Extracto
La proliferación descontrolada, una característica importante de las células cancerosas, es a menudo provocada por el mal funcionamiento de los reguladores del ciclo celular, tales como proteínas quinasas. Recientemente, las proteínas quinasas relacionadas con el ciclo celular se han convertido en objetivos atractivos para la terapia contra el cáncer, ya que juegan un papel fundamental en la proliferación celular. Sin embargo, los medicamentos quinasa específica de proteínas que se han desarrollado hasta el momento no muestran resultados clínicos impresionantes y también muestran efectos secundarios graves; Por lo tanto, existe, sin duda, una necesidad de investigar nuevos fármacos dirigidos a otras proteínas quinasas que son críticos en la progresión del ciclo celular. quinasa relacionada con Vaccinia-1 (VRK1) es una quinasa mitótica que funciona en la regulación del ciclo celular mediante la fosforilación de sustratos relacionadas con el ciclo de las células tales como el factor de barrera a autointegration (BAF), histona H3, y el elemento de respuesta a AMPc (CRE) -vinculante proteína (CREB). En nuestro estudio, hemos identificado luteolina como el inhibidor de VRK1 cribando una biblioteca de compuestos naturales de molécula pequeña. A continuación, se evaluó la eficacia de la luteolina como un inhibidor VRK1 orientada para el desarrollo de una estrategia eficaz contra el cáncer. Se confirmó que la luteolina reduce significativamente la fosforilación mediada por VRK1 de los sustratos relacionadas con el ciclo de las células BAF y la histona H3, y directamente interactúa con el dominio catalítico de VRK1. Además, luteolina regula la progresión del ciclo celular mediante la modulación de la actividad VRK1, que conduce a la supresión de la proliferación de células cancerosas y la inducción de la apoptosis. Por lo tanto, nuestro estudio sugiere que la inhibición inducida por VRK1 luteolina puede contribuir a establecer una nueva estrategia orientada ciclo celular para la terapia contra el cáncer
Visto:. Kim YS, Kim SH, Shin J, Harikishore A, Lim JK , Jung Y, et al. (2014) la proliferación de células del cáncer de luteolina Suprime Al dirigirse a la vacuna relacionada con quinasa 1. PLoS ONE 9 (10): e109655. doi: 10.1371 /journal.pone.0109655
Editor: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute de la Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Abril, 2014; Aceptado: 2 Septiembre 2014; Publicado: 13 Octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos están dentro del relevent sus archivos de información de Suppoting papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) (2013 a 056.085), el Programa de próxima generación BioGreen 21 (núm PJ009503), Administración de Desarrollo Rural, República de Corea. Este trabajo también fue apoyado por el programa Cerebro Corea 21 del Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología de Corea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Tumorigénesis se asocia con una desregulación de la división celular, que a menudo se desencadena por defectos en la regulación de los moduladores de proteínas que desempeñan un papel crítico en los puestos de control del ciclo celular y la progresión [1]. Entre las proteínas que componen la maquinaria del ciclo celular, las estrategias terapéuticas recientes han tratado de tomar ventaja de dirigirse varias proteínas quinasas del ciclo celular para mejorar la selectividad de drogas y la eficacia terapéutica [2], [3]. Por consiguiente, tales relacionados con el ciclo proteínas quinasas celulares se han convertido en objetivos atractivos para la terapia contra el cáncer, debido a sus funciones fundamentales en el control de crecimiento celular. Por ejemplo, los inhibidores de molécula pequeña de daño de ADN control de las proteínas Chk 1 y 2 se usaron con la intención de causar la detención del ciclo celular y la apoptosis durante la interfase [4] - [6]. Además, algunos inhibidores de la mitosis dirigidas a la familia de las quinasas dependientes de ciclina (CDK), Aurora quinasas y quinasas Polo-como se han desarrollado para provocar la entrada impedido mitótico, detención de la mitosis, y las catástrofes mitótico al causar deficiencias en la condensación de cromosomas, la alineación de los cromosomas, la formación del huso, y el puesto de control conjunto del husillo [1] - [3]. Desde hace varios inhibidores prometedores, ya se han llevado a cabo ensayos clínicos para desarrollar una nueva clase de fármacos contra el cáncer. En las etapas de los ensayos clínicos, por desgracia, su eficacia clínica no mostró resultados impresionantes, sino más bien suscitó respuestas limitadas o efectos secundarios graves, incluso inesperados [3]. Sin embargo, la inhibición efectiva de cierta fase del ciclo celular está siendo considerada como una valiosa estrategia para tratar el cáncer, este modo de identificación de la novela, el ciclo de células específicas, las proteínas diana druggable y el desarrollo de sus inhibidores selectivos que podrían tener potencial para convertirse en agentes quimioterapéuticos son sin duda necesario.
en este sentido, se investigó si la quinasa 1 (VRK1) vaccinia relacionado con el que podría ser una diana molecular adecuada de acuerdo con la estrategia de focalización del ciclo celular. VRK1, que fosforila específicamente restos de serina y treonina, es una quinasa mitótica que juega un papel importante en la progresión del ciclo celular mediante la participación en una amplia variedad de procesos de división celular [7], [8]. expresión VRK1 es específicamente abundante en células altamente proliferativas tales como tejidos fetales y tumorales, y principalmente muestra una tendencia a regular por incremento durante la fase mitótica del ciclo celular [9], [10]. En el G1 /S fases, VRK1 promueve la expresión de ciclina D1 (CCND1) para inducir la transición G1 /S mediante la fosforilación de elemento de respuesta a AMPc (CRE) unión a proteína (CREB) y por lo tanto la mejora de la afinidad de unión de CREB al promotor CCND1 [11 ]. Por otra parte, VRK1 participa en la dinámica de envoltura nuclear (NE) como el montaje NE /desmontaje través de la fosforilación del factor de barreras a autointegration (BAF) durante la interfase y mitosis de entrada /salida [12]. BAF es un funcionamiento proteína asociada a la cromatina como un enlace entre el ADN y el NE [13]. El estado dinámico de BAF durante la progresión del ciclo celular está estrechamente regulada por la actividad VRK1; BAF fosforilación por VRK1 estimula la liberación de la cromatina del NE, y recluta proteínas NE-asociado en la región central durante la telofase [12], [14]. En la fase mitótica, VRK1 afecta a la modificación de histonas mediante la fosforilación de la histona H3 [10]. La fosforilación de la histona H3 Ser10 por VRK1 y otras varias quinasas mitóticas es un código de histonas bien conocido que induce la condensación de la cromatina en la entrada en mitosis o la transición de fase G2 /M. En el ciclo celular, mediada por la fosforilación de la histona H3 VRK1 está influenciada por otros reguladores. Activada por mitógenos proteína quinasa fosfatasa 2 (MKP2), una fosfatasa de especificidad dual que inactiva las MAP quinasas (MAPKs), desempeña un papel como un regulador negativo de la fosforilación de la histona H3 mediada por VRK1 en la fase mitótica [15]. Durante la interfase, Macro histona H2A1.2 (MacroH2A1), una variante de núcleo de histona, suprime el enfoque de VRK1 a la histona H3 por secuestro [16].
Además, estudios recientes también han demostrado la importancia de VRK1 en el proceso de la proliferación celular. VRK1 tiene un papel fundamental no sólo en la proliferación de células somáticas, sino también en el desarrollo de células germinales [17], [18]. Por otra parte, VRK1 también juega un papel en el mantenimiento de los telómeros mediante la fosforilación de hnRNP A1, que estimula la telomerasa y se une a la secuencia de ADN de los telómeros [19]. VRK1 se requiere para la salida G0, la fragmentación de Golgi, el daño inducido por DNA apoptosis, y las respuestas al estrés, que son necesarios para mantener la progresión del ciclo celular [20] - [24]. Por lo tanto, teniendo en cuenta las características relacionadas con el ciclo de las células de VRK1, se requiere la identificación de inhibidor VRK1 para las terapias contra el cáncer. Aunque se ha informado de que algunos fármacos que inhiben otras proteínas quinasas podrían inhibir la actividad quinasa de VRK1 [25], el mecanismo inhibitorio y efectos anti-cáncer a través de la inhibición VRK1 estaban siendo difícil de alcanzar.
En nuestro estudio, hemos examinado una biblioteca de moléculas pequeñas compuesto natural y luteolina identificado (3 ', 4', 5,7-tetrahidroxiflavona) como el de molécula pequeña para inhibir la actividad quinasa VRK1. La luteolina es un flavonoide natural que se distribuye comúnmente en las plantas y es bien conocido para actuar como un potente antioxidante [26]. En los remedios tradicionales de Asia, hierbas luteolina-abundantes se han utilizado como medicina tradicional para el tratamiento de muchos trastornos tales como enfermedades dolorosas, enfermedades inflamatorias, la hipertensión y el cáncer [27]. Hoy en día, muchas líneas de evidencia han demostrado numerosos efectos farmacológicos de luteolina, incluyendo anti-cáncer, anti-inflamación, y las actividades contra la alergia [27], [28]. Aunque se ha comprobado que las propiedades anticancerígenas de la luteolina se asocian con efectos pro-apoptóticos, efectos anti-proliferativos, y la inhibición de la angiogénesis y la metástasis, los mecanismos moleculares que subyacen a sus actividades contra el cáncer no se han determinado completamente [29] , [30].
a continuación, se confirmó que muestra luteolina redujo significativamente la fosforilación de la relacionada con el ciclo celular H3 histona sustratos y BAF, e interactúa directamente con VRK1, atracar en concreto en su dominio catalítico. Por otra parte, hemos demostrado que la luteolina podría inducir la detención del ciclo celular mediante la inhibición de la actividad quinasa VRK1, que conduce a la supresión del crecimiento de células de cáncer y la apoptosis. Por lo tanto, se sugiere que la luteolina es un inhibidor de VRK1, que es uno de los buenos candidatos para el tratamiento de cáncer.
Materiales y Métodos
Productos químicos y Reactivos
La luteolina era de analítica grado y adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Eupatilin y wogonin se proporcionan desde el laboratorio del Dr. Baek en la Universidad de Kyung-Hee. Estos compuestos se prepararon en DMSO (Sigma-Aldrich). [
32P-γ] ATP se adquirió de Perkin Elmer /NEN (Waltham, MA, EE.UU.) y la histona H3 recombinante se adquirió de Roche Applied Science (Indianapolis, IN, EE.UU.). Otras proteínas recombinantes tales como glutatión sulfotransferasa (GST), GST-VRK1, GST-aurora quinasa B (AURKB) y Su-BAF se expresaron en
E.coli
(BL21) y se purificaron por cromatografía de afinidad. Lamin B, deshidrogenasa gliceraldehído 3-fosfato (GAPDH) y GST anticuerpo se adquirió de Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA, EE.UU.) y la histona H3 anticuerpo fosfo-Ser10 fue adquirido de Abcam (Cambridge, Reino Unido) y los contra la histona H3, fosfato CREB y CREB se obtuvieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EE.UU.). VRK1 y fosfo-BAF (regalo de Robert Craigie, NIH, EE.UU.) de anticuerpos se generaron en conejos utilizando proteínas purificadas VRK1. Hoechst 33342 se adquirió de Sigma-Aldrich. CNBr-Sepharose 4B se adquirió de Sigma-Aldrich.
Cultivo de células y transfección
células BEAS-2B se obtuvieron de la ATCC (Manassas, VA). Anteriormente se ha descrito HeLa [31], HEK293A [16], SH-SY5Y [32], U2OS [32], y A549 [31] se utilizaron células en este estudio. La línea celular de adenocarcinoma cervical humano HeLa, línea celular de riñón embrionario humano HEK293A, la línea de células del epitelio bronquial humano BEAS-2B y la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de bovino fetal suero y 1% de penicilina-estreptomicina. La línea celular de osteosarcoma humano U2OS y el adenocarcinoma de pulmón A549 línea celular humana se cultivaron en medio RPMI1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina. Estas líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2. La transfección transitoria de las células HeLa y U2OS se llevó a cabo utilizando un microporator MP-100 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Proteína quinasa ensayo
Una quinasa in vitro ensayo se realizó de acuerdo con los métodos descritos anteriormente [31]. En resumen, un ensayo de quinasa in vitro se llevó a cabo en el tampón de quinasa que contiene GST-VRK1, GST-AURKB, Su-BAF, histona H3, y [32P-γ] ATP. Las mezclas de ensayo de quinasa se incubaron a 30 ° C durante 30 min y la incorporación radioactiva se detectó por autorradiografía. Las cantidades de proteínas utilizadas en ensayos de quinasa se midieron mediante el uso de nitrato de plata (Sigma-Aldrich) o azul de Coomassie (Sigma-Aldrich).
viabilidad de las células de ensayo
células fueron tratadas durante 24 h o 48 h con flavonoides (luteolina, eupatilin, y wogonina) o con dimetilsulfóxido (DMSO) como control. La viabilidad celular se evaluó usando el ensayo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenyltetarazolium (MTT) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se determinó la concentración inhibitoria semimáxima (IC50) utilizando GraphPad Prism (GraphPad, San Diego, CA, EE.UU.).
Preparación de luteolina-Sepharose 4B e in vitro desplegable ensayo
Sepharose polvo de grano 4B se suspendió en solución de activación para la reacción de acoplamiento. Activado perlas de Sepharose 4B se incubaron en solución de acoplamiento con luteolina en un agitador rotatorio a 4 ° C durante la noche. Para el in vitro tire hacia abajo de ensayo, GST-VRK1 y GST se incubaron con perlas de luteolina-Sepharose 4B en solución de reacción durante 12 h. Las proteínas unidas a las perlas se analizaron por inmunotransferencia. Hemos llevado a cabo los procedimientos detallados que se describieron anteriormente [33].
Surface Plasmon Resonance (SPR) de ensayo
Los parámetros cinéticos de la interacción entre VRK1 y luteolina se evaluaron mediante un ensayo usando SPR el sistema automático de SR7500DC (Reichert Technologies, Depew, NY, EE.UU.). Para la preparación de la viruta del oro VRK1 conjugado, VRK1 se inmovilizó sobre un chip CMDH (# 13206066) y luego luteolina, eupatilin y wogonina se inyectaron sobre la superficie del chip de a las concentraciones indicadas, se diluyó en solución salina tamponada con fosfato 10 mM (PBS ) que contiene 1% de DMSO como un tampón de ejecución. El análisis de los datos obtenidos se realizó mediante el software scrubber2 (BioNavis, Tampere, Pirkanmaa, Finlandia).
ligando de acoplamiento ensayo
Un modelo de homología desarrollado a partir de la estructura de rayos X de VRK1 se empleó para evaluar la interacción molecular y el modo de unión de los cables VRK1 recientemente identificados. En el presente estudio, la estructura del modelo fue de 5.000 pasos por el método del gradiente CHARM campo de fuerza y el conjugado en el descubrimiento Studio 3.0 de baño [34] minimizada energía. Las coordenadas 3-D de la luteolina se prepararon utilizando el módulo de ligando y de 2.000 pasos utilizando el algoritmo inteligente en el Minimizer 3.0 Suite Descubrimiento Studio-reducido al mínimo la energía de preparar. El ORO programa de acoplamiento molecular 5.0 se empleó para evaluar el modo de unión de los cables VRK1. Nuestros estudios de unión de RMN anteriores han identificado los principales residuos que son perturbados tras la unión del ligando; estos fueron utilizados para definir el sitio activo [34]. Los ajustes predeterminados y funciones de puntuación, la función PLP ORO y ORO de puntuación, se emplearon para anotar las interacciones de acoplamiento y su modo de atraque probable de unión.
citometría de flujo ensayo
Para el análisis del ciclo celular, las células HeLa fueron transfectadas con GFP, GFP-VRK1, GFP-BAF y después se trató con DMSO (vehículo) y 10 luteolina M. Después, las células se fijaron con 70% de etanol que contiene 0,4% de Tween-20 y se tiñeron con yoduro de propidio en PBS. El contenido del ciclo celular y el ADN celular se analizaron por citometría de flujo en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.). La adquisición de datos se realizó con el programa Cell Quest (BD Biosciences). Para el análisis de apoptosis, las células HeLa se trataron con luteolina de una manera dependiente de la concentración y doble tiñeron con yoduro de propodium y Anexina-V aloficocianina. Las células se analizaron mediante citometría de flujo.
inmunofluorescencia tinción
Las células HeLa fueron transfectadas con la proteína fluorescente roja (RFP), RFP-VRK1, GFP y GFP-BAF usando formación de microporos, y luego tratados con 10 mM de luteolina para 24 h. Posteriormente, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% durante 20 min y se bloquearon con 10% FBS en PBS durante 1 h a temperatura ambiente. Las células se tiñeron con Hoechst 33342 en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente y vistos usando una microscopía confocal láser de barrido (Fluoview FV1000; Olympus, Tokio, Japón). células HeLa se trataron con o sin luteolina (10 M) durante 24 horas. Posteriormente, se llevó a cabo los procedimientos detallados que se han descrito, y luego las células se tiñeron con anticuerpos Lamin B y vistos usando un microscopio de fluorescencia Zeiss (Carl Zeiss Ltd, Jena, Alemania) o la microscopía confocal de escaneo láser.
la transcripción inversa cuantitativa (RT) -PCR
ARN total a partir de células HeLa se preparó usando el agente de TRI (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante y después a transcripción inversa para generar ADN complementario. RT-PCR cuantitativa se realizó mediante la mezcla de SYBR Green PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Japón) y un sistema de tiempo real detector (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). nivel de GAPDH se utilizó para normalizar los niveles de transcripción.
Resultados
La luteolina es un potente inhibidor de la actividad quinasa VRK1
Para examinar si la luteolina podría reprimir eficazmente la actividad enzimática de VRK1, se realizó un
vitro
ensayo de quinasa in y se compararon los efectos inhibidores de luteolina con las de otros compuestos flavonoides como. La luteolina, inhibió la fosforilación mediada por VRK1 de BAF y la histona H3 en una forma dependiente de la dosis. Además, la actividad auto-fosforilación de VRK1 fue atenuada por el tratamiento con luteolina en una forma dependiente de la dosis (Fig. 1A y B). Aunque, compuestos químicos en flavonoides como eupatilin y wogonina que muestran similitud estructural con la luteolina (Fig. 1C), débilmente inhiben la actividad quinasa VRK1 (Fig. 1D y E), luteolina mostraron los efectos inhibidores más prominentes sobre la fosforilación BAF y VRK1 auto-fosforilación , lo que sugiere la especificidad de luteolina. La especificidad de luteolina para VRK1 se confirmó además por sus efectos inhibidores sobre la fosforilación normalizados BAF y VRK1 auto-fosforilación (Fig. 1F y G). Estos resultados indican que la luteolina es un potente inhibidor de la actividad quinasa VRK1, que se requiere para la modulación de la progresión del ciclo celular.
(A) y (B),
in vitro
mediciones de la actividad quinasa en para VRK1 con BAF (a) o VRK1 con la histona H3 (B) se realizaron mediante el aumento de las concentraciones de luteolina (0.0, 1.0, 10, 50, 100, y 250 mM), y luego VRK1 y proteínas sustrato se tiñeron con nitrato de plata. (C), las estructuras químicas y los pesos moleculares de luteolina, eupatilin, y wogonina. (D) y (E),
vitro
ensayo de quinasa in para VRK1 con BAF fueron realizados por concentraciones crecientes (0,0, 1,0, 10, 50, 100, y 250 mM) de eupatilin (D) o (wogonina e), y luego proteínas VRK1 y BAF se tiñeron con nitrato de plata. (F) y (G), la cuantificación de VRK1 auto-fosforilación (F) o fosforilación BAF (G) se describe en (B), (D) y (E). Los datos en (F) y (G) representan las medias de tres experimentos independientes ± SEM.
La luteolina interactúa directamente con VRK1
Debido a que la luteolina suprime la acción de VRK1 hacia sus sustratos, nos la hipótesis de que la luteolina podría inhibir la actividad de la quinasa a través de la unión directa a VRK1. Para investigar la interacción entre la luteolina y VRK1, se realizó un ensayo de pull-down usando perlas de sefarosa conjugada con luteolina. GST no podría obligar a cualquiera de perlas de sefarosa conjugada con luteolina o bolas de control. Sin embargo, GST-VRK1 unido con éxito a las perlas de sefarosa luteolina-conjugado, pero no se unió a perlas de controlar que no fueron conjugados con luteolina (Fig. 2A). A continuación realizó un ensayo de pull-down con lisados de células SH-SY5Y para inspeccionar si la luteolina se une a VRK1 endógeno, además de VRK1 recombinante (Fig. 2B). Endógena VRK1 también podría unirse a perlas de sefarosa conjugada con luteolina. Estos resultados sugieren que la luteolina interactúa directamente con VRK1
in vitro
.
(A), desplegable de ensayo utilizando Sepharose 4B luteolina conjugado con perlas de Sepharose 4B o control perlas con la proteína recombinante VRK1. proteínas GST purificada y GST-VRK1 se incubaron con cuentas indicadas, y luego tire hacia abajo el ensayo se llevó a cabo. Cada proteínas se detectaron por inmunotransferencia con anticuerpo GST. (B), Pull-down ensayo utilizando luteolina conjugado de sefarosa 4B cuentas con lisado de células SH-SY5Y. El lisado celular se incubó con cuentas indicadas, y luego se llevó a cabo desplegable. Las proteínas se detectaron por inmunotransferencia con anticuerpo VRK1. (C), la detección SPR para la interacción de luteolina con VRK1. Los datos se obtuvieron por el método de titulación cinética con la inyección secuencial de analitos sin etapas de regeneración. Los datos para eupatilin y wogonin se obtuvieron por métodos clásicos.
La interacción directa entre la luteolina y VRK1 además se analizaron mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR) para monitorizar la cinética de unión. Las proteínas recombinantes VRK1 se inmovilizaron covalentemente en un chip sensor como un ligando; Posteriormente, luteolina, eupatilin y wogonina se añadieron de una manera dependiente de la concentración como un analito (Fig. 2C). Los parámetros cinéticos de la interacción entre el chip sensor recubierto de VRK1 y estos analitos se evaluaron por el software y están representadas en la Tabla 1. constantes calculadas de estos analitos hacia VRK1 exposición que luteolina tiene más fuerte afinidad de unión entre ellos. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la luteolina se une directamente a VRK1 con alta afinidad de unión.
El efecto inhibidor de la luteolina es mediada por su unión directa al dominio catalítico de VRK1
Para determinar la región de unión de VRK1 para luteolina, la interacción entre la luteolina y VRK1 se evaluó mediante experimentos de titulación de RMN y
in silico
modelado. Los residuos de aminoácidos afectados por la interacción con luteolina mostraron un aumento espectacular perturbaciones de desplazamiento químico (Fig. 3A). Estos residuos están representados en el espectro de las perturbaciones de desplazamiento químico y también asignados en el mapa molecular de VRK1 (Fig 3B), lo que sugiere que estos residuos se encuentran principalmente en la zona del dominio catalítico, que está implicado en la unión de ATP [34].
(A), se realizaron experimentos de titulación de RMN. Espectro de perturbaciones de desplazamiento químico frente a residuos de aminoácidos de la proteína VRK1 después de la unión de la luteolina. (B), Mapeo de las perturbaciones de desplazamiento químico de la proteína VRK1. La mayor parte de los residuos perturbados (en rojo) están situados cerca del dominio catalítico de VRK1. (C),
in silico
modelado del modo de unión de luteolina a la proteína VRK1. Luteolina se predice para encajar en el entorno de la G-loop, sitio catalítico, y α-C lóbulo.
in silico
modelado del modo de unión de luteolina hacia VRK1 , luteolina se predice para encajar en el entorno de la G-loop, sitio catalítico, y α-C lóbulo (Fig. 3C). Los 2, restos 3-dihidroxílicos del grupo 2-fenil en el andamio de cromeno interactúan con el residuo E83 de α-C lóbulo. Además, el grupo 2-hidroxilo también interactúa con el residuo D197 del bucle catalítico. Del mismo modo, el grupo 4-ceto en el andamio de cromeno interactúa con S181 a través de una interacción de enlaces de hidrógeno. La fracción 7-hidroxilo en el andamio cromeno también hace que las interacciones de enlaces de hidrógeno con los residuos de I43 y Q45 del G-bucle. Además de estas interacciones de enlace de hidrógeno, el andamio de cromeno también tiene fuertes interacciones hidrofóbicas de apilamiento con el residuo F48 de la G-bucle y los residuos hidrófobos que rodean el sitio activo (no mostrado). La luteolina tiene la mayoría de sus interacciones clave con el G-loop y residuos del sitio catalítico, que estabilizan la molécula firmemente luteolina en el sitio activo e inhiben su actividad quinasa.
luteolina induce la detención del ciclo celular a través de la inhibición de la fosforilación de BAF por VRK1
la luteolina se ha demostrado previamente para inducir la detención del ciclo celular en la transición G1 /S y G2 /M transiciones de fase [35] - [39]. Sin embargo, el mecanismo molecular de la detención del ciclo celular por la luteolina es desconocida, excepto por la posibilidad de que Aurora B quinasa podría ser una diana molecular de luteolina para regular la progresión del ciclo celular, basado en la evidencia de que Aurora B es inhibida por la luteolina y desempeña un papel como un mediador clave de la progresión mitótica [40]. VRK1 es otra quinasa mitótica que se ha conocido para llevar a cabo funciones de coordinación en la progresión del ciclo celular mediante la fosforilación de varios sustratos relacionadas con el ciclo de las células tales como BAF, histona H3, y CREB [10] - [12]. Por lo tanto, se evaluó si la luteolina induce la detención del ciclo celular mediante la inhibición de VRK1. células PI-manchado tratados con DMSO o luteolina se analizaron por citometría de flujo para evaluar el ciclo celular. Tras el tratamiento con luteolina, la población en la fase G1 significativamente aumentó en comparación con la de las células tratadas con DMSO (Fig. 4A, panel izquierdo). Por el contrario, el aumento de la población en fase G1 desapareció a la sobreexpresión de GFP-etiquetados VRK1 (Figura 4A, panel derecho), lo que indica que la luteolina causa arresto en las primeras etapas del ciclo celular por la inhibición de la VRK1.
( A), análisis del ciclo celular se llevó a cabo por citometría de flujo. las células HeLa transfectadas con GFP o GFP-VRK1 fueron tratados con luteolina durante 24 horas, y 10.000 células fueron cerrada para el análisis. Los datos cuantitativos están por debajo de los histogramas. (B) y (C), las células HeLa tratadas con vehículo o luteolina se tiñeron con anticuerpo lamin B para visualizar envoltura nuclear y con Hoechst 33342 para visualizar el ADN. Alexa 488 anticuerpo conjugado con colorante se utilizó como anticuerpo secundario. Los portaobjetos se visualizaron por microscopía de fluorescencia (B), o microscopía de barrido láser confocal (C). (D), la tinción fluorescente de VRK1, BAF, y el ADN para el análisis de la fosforilación mediada por re-localización de BAF. Las células co-transfectadas con GFP o GFP-BAF con RFP o RFP-VRK1 fueron tratados con DMSO o 10 mM luteolina durante 24 horas.
Como se mencionó anteriormente, VRK1 participa en la fosforilación mediada por re- localización de BAF al citoplasma, condensación de la cromatina a través de la fosforilación de la histona H3, y la expresión del gen CCND1 por la fosforilación de CREB para facilitar la progresión del ciclo celular [10] - [12]. Para explicar con más detalle el mecanismo de la detención del ciclo celular por la interferencia inducida por la luteolina con la actividad VRK1, evaluamos si luteolina perturba estos procesos. Debido a que se ha demostrado que VRK1 aumenta la expresión de CCND1, que se correlaciona con G1 /S progresión, a través de aumento de la actividad del elemento de CRE en el promotor del gen CCND1 mediante la unión CREB fosforilado, especuló que la fosforilación de CREB y el nivel de mRNA de CCND1 puede ser afectados por el tratamiento luteolina. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en la fosforilación de CREB y el nivel de mRNA de CCND1 entre DMSO y tratamiento luteolina (Fig. S1), lo que implica que G1 luteolina inducida /S detención puede haber sido una consecuencia de defectos en otros procesos en lugar de la supresión de la CREB fosforilación.
a continuación se probó la posible participación de BAF en G1 detención S /causado por la luteolina. En
Drosophila
y
C. elegans
, está bien establecido que BAF tiene un papel fundamental en la organización de la estructura nuclear y la progresión del ciclo celular [13], [41]. Además, la localización nuclear de BAF influye en la progresión del ciclo celular en células humanas; VRK1, la única quinasa aguas arriba identificado de BAF, puede alterar BAF localización por la fosforilación de inducir la liberación de BAF a partir de proteínas tanto de ADN y LEM-dominio como LAP2, emerina, y man1 [12], [14], [31], [42]. mediada por VRK1 BAF relocalización es un proceso esencial para la liberación de ADN durante la transición G1 /S. Para detectar las perturbaciones causadas por la luteolina en la dinámica de la envoltura nuclear en la progresión del ciclo celular, teñidas de la envoltura nuclear con el anticuerpo B lámina nuclear. Lamin B se separa de la cromatina en la mitosis, sin embargo, la pérdida de VRK1 o la expresión de BAF mutante perturba la separación de la cromatina de NE [12], [42], [43]. Hemos observado si lámina nuclear B no se dispersó por el tratamiento con luteolina. Nuclear lamin B se libera en el citoplasma en anafase tardía como se muestra en las células tratadas con vehículo, mientras que la lamina B se ha quedado atascado en los cromosomas en la misma fase, como se muestra en las células luteolina tratados (Fig. 4B), lo que sugiere que perturba inhibición VRK1 luteolina inducida VRK1 mediada por fosforilación BAF.
Además, hemos encontrado, además, que la luteolina causada morfología anormal envoltura nuclear como invaginación y ampolla (Fig. 4C), que es un fenómeno a ser inducida por el agotamiento de VRK1 [44] . Por lo tanto, sugerimos que la atenuación luteolina mediada por fosforilación de BAF podría dar lugar a VRK1 morfologías nucleares anormales agotamiento inducido. Para confirmar que la luteolina perturba la fosforilación mediada por BAF VRK1, observamos nivel de fosfo-BAF usando inmunotransferencia. nivel de fosfo-BAF se redujo en 10 mM lisado de células tratadas con luteolina (Fig. S2), lo que indica que la actividad catalítica VRK1 se reduce en luteolina
in vivo
.
Un estudio previo mostró que ectópico expresión de los resultados VRK1 en BAF re-localización en el citoplasma [12], [31]. Por lo tanto, se investigó más a fondo si el fenómeno de la BAF re-localización se vio afectada por la inhibición mediada por luteolina de VRK1. Cuando ambos RFP-VRK1 y GFP-BAF se introdujeron juntos, BAF parecía estar dispersado por toda la célula, como se ha informado anteriormente [31]. Sin embargo, se confirmó que este fenómeno se vio interrumpido por el tratamiento con luteolina (Fig. 4D). La localización de GFP-BAF se limitaba a la nucleoplasma a pesar de VRK1 sobreexpresión, lo que sugiere que el tratamiento con luteolina reducido efectivamente BAF fosforilación mediante la inhibición de VRK1, seguido de la detención del ciclo celular. Para examinar el papel de BAF durante el ciclo celular, se analizó el contenido de ADN después del tratamiento luteolina. El ectópico expresó BAF no influye en la progresión del ciclo celular (Fig. S3A). Tras la administración luteolina, ectópico expresaron BAF no podía rescatar la acumulación de G1 luteolina inducida (Fig. S3B), lo que sugiere que la detención G1 luteolina inducida no es llevada por la inhibición BAF pero por la inhibición de la fosforilación mediada por BAF VRK1.
luteolina induce reducción de la viabilidad celular y la apoptosis posterior
Una vez que se confirmó el efecto inhibidor de luteolina mediada por la unión al dominio catalítico de VRK1, se evaluaron sus efectos anti-tumorales sobre la proliferación de células tumorales y la supervivencia. Los efectos de la luteolina en la viabilidad celular se midió por el ensayo de MTT a diferentes concentraciones. Hemos observado que el tratamiento luteolina redujo significativamente el crecimiento de las líneas celulares tumorigénicas HeLa y U2OS en comparación con las líneas celulares no tumorigénicas BEAS-2B y HEK293A (Fig. 5A). El IC
50 valores en las células HeLa y U2OS se determinaron como 15,41 M y 36,35 mu M, respectivamente, mientras que los de las células BEAS-2B y HEK293A se aumentaron varias veces en comparación con células tumorigénicas (74.41 micras y 263,3 mu M, respectivamente) .