Extracto
Introducción
ADN inadecuados metilación se asocia frecuentemente con el desarrollo de tumores humanos, y en casos específicos, se asocia con los resultados clínicos. En informes anteriores de la metilación del ADN en grado intermedio no músculo cáncer de bajo /vejiga invasivo (CVNMI) han sugerido que los patrones específicos de metilación del ADN pueden tener un papel como biomarcadores de diagnóstico o pronóstico. En vista de la naturaleza agresiva y clínicamente impredecible de alto grado (HG) CVNMI, y la escasez actual de la opción preferida de tratamiento (Bacillus: Calmette-Guerin), novela de análisis de metilación puede revelar de manera similar biomarcadores de la enfermedad resultados que podrían estratificar el riesgo de pacientes y guían la gestión clínica en el diagnóstico inicial.
Métodos servicios asociados-Promotor
metilación isla CpG se determinó en el tejido tumoral primario de 36 NMIBCs de alto grado de la presentación inicial, 12 NMIBCs /intermedia de bajo grado y 3 controles normales de la vejiga. Los genes
Hoxa9
,
ISL1
,
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
y
ZNF154
fueron seleccionados para la investigación sobre la base de los informes previos y /o utilidad pronóstica en /de grado intermedio bajo CVNMI. La metilación se determinó mediante pirosecuenciación de DNA convertido sodio bisulfito, y luego correlacionado con la expresión génica mediante RT-qPCR. La metilación se correlaciona adicionalmente con el comportamiento del tumor, incluyendo la recurrencia del tumor y la progresión a cáncer de vejiga músculo invasivo o metástasis.
Resultados
El
Isl1
genes 'isla promotor asociado era más frecuentemente metilado en recurrente y tumores de alto grado progresivos que sus contrapartes no-recurrentes (60,0%
vs
. 18,2%,
p
= 0,008).
ISL1
y
Hoxa9
mostraron significativamente mayor media de metilación en tumores recurrentes y progresivas en comparación con los tumores no recurrentes (43,3%
vs
. 20,9%,
p
= 0,016 y el 34,5%
vs
17,6%,
p = 0,017
, respectivamente). Concurrente
ISL1 /Hoxa9
metilación en el HG-CVNMI predijo de forma adecuada recurrencia y progresión del tumor dentro de un año (valor predictivo positivo 91,7%), y se asoció con la mortalidad específica de la enfermedad (DSM).
conclusiones
En este estudio se reporta diferencias de metilación y similitudes entre los subtipos clínicos de alto grado CVNMI. Presentamos la capacidad potencial de los biomarcadores de metilación, el momento del diagnóstico inicial, para predecir la recurrencia y progresión del tumor dentro de un año del diagnóstico. Encontramos que los biomarcadores específicos predecir de forma fiable evolución de la enfermedad y por lo tanto pueden ayudar a guiar el tratamiento del paciente a pesar del curso clínico impredecible y heterogeneidad de alto grado CVNMI. Se requiere más investigación, incluyendo la validación en una cohorte de pacientes, para confirmar la utilidad clínica de los biomarcadores de metilación en alto grado CVNMI
Visto:. Cocina MO, Bryan RT, Haworth KE, Emes RD, Luscombe C, Gommersall L, et al. (2015) La metilación de
Hoxa9
y
ISL1
predice la evolución de los pacientes en alto grado para no invasiva-cáncer de vejiga. PLoS ONE 10 (9): e0137003. doi: 10.1371 /journal.pone.0137003
Editor: Bing-Hua Jiang, Thomas Jefferson University, Estados Unidos |
Recibido: 14 de mayo de 2015; Aceptado: August 11, 2015; Publicado: 2 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Cocina et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Médico North Staffordshire, Comité de Premios de Investigación, "impulsar la realización de" Grant, y el hospital de la Universidad del Norte Midlands NHS Cancer Trust Fundación caritativa. BCPP está financiado por el Cancer Research del Reino Unido, la Universidad de Birmingham y el Birmingham & amp; El País Negro y West Midlands Norte y del Sur Integral Local redes de investigación, y patrocinado por la Universidad de Birmingham. La colección de muestras biológicas BCPP es apoyado por fondos del Birmingham Medicina Experimental del Cáncer Centro. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
no músculo invasivo del cáncer de vejiga de alto grado (HG-CVNMI) es un subtipo clínicamente importante de carcinoma de células transicionales de vejiga (TCC), que representan el 10-15% del total de la CTP en la presentación [1] .La naturaleza impredecible de HG-CVNMI con respecto a la recurrencia y progresión de la enfermedad invasiva o metastásica, presenta muchos desafíos para la gestión exitosa. Sin métodos robustos para la predicción de los resultados (recurrencia, progresión, Bacillus: Calmette-Guerin (BCG) fracaso) en el diagnóstico inicial, los pacientes pueden estar bajo tratados con la terapia intravesical solo o sobre-tratados con cistectomía inmediata, tanto con los resultados del paciente adversos atribuidos [2,3].
múltiples estudios han descrito la importancia de las modificaciones epigenéticas en la génesis tumoral, con mayor frecuencia aparente como no apropiado metilación del ADN en las islas CpG promotoras asociadas a genes, y /o cambios que llevan a la modificación de las histonas cola ( s) [4,5] modificaciones .Estas impacto sobre la expresión génica y la promoción de la génesis tumoral predominantemente por silenciamiento de supresor de tumores y /o genes de la ruta de apoptosis [5,6]. Tal silenciamiento génico mediado epigenetically se ha demostrado en CVNMI y el cáncer vesical infiltrante (MIBC), y se dice que se asocia con la recurrencia del tumor, la progresión, invasión y metástasis, sino también los eventos tempranos en el desarrollo de tumores tales como el "campo "fenómeno -defect [7,8]. Estudios recientes ponen de manifiesto la utilidad clínica potencial de los biomarcadores epigenéticos en cáncer de vejiga, la descripción de los marcadores tumorales, de sangre y de orina de metilación del ADN de, por ejemplo, CVNMI recurrencia o quimio-resistencia en MIBC [9-11].
promotor- asociada CpG Island metilación del
Hoxa9
,
ISL1
,
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
y
ZNF154
genes son hallazgos frecuentes en el cáncer de vejiga. En estos casos, la metilación parece estar asociado con las características del tumor agresivos, y puede predecir de forma independiente recurrencia de la enfermedad, progresión, o la mortalidad (DSM) específica de la enfermedad [9,12,13]. Sin embargo, la mayoría de estos informes examinar cohortes heterogéneos, que comprende /de grado intermedio predominantemente baja CVNMI; de alto grado CVNMI no se ha considerado de forma discreta para la enfermedad y /o subtipo modificaciones epigenéticas específicas.
Se evaluó una cohorte única de pacientes con HG-CVNMI para no apropiado promotor asociado metilación CpG Island en la presentación inicial y la eliminación de el tumor primario (s), con respecto a los resultados obtenidos prospectivamente conocidos por un año de no repetición, la recurrencia y progresión (a MIBC o enfermedad metastásica), y con relación a /de grado intermedio bajo CVNMI. La identificación de metilación inapropiada 'el momento del diagnóstico' de HG-CVNMI permitió una identificación preliminar de la novela y biomarcadores pronósticos potencialmente clínicamente útiles.
Materiales y Métodos
muestras de tejido humano
La primaria tejidos tumorales y de la vejiga normal utilizado fueron proporcionados por el Programa de cáncer de vejiga el pronóstico (BCPP, Comité de Ética de Investigación Nottingham: 05 /Q2404 /173) [14], la Universidad de Birmingham Biomateriales Humanos Centro de recursos (Servicio Nacional de Ética de la Investigación (Noroeste 5) : 09 /H1010 /75), y los Hospitales universitarios de Norte Midlands NHS Trust (Servicio Nacional de Ética de la Investigación (Centro sur-Oxford C): 12 /SC /0725). Todas las muestras se obtuvieron después de consentimiento informado por escrito y bajo la aprobación de ética nacionales juntas de revisión apropiados (los números de referencia indicados anteriormente). Todas las muestras se confirmaron histológicamente; Se llevaron a cabo la repetición o la resección transuretral de la cistectomía, y /o terapia intravesical abonadas, dado el sugerido por la Asociación Europea de Urología Directrices [15]. Todos los tejidos humanos primarios (Tabla 1) fueron almacenadas a -80 ° C antes de la extracción de ácidos nucleicos.
Extracción de ADN y bisulfito de modificación
ADN genómico fue extraído a partir de tejidos tumorales y control usando un procedimiento estándar de extracción con fenol-cloroformo [16] y, posteriormente, de bisulfito-modificado como [4] se describe anteriormente. la conversión de bisulfito de ADN se confirmó en todos los casos por PCR con éxito utilizando cebadores específicos de ADN convertido-bisulfito de (secuencias de los cebadores proporcionados en la información de apoyo S1 Tabla). Para aumentar la cantidad relativa y la estabilidad del ADN-bisulfito convertido, se realizó la amplificación de todo el genoma (WGA) como se describe anteriormente [4] (que se describe adicionalmente en la información de apoyo S1 texto).
pirosecuenciación de ADN de bisulfito-convertida
secuencias isla CpG se identificaron a partir de la UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/), e importados en PyroMark Ensayo de diseño de Software 2.0 para el primer diseño (Qiagen, Manchester, Reino Unido). Depende de la frecuencia y densidad de dinucleótidos CpG dentro de la secuencia de interés, cebadores diseñados englobados 4-7 CpG consecutivos en cada gen (secuencias de cebador en la Tabla S1 y detalles de localización genómica en la Tabla S2). Después de la amplificación por PCR de la secuencia diana, pirosecuenciación se realizó con un PyroMark Q24 Pyrosequencer usando PyroMark Q24 Software 2.0 y PyroMark Reactivos Q24 oro (Qiagen), como se describe anteriormente [17] (S1 texto).
metilación era estrictamente definido en los tumores como que comprende un nivel medio de metilación a través de las GPC encuestados de más de cuatro desviaciones estándar (4SD) por encima de la media en los controles normales [4]. El número de tumores metilados (por esta definición) para cualquier gen dado se describe el
frecuencia
de metilación, mientras que el porcentaje medio de metilación de todos los CpG encuestados describe el nivel
significa
de metilación de un tumor en cualquier gen particular.
RT-PCR cuantitativa
ARN total fue extraído de las muestras de control y de tumores usando un protocolo estándar de guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo [16], y el ADN complementaria sintetizada como se describe anteriormente [18] ciclismo .Thermal utilizando SYBR (III) Green fue como se describió previamente [19], con genes diana normalizada a la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (
GAPDH
) (S1 Tabla) como control endógeno (S1 Texto). la cuantificación relativa de la expresión del transcrito se realizó utilizando el método 2
-ΔΔ ciclo umbral (CT) [20]. la expresión del transcrito reducido en cada tumor fue considerado significativo si es inferior a una reducción de 3 veces en relación con significa expresión en muestras de control; lo contrario era cierto para el aumento de la transcripción de expresión [18] (S1 texto).
Informática y las estadísticas
Microsoft Excel 2010 y STATA (v8, Stata Corporation, TX) se utilizaron para llevar a cabo exacta de Fisher , Students 't, y log-rank análisis, y la sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos de la metilación con respecto a los resultados clínicos.
resultados
la frecuencia de metilación dentro de baja /intermedia - y de alto grado CVNMI
Se determinó inicialmente el estado de metilación de los seis genes candidatos en la alta y baja cohortes tumorales /de grado intermedio por Pyrosequence análisis de ADN de bisulfito-convertido. metilación inapropiada de las islas CpG promotoras-asociado (S2 Tabla) fue un hallazgo frecuente en ambas cohortes para el
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
y
ZNF154
genes, en relación con la vejiga normal (Tabla 2).
la Tabla 2 muestra que la frecuencia de metilación en tumores /intermedia de bajo grado fue menor para los
ISL1
que para todos los otros genes investigados (2/12 tumores; 16,7%), aunque en comparación, aumentó la frecuencia de metilación dentro de los tumores Hg (17/36; 45,0%,
p = 0,091
). Por el contrario, la frecuencia de metilación fue menor en HG-NMIBCs para
Hoxa9 gratis (20/36; 55,6%) en comparación con los tumores /intermedia de bajo grado (10/12; 83,3%,
p
= 0,167); (Datos resumidos en la Tabla 2).
Para investigar más a fondo las posibles razones para las diferencias observadas en la frecuencia de metilación entre la alta y baja cohortes de tumores de grado intermedio /de genes específicos, a fin de determinar la metilación de genes específicos frecuencias relativas a las características clínicas de los tumores HG, que abarca los resultados clínicos de un año de no repetición, la recurrencia y progresión.
En
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
y
ZNF154
, las frecuencias de metilación en tumores de recurrencia y progresión fueron marginalmente mayor que sus contrapartes no-recurrencia, y eran en general muy similares a las frecuencias aparentes de bajo grado intermedio /tumores (figura 1).
de izquierda a derecha, la cohorte de tumores metilación de frecuencia /porcentaje, según lo determinado por pirosecuenciación dentro de
Hoxa9
,
ISL1
,
SPAG6
,
NKX6-2
,
ZIC1
y
ZNF154
, para la cohorte /de grado intermedio bajo (LG), sin recurrencia (NR) y la recurrencia y tumores de progresión (R + P) respectivamente. Las barras rellenas representan la proporción de tumores metilados relación con los controles en cada caso. Las diferencias entre las frecuencias de metilación se indican como estadísticamente significativa por '*', donde
p Hotel & lt; 0,05, determinado por la prueba exacta de Chi-cuadrado o de Fisher (dos colas). La metilación se definió como se describe en los materiales y métodos.
Hoxa9
demostró un aumento de la frecuencia de metilación de manera similar en los tumores de recurrencia y progresión en comparación con sus contrapartes no-recurrencia, sin embargo, como se muestra en la figura 1, la frecuencia de metilación en tumores sin recurrencia fue significativamente menor en comparación con la observada en los tumores /de grado intermedio bajo (
p = 0,036
). Aunque la tendencia de un aumento de la frecuencia de metilación en la recidiva y la progresión (en relación con no-recurrencia) tumores fue evidente para todos los genes investigados, esto era claramente más marcada para la
ISL1
gen. En este caso, la frecuencia de metilación fue significativamente mayor en los tumores de recurrencia y progresión relativa a la no-recurrencia (15/25 (60,0%)
vs
2/11 (18,2%),
p =
0,031), y también a sus homólogos en grado medio /bajo (15/25 (60,0%)
vs
2/12 (16,7%),
p = 0,017
) (figura 1) .
la media de los niveles de metilación dentro de bajo /intermedio y alto grado CVNMI
Nuestro análisis de metilación también mostró diferencias considerables en, y entre, la media y la gama de los niveles de metilación dentro de los tumores individuales (Fig 2). Por lo tanto, además de los análisis descritos anteriormente, también se evaluó los niveles de metilación medio dentro de HG y las cohortes /intermedia de bajo grado y dentro de los tumores HG subtipos, para determinar si el nivel de metilación demostrado ninguna relación con algunas características clínicas.
Los paneles (a) a (f), que representan
Hoxa9
,
ISL1
,
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
y
ZNF154
, respectivamente. Cada panel muestra los valores de metilación tumorales individuales, según lo determinado por pirosecuenciación, representado por círculos grises dentro de control (C), bajo /de grado intermedio (LG), sin recurrencia (NR) y la recurrencia y progresión grupos tumorales (R + P). Las barras horizontales continuas representan la media global de metilación dentro de cada grupo de control o tumor; diferencias entre las medias se indican como estadísticamente significativa por '*', donde
p Hotel & lt; 0,05 determinados por pruebas de los estudiantes-t. La flecha de dos puntas representa el punto de corte por encima del cual se definen como tumores metilado en relación con los controles normales de la vejiga.
El nivel medio de metilación fue mayor, aunque no de forma significativa, en relación con su HG homólogos de baja /intermedia de grado para el
ISL1
,
SPAG6
,
NKX6-2
,
y ZNF154
genes (Tabla 2). Este aumento se acercó importancia para
ISL1 gratis (22,1% vs 36,5%,
p = 0,061
). Paradójicamente, el nivel medio de la metilación de
Hoxa9
fue menor en HG comparación con sus homólogos de baja /de grado intermedio, de nuevo se acerca importancia (29,3% vs 44,0%,
p = 0,057
) ( la Tabla 2).
con este enfoque, también se determinó los niveles de metilación de genes específicos de tumores dentro de Hg y en relación con sus resultados clínicos. La media de los niveles de metilación dentro de
ISL1
y
Hoxa9
fueron significativamente mayores en los tumores de recurrencia y progresión en comparación con sus contrapartes no-recurrencia (43,3% vs. 20,9%,
p =
0,016 y 34,5% vs. 17,6%,
p
= 0,017, respectivamente) (Fig 2). El aumento de nivel de metilación media desde no-recurrencia hasta la recurrencia y progresión de tumores no fue significativa para
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
y
ZNF154
correlación de metilación en los resultados clínicos de alto grado CVNMI
a continuación se determinó la correlación entre la metilación de genes específicos con los resultados clínicos dentro de la cohorte de tumores HG.;
Hoxa9
y
ISL1
se evaluaron como los únicos genes que demuestran una diferencia significativa en la frecuencia o nivel de metilación.
Hoxa9
la metilación del promotor demostró 72,7% de especificidad y un valor de 84,2% predictivo positivo (VPP) para la recurrencia del tumor y /o progresión dentro de un año del diagnóstico inicial, mientras que la metilación en el
ISL1
promotor demostraron especificidad del 81,8% y VPP 87,5% para los mismos resultados clínicos, que se muestra en la Tabla 3. por otra parte, la metilación concomitante de
Hoxa9
y
ISL1
el momento del diagnóstico inicial predijo un año recurrencia y /o progresión, con un PPV del 91,7%, manteniendo al mismo tiempo una especificidad del 90,9%. Para evaluar con mayor rigor asociación entre estos potenciales biomarcadores y evolución de la enfermedad, se empleó el análisis de regresión logística. La Tabla 3 muestra que cuando se consideran individualmente, la metilación de cualquiera de
Hoxa9
o
ISL1
alcanzó significación estadística con la recurrencia del tumor y /o progresión (
p = 0,050
y
p = 0,047
respectivamente). Sin embargo, en combinación, mientras que los biomarcadores se asociaron significativamente con menos resultado de la enfermedad (
p = 0,067
), que han demostrado una fuerte razón de probabilidad de recurrencia del tumor y /o progresión que cuando cualquiera se consideró por separado (7,86 vs 4,74 y 5,73, respectivamente) guía empresas
Además de comportamiento del tumor que también se considera la metilación del promotor como predictor de la mortalidad específica de la enfermedad:. En este caso,
Hoxa9
la metilación del promotor demostró 57,1% especificidad y un valor predictivo negativo del 70,6% (VPN) para la mortalidad específica de la enfermedad, mientras que
ISL1
metilación sugirió 57,1% y 60,0% para estas medidas de resultado.
cambios en la metilación asociada en la expresión génica en alto grado CVNMI
Quantitative RT-PCR se utilizó para evaluar las asociaciones entre la metilación y la expresión génica en cuatro de los seis genes dentro de un sub-conjunto de 10-14 tumores, en comparación con los controles. Fig 3 muestra que, en relación con los controles, 90,1% (29 de 32) tumores metilados muestran la expresión del transcrito reducida, y 75,0% (24 de 32) muestran una reducción significativamente la expresión. Por el contrario, el 56,3% (9 de 16) tumores metilados muestra los niveles de expresión similares a, o en algunos casos superiores, que se manifiesta en los controles.
Los análisis cuantitativos de RT-PCR de
Hoxa9
,
ISL1
,
SPAG6
y
Versión taquigráfica ZNF154 expresión en tumores de alto grado individuales (HG). La expresión se informó en relación con la media de tres controles normales de vejiga (C, triángulos), donde el valor medio se expresa como igual a 100%. Los símbolos en negro y sin relleno denotan tumores metilados o no metilados, y representan el valor medio de dos experimentos independientes realizados por triplicado. Las barras horizontales dentro de la columna de control representan la media de los controles, una reducción de 3 veces por debajo de esta se encuentra la flecha de dos puntas en cada parcela de genes, lo que representa el punto de corte para reducir significativamente la expresión en tumores en relación con los controles.
Discusión
El paisaje epigenómico de cáncer de vejiga es un área de creciente interés en la investigación [21], específicamente en relación con la identificación de biomarcadores clínicamente viables. Debido a las limitaciones actuales en la predicción de los diversos resultados clínicos observados en HG-CVNMI, y la actual escasez de BCG, biomarcadores que guían las decisiones clínicas son de particular importancia [22,23]. Como se describió anteriormente, nuestro análisis reveló frecuente, y en algunos casos de metilación diferencial, presente en el diagnóstico inicial HG-CVNMI, que parecía correlacionarse con las características del tumor y los parámetros clínicos.
Los seis genes seleccionados para análisis son predominantemente miembros de familias de factores de transcripción, la regulación de la expresión de genes, principalmente, la enzima de unión, y la diferenciación celular [24]. Su selección para análisis fue sobre la base de su metilación apropiado frecuente en el cáncer de vejiga [9,12,13,25]. En informes anteriores,
Hoxa9
y
ZNF154
metilación se ha asociado con la recurrencia del tumor, y
ISL1
metilación con la progresión tumoral en tumores /predominantemente bajos de grado intermedio [9, 13].
Nuestro análisis inicial reveló frecuencias de metilación similares en bajo /intermedio y HG-CVNMI para
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
y
ZNF154
. En estos casos, las frecuencias de metilación fueron similares a los reportados previamente en la literatura [9,12,13,25]. Sin embargo, una diferencia en la frecuencia de metilación fue evidente entre las cohortes de bajo /intermedio y HG-CVNMI para
Hoxa9 Opiniones y
ISL1
genes: aunque la frecuencia de metilación del
Hoxa9
promotor en tumores /intermedia de bajo grado fue similar a la descrita previamente en la literatura [12,13], se encontró a una frecuencia notablemente menor en HG-CVNMI. Por el contrario, para
ISL1
, la frecuencia de metilación en tumores /intermedia de bajo grado fue menor que el descrito anteriormente por otros [13]; Sin embargo, el aumento de la frecuencia de metilación que es evidente en los tumores de recurrencia y progresión es más consistente con estos informes.
La frecuencia de metilación diferencial en
Hoxa9
y
ISL1
puede relacionarse a varios factores de confusión, incluyendo el método en este estudio empleado para definir la metilación del tumor, y los relativamente pocos tumores de bajo /intermedio de grado para los análisis. Sin embargo, la concordancia entre los datos de metilación y los reportados por otros para
NKX6-2
,
SPAG6
,
ZIC1
y
ZNF154
, confirma la robustez de nuestro enfoque. Sobre esta base, razonó que las diferencias en la frecuencia de metilación observados por
Hoxa9
y
ISL1
puede ser como consecuencia de diferentes características y /o los resultados clínicos dentro de nuestra cohorte de tumores HG; un fenómeno descrito de manera similar en, por ejemplo, tumores, de mama, de colon y de la pituitaria [4,26,27]. Por lo tanto, hemos realizado análisis de HG-CVNMI subtipo y se encontró que los perfiles de metilación de los tumores de recurrencia y progresión, aunque similares entre sí, eran en su mayoría muy distinto de sus contrapartes no-recurrencia; sobre esta base, se agruparon los tumores de recurrencia y progresión de análisis
La frecuencia de metilación en tumores de recurrencia y progresión fue consistentemente mayor en los seis genes en comparación con sus contrapartes no-recurrencia.; estas diferencias fueron más pronunciadas para
Hoxa9
y
ISL1 Opiniones y alcanzado significación estadística para
ISL1
. Paradójicamente, en
Hoxa9
, sin recidiva, recurrencia y progresión de tumores eran menos frecuentemente metilado que en sus contrapartes tumorales /intermedia de bajo grado. Aunque las razones de esto no están claras, posibles explicaciones pueden referirse al número, o heterogeneidad de los tumores investigados, aunque no podemos descartar la posibilidad de que haya diferencias epigenéticas en los genes particulares entre los tumores de bajo /intermedio y alto grado. Por el contrario, la frecuencia de metilación en tumores de recurrencia y progresión en
ISL1
fue notablemente mayor que en sus contrapartes /intermedia de bajo grado. explicaciones similares a las descritas para
Hoxa9
podría explicar estas observaciones.
A través de los análisis de Pyrosequence cuantitativa, se determinó la metilación del medio a través de múltiples sitios CpG que muestra que, además de las diferencias de frecuencia de metilación, existían enormes diferencias en los niveles de metilación entre las cohortes tumorales para genes particulares. En concreto, las diferencias en los niveles medios de metilación entre bajo /intermedio y tumores HG, y también entre la no repetición, y sus homólogos de recurrencia y progresión de tumores, de forma análoga a las observaciones reportados por otros en subtipos de mama y de cáncer de colon [26,27 ]. Por tanto
Hoxa9
y
ISL1
, se produjo un aumento significativo en el nivel medio de metilación en los tumores de recurrencia y progresión en comparación con sus contrapartes no-recurrencia.
La las diferencias observadas en la frecuencia de metilación y significan nivel de metilación entre estos subgrupos clínicamente divergentes, sugiere que la frecuencia y /o el nivel medio de metilación aumenta con la agresividad del tumor. tendencias similares han sido reportados en otros tipos de tumores [26,27] y esto se cree que representa la acumulación de aberraciones epigenéticas en el tiempo, de forma similar a la acumulación de mutaciones genéticas y la inestabilidad genómica aparentes durante la progresión del tumor [28].
Desde nuestros hallazgos apoyan las asociaciones anteriores de
Hoxa9
y
ISL1
metilación con características y comportamiento [9,13] tumorales, se aprecia posibles correlatos clínicos de
Hoxa9
y
ISL1
metilación, incluyendo su potencial pronóstico. En nuestra cohorte HG-CVNMI,
Hoxa9
o
ISL1
metilación en el diagnóstico inicial predijo de forma adecuada la recurrencia del tumor o la progresión dentro de un año. En este contexto, la metilación simultánea de ambos
Hoxa9
y
ISL1
mejoró el valor predictivo positivo de 91,7%, que se compara favorablemente con otros biomarcadores postulados de la enfermedad recurrente /progresiva en CVNMI [13,29] . Por otra parte, la regresión logística parecía confirmar que estos resultados no eran consiguiente a la metilación en un solo gen. Por otra parte, y como se describe anteriormente [9,13], la metilación concurrente en
Hoxa9
y
ISL1
se asoció con DSM y reduce la supervivencia global, sin embargo, esto no alcanzó significación estadística. En este contexto, reconocemos que el número de tumores disponibles para la investigación y en la ausencia de informes similares, que las asociaciones que reportamos entre la metilación inapropiada y evolución de la enfermedad HG-CVNMI requerirán validación en las cohortes de tumores más grandes e independientes.
Por último, para revelar el potencial relevancia funcional de metilación dentro enfermedad de alto grado, se evaluó la relación entre la metilación y la expresión génica; a través de los cuatro genes estudiados, encontramos una asociación de metilación anormal con la expresión del transcrito reducida, consistente con los hallazgos de otros grupos [9,13]. Estos resultados no fueron significativos, posiblemente relacionada con el número de tumores estudiados, o el fenómeno pasajero /conductor, con lo que las marcas epigenéticas pueden estar presentes, pero no causante de la expresión de genes alterados [30].
Estos resultados son los primeros en similitudes y diferencias del informe de la metilación de genes asociados de HG-CVNMI relativa a tumores /intermedia de bajo grado. Además, hemos demostrado que los patrones de metilación específicos momento del diagnóstico inicial predicen un año los resultados clínicos HG-CVNMI, señalando el potencial excitante para la metilación como un biomarcador de pronóstico en esta enfermedad clínicamente impredecible. Se requieren más investigaciones que explotan los análisis de la matriz de todo el genoma para caracterizar mejor las similitudes epigenéticos y las diferencias entre el bajo /HG-CVNMI intermedia y, y para revelar biomarcadores que pueden servir como dianas terapéuticas o la guía de manejo clínico, tales como el calendario, la dosis y la duración una terapia con BCG, o el momento de la cistectomía.
Apoyo a la Información sobre Table S1. . Mesa imprimación List de cebadores de PCR de bisulfito-convertidos, Pyrosequencing cebadores de secuenciación (), y RT-qPCR primers
doi:. 10.1371 /journal.pone.0137003.s001 gratis (DOCX)
S2 Mesa. información de la isla CpG sobre Table los lugares de localización genómica de las regiones promotoras de la isla CpG asociada evaluados para cada uno de los seis genes
doi:.. 10.1371 /journal.pone.0137003.s002 gratis (DOCX)
S3 Tabla. . Archivo de datos brutos
hoja de cálculo de Excel que contiene los valores medios de los datos Pyrosequencing y RT-qPCR
doi:. 10.1371 /journal.pone.0137003.s003 gratis (XLSX)
S1 texto. . Los materiales suplementarios y métodos
más descripción de las muestras de tejidos primarios, y una descripción más detallada de la extracción de ADN, de bisulfito de sodio-conversión, pirosecuenciación, extracción de RNA y RT-qPCR procedimientos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0137003. S004 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a todos los urólogos Consultor West Midlands y sus unidades involucradas con BCPP, así como las enfermeras de investigación BCPP y Margaret Grant, Deborah pájaro, Jennifer Barnwell, Duncan Nekeman y Eline van Roekel.