncer [4]. Estas áreas sugieren la existencia de una zona de la hipoxia inducida por la latencia
in vivo
. En contraste, los tumores AKT-mΔPH expresan rara vez contenían la zona latente en la región pimonidazole-proximal. Se observaron las células pS6- o BrdU-positivas, incluso en el límite de la necrosis (Figura 4A).
A) La inmunohistoquímica de xenotumors de células AsPC-1 que expresan el vector de control (superior) o AKT-mΔPH (inferior) . N, necrosis; barra de escala = 100 micras. B) Porcentaje de células BrdU-positivas en el área distal o proximal a pimonidazole-positivas zona. C) Anchura de la zona pimonidazole positivos en los tumores de vector o AKT-mΔPH; *
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. & Lt; 0,001
Hemos cuantificado aún más las células BrdU positivas en las zonas proximal o distal a la zona pimonidazole-positivos (Figura 4B). El porcentaje de células BrdU-positivas se redujo notablemente en el área proximal a la región pimonidazole en comparación con la zona distal en los tumores de control. En contraste, los tumores AKT-mΔPH expresan contenían altos niveles de proliferación de células incluso en la zona proximal. Además, en los tumores de AKT-mΔPH, el área de las células pimonidazole-positivas se redujo en relación a tumores de control (Figura 4C), lo que indica que las células AKT-mΔPH no podían entrar en un estado latente
in vivo
y eran más propensos a la muerte en condiciones de hipoxia.
La inducción de estado latente en las células de cáncer colorrectal primario
a continuación, hemos examinado si la inducción del estado latente en condiciones de hipoxia crónica también se observó en las células cancerosas cultivadas primarias . Hemos establecido recientemente un nuevo sistema de cultivo primario, CTOS (esferoide originado tejido-cáncer), colorrectal, de pulmón y cáncer urotelial [28] - [30]. Preparamos muestras CTOS de pacientes con cáncer colorrectal y de ellas cultivadas
in vitro gratis (Figura 5A y B). crecimiento CTOS se inhibió completamente bajo una combinación de condiciones de los factores privados de la hipoxia y de crecimiento, a pesar de la hipoxia por sí solo no era suficiente para eliminar el crecimiento. Hemos probado CTOS a partir de tres pacientes de cáncer colorrectal, y todas las muestras re-creció bien inmediatamente después de la re-exposición al oxígeno y el crecimiento medio que contiene factor (Figura 5C). Por lo tanto, la inducción de la latencia no se restringió a las células AsPC-1, pero también se observó en células de cáncer primario.
A) el crecimiento CTOS se midió por tamaño en relación con el día 0. muestras C45 CTOS se cultivaron en medio con (GF +) o sin factores de crecimiento (GF). B) Imágenes representativas de C45 CTOS cultivadas en las condiciones indicadas. Barra de escala = 100 micras. C) Recrecimiento de CTOS en estado latente después de la re-oxigenación y la exposición a un medio que contiene factor de crecimiento. D) La inmunohistoquímica de C45 CTOS cultivadas en las condiciones indicadas por 1 día. TUNEL tinción fue en el día 14. La barra de escala = 50 micras. E) inmunotransferencia de AKT /señalización mTORC1 y HIF-1α en C45 CTOS cultivadas en las condiciones indicadas.
Además, hemos examinado la señalización intracelular en CTOS mediante técnicas de inmunohistoquímica e inmunoblot (Figura 5D y E). La hipoxia se combina con el factor de crecimiento agotamiento de señalización AKT completamente bloqueada. Estos resultados fueron consistentes con el crecimiento CTOS (Figura 5A). También se midió el oxígeno y el consumo de glucosa en muestras CTOS (Figura S7). La hipoxia y condiciones de los factores privados de crecimiento atenúan gravemente estos procesos metabólicos, como también se observó en las células AsPC-1.
A continuación, examinaron la quimio-sensibilidad de CTOS en estado latente (Figura 6). muestras CTOS fueron pre-cultivaron en condiciones de los factores privados de la hipoxia y de crecimiento durante 7 días. Después de eso, se expusieron a 5FU o SN38, el metabolito activo de irinotecan, durante 7 días, seguido de lavado y el cultivo en fresco StemPro células madre. Las muestras CTOS en el estado inactivo mostraron rebrote después de haber sido vuelto a las condiciones óptimas de cultivo a una veces 10 dosis más alta que las muestras CTOS en el estado activo (Figura 6A y B). Estos resultados indican que las células de cáncer en el estado latente eran más resistentes a la quimioterapia que los de un estado activo.
a) Las muestras CTOS se cultivaron en medio con (GF +) o sin (GF-factores de crecimiento), y por debajo del 20% de o
2 o 1% de o
2 condiciones. 5FU o SN38 se añadieron a medio y se trataron durante 7 días (indicados por barras negras). En el día 7, el medio se cambió a fresca StemPro células madre que contiene factores de crecimiento (flechas negras), y se dejó que las muestras CTOS para volver a crecer por debajo del 20% de O
2. B) Imágenes representativas de muestras CTOS en (A). Barra de escala = 100 micras.
Discusión
Hemos demostrado en el presente estudio que una línea celular de cáncer y las células de cáncer colorrectal primario alteran la proliferación y el estado metabólico en condiciones de hipoxia prolongada. En virtud de la hipoxia crónica, las células podrían entrar en un estado latente que afecta a cuatro características:. 1) no proliferación, 2) hay muerte, 3) la supresión metabólica, y 4) la recuperación al estado activo después de la restauración de las condiciones óptimas de cultivo
AKT es una llave de regulación de la proliferación celular molécula, la supervivencia y el metabolismo. Es ampliamente aceptado que la activación de AKT contribuye a la supervivencia celular y la resistencia a fármacos en la hipoxia aguda [1], [31] - [33]. En contraste, como hemos demostrado aquí, en la hipoxia crónica, supresión de la actividad AKT es necesaria para la inducción de la latencia y la supervivencia de las células cancerosas. Debido a que el suministro de oxígeno y nutrientes se restringiría en una zona alejada de los vasos sanguíneos en un tumor maligno, la preservación de la fuente de energía al disminuir la demanda de energía podría ser una estrategia de las células cancerosas para sobrevivir en un microambiente crónicamente deteriorada.
El mecanismo por el cual la actividad AKT se suprime en la hipoxia crónica sigue siendo una pregunta abierta. Los posibles candidatos incluyen 1) inactivación de las quinasas aguas arriba, tales como las RTK y PI3K, 2) de realimentación de bucle por la activación S6K, o 3) la activación de las fosfatasas tales como PTEN y PHLPP. Las dos primeras posibilidades son poco probable dan los siguientes resultados en el trabajo actual: 1) la fosforilación de RTK familia erbB y MET se mantuvieron altos incluso en hipoxia crónica (Figura S4A), y 2) la actividad mTORC1 se suprime tanto en la hipoxia aguda y crónica (figura 3A). La tercera posibilidad es apoyada por nuestros resultados que los niveles de PHLPP aumentaron en paralelo con la inactivación de AKT (Figura 3A) y que la supresión forzosa de la muerte PTEN promovido en la hipoxia crónica (Figura S5B). El estudio adicional será dilucidar el mecanismo exacto.
En la respuesta al estrés en la hipoxia, la regulación por disminución de la actividad de mTOR, la respuesta de la proteína desplegada, y la activación transcripcional de HIF han sido bien estudiados [10], [34]. REDD1 suprime la actividad mTORC1 través TSC1 /2 en la hipoxia, lo que resulta en la inhibición de la traducción de ARNm dependiente de la cubierta [15], [16]. En la respuesta de la proteína desplegada, una quinasa ER residente, Perk, fosforila eIF2α y suprime la traducción del ARNm [24]. Debido a que la síntesis de proteínas es un proceso que consume mucha energía, las vías de supresión que puede desempeñar papel en la inducción de la latencia en condiciones de hipoxia crónica. De hecho, se observó supresión de la actividad mTORC1 y un aumento de la fosforilación de eIF2α en hipoxia aguda (Figura 3A, la Figura S4A). Debido a la proliferación celular y el metabolismo se mantuvieron en la hipoxia aguda, que podría ser necesaria, pero no suficiente para inducir la latencia en la hipoxia crónica. HIF-1α y HIF-2α son factores de transcripción que regulan la respuesta hipóxica [10]. En la hipoxia aguda, proteínas HIF se estabilizan y activan la transcripción de varios genes abajo. Por otro lado, en la hipoxia prolongada, las proteínas HIF están según se informa downregulated por mecanismos de retroalimentación. En nuestros resultados, sin embargo, la expresión de HIF-1α se mantuvo en el estado inactivo durante la hipoxia prolongada (Figura S6D), y desmontables de HIF-1α produjo un aumento de la muerte celular en la hipoxia crónica (Figura S6A y S6B), lo que indica que la expresión sostenida de HIF-1α también era necesario para la supervivencia de las células AsPC-1 en condiciones de hipoxia crónica.
Aunque proliferación incontrolada es una característica del cáncer, los tumores humanos, así como los xenoinjertos de tumores humanos exhiben índices proliferativos tan bajas como 20% [ ,,,0],35]. Estas células no proliferativas en los tumores han sido a veces se hace referencia como células quiescentes. Recientemente, la teoría de la célula madre de cáncer, en el que se supone que los tumores para ser mantenido por sus propias células madre, ha sido probado intensamente [36]. Puesto que la interrupción es una característica de las células madre adultas normales, las células madre del cáncer de reposo se han especulado, pero su existencia en tumores sólidos humanos no ha sido explorado directamente [36]. En las células madre adultas, quiescencia se define como una fase del ciclo celular, G0 [37], mientras que las células AsPC-1 en el estado inactivo estaban presentes en el trabajo actual, tanto en G1 /G0 y G2 /M fases (Figura 1C). El estado latente en este estudio podría diferir de la quiescencia, pero las asociaciones permanecer preguntas abiertas.
latencia del tumor ha sido estudiada como la condición en que los tumores permanecen asintomáticos durante un largo periodo, años en algunos casos [37], [38]. Existen dos modelos de la latencia del tumor, la latencia y la latencia en la masa tumoral de las células tumorales. La primera supone un estado de equilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular, mientras que en el último caso, las células tumorales entran en la detención del ciclo celular y permanecen en reposo. La latencia inducida por hipoxia identificado en este estudio, como resultado de la hipoxia crónica en vez de aguda, podrían compartir características con este último, pero las moléculas clave identificados aquí son diferentes. En una línea celular de carcinoma epidermoide, por ejemplo, el saldo de fosfo-ERK y fosfo-p38 MAPK ha sido informado de que el interruptor molecular para la inducción de la latencia de las células tumorales [39]. La señalización de un desfavorables receptores de la superficie celular o microambiente regula al alza MAPK fosfato p38, y las células a continuación, introduzca la fase G1 /G0. Por el contrario, el evento clave para la inducción de un estado inactivo en el trabajo actual fue regulación a la baja de pAKT pero no la activación de p38 MAPK (Figura 3A)
.
Entre las cinco líneas celulares analizadas, sólo las células ASPC-1 podría entrar en el estado latente en condiciones de hipoxia crónica (Figura 1 y S1). Por el contrario, las tres células de cáncer colorrectal primarios examinados podrían entrar en un estado latente bajo una combinación de la hipoxia y el crecimiento agotamiento de los factores (Figura 5). Debido a líneas de células cancerosas son células seleccionadas con una ventaja de crecimiento en condiciones de cultivo con alto contenido de oxígeno, nutrición y factores de crecimiento, que podrían haber perdido la capacidad para suprimir la proliferación en condiciones deterioradas. Por lo tanto, CTOS podría proporcionar una plataforma para investigar la latencia de las células cancerosas. Aunque las células cancerosas latentes no contribuyen directamente al crecimiento del tumor, que puede ser un depósito y una fuente de células tumorigénicas y quimiorresistencia. El mecanismo de regulación a la baja pAKT en condiciones de hipoxia crónica podría ser un objetivo de los nuevos medicamentos diseñados para superar la resistencia terapéutica.
Material y Métodos
Ética Declaración
Preparación y cultura de colorrectal primario cáncer de los pacientes fueron aprobados por el Comité de Ética del Centro Médico de Osaka para el cáncer y las enfermedades cardiovasculares (OMCCCD), y se obtuvieron muestras quirúrgicas en el consentimiento informado por escrito. Los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo OMCCCD Institucional, y llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales.
Células y cultivo celular
Una línea celular de cáncer de páncreas, AsPC-1, se obtenido de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). AsPC-1 se cultivó en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal 10%. cultura hipóxica se logró mediante la incubación de las células con 1% de O
2 y 5% de CO
2 en una incubadora Multigases (ASTEC, Fukuoka Japón). Las células se sembraron a una densidad de 1 × 10
5 células por placa de 35 mm para el número de células contando y 2,5 × 10
5 células por placa de 60 mm para RT-PCR y Western Blot. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo de exclusión del colorante azul de tripano o yoduro de propidio tinción (PI).
El cultivo primario de cáncer colorrectal
Preparación y cultivo de células de cáncer colorrectal primario se realizaron utilizando el método CTOS [28]. Brevemente, las muestras quirúrgicas o tumores de xenoinjertos de ratones NOD /SCID se digirieron parcialmente con Liberase DH (Roche, Mannheim, Alemania) y se filtró a través de coladores celulares. Los fragmentos en el 100-micras o 40 micras-filtro de células (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) se recogieron y se cultivaron en StemPro hESC (GIBCO). Para el cultivo hipóxico, las muestras CTOS fueron incorporados en BD Matrigel Factor de Crecimiento de matriz reducidos (TFG) (BD Biosciences, San Jose, CA) y se cultivaron en StemPro hESC o medio basal (F12 DMEM /Glutamax, 0,1 mM 2-mercaptoetanol, 2% de bovino albúmina de suero). Para el ensayo de quimiosensibilidad durante el período inactivo, las muestras CTOS fueron pre-cultivaron en medio basal bajo 1% O
2 condiciones durante 7 días, y luego tratados con 5-FU o SN38. Después de 7 días de exposición a estos fármacos, las muestras fueron CTOS reoxigene, y el medio de cultivo se cambió a fresca StemPro células madre.
análisis del ciclo celular
ASPC-1 células fueron cultivadas durante los períodos de tiempo indicados y se marcaron con 10 M de BrdU para el último de una hora de cada tratamiento. Las células se tiñeron con 5 mg /ml de anticuerpo PI y anti-BrdU (BD Pharmingen). Las células se analizaron usando un citómetro de enfoque acústico Attune (Life Technologies, Carlsbad, CA).
Medición de la glucosa y la concentración de lactato
concentración de glucosa en el medio de cultivo se midió usando prueba de glucosa 2 (Wako Pure Chemical, Osaka, Japón). El lactato se midió usando el L-ácido láctico (Roche, Darmstadt, Alemania).
Medición del consumo de oxígeno
El oxígeno disuelto se midió usando un electrodo de tipo Clark oxígeno (Modelo 203 F-Kit , Instech Laboratories).