Extracto
Wnt7a es conocido por ser un supresor tumoral que se pierde en el CPNM, pero no existe un mecanismo de pérdida Ha sido establecido. La metilación de regiones promotoras se ha establecido como un mecanismo común de pérdida de la expresión supresor de tumor en NSCLC. Hemos demostrado anteriormente que la pérdida de Wnt7a en líneas de células epiteliales de pulmón no transformadas llevado a un aumento del crecimiento celular, alteración del crecimiento del cultivo 3-D, y el aumento de la migración. La
Wnt7a
promotor tiene un mayor porcentaje de metilación en el tejido tumoral NSCLC comparación con el tejido de pulmón normal correspondiente y la metilación de la región promotora conduce a disminución de la actividad. Se han tratado las líneas celulares H157 y H1299 con CPNM con 5-Aza-2'- desoxicitidina y detecta la pérdida de
Wnt7a
metilación del promotor, incremento en la expresión Wnt7a, y aumento de la actividad de la vía de señalización Wnt7a pulmón. Cuando la expresión DNMT1 fue derribado por shRNA, expresión de Wnt7a aumenta y disminuye la metilación. En conjunto, estos datos sugieren que en NSCLC, Wnt7a se pierde por la metilación en un subconjunto de tumores y que esta metilación es mantenido por DNMT1. Restauración de expresión Wnt7a través de desmetilación podría ser un enfoque terapéutico importante en el tratamiento del NSCLC
Visto:. Tenis MA, VanScoyk MM, Wilson LA, Kelley N, Winn RA (2012) La metilación de
Wnt7a
es modulada por DNMT1 humo del cigarrillo y condensado en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (3): e32921. doi: 10.1371 /journal.pone.0032921
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Agosto, 2011; Aceptado: 6 Febrero 2012; Publicado: 5 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Tenis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por un premio NIH R21 (CA153268-01). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer, con mínimas opciones disponibles para el tratamiento de los tumores diagnosticados por lo general en las etapas finales. Estamos interesados en la función de señalización de Wnt no canónica en el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), específicamente las actividades de supresión tumoral de Wnt7a y su receptor Frizzled 9 (Fzd9). Wnt7a es altamente expresado en el pulmón embrionario y sirve para mantener un fenotipo epitelial normal en el adulto de pulmón [1], [2]. Estudios anteriores han demostrado que Wnt7a frecuencia se pierde en NSCLC y que la restauración de la expresión Wnt7a conduce a la disminución transformado crecimiento en líneas celulares de NSCLC [2]. células de NSCLC con la reexpresión de Wnt7a han disminuido la proliferación, la disminución del crecimiento de anclaje independiente, y la restauración de un fenotipo epitelial [2]. Wnt7a se encuentra en el cromosoma 3p25, lo que es un "punto caliente" para su eliminación, sin embargo, sospechamos que la expresión Wnt7a en CPNM puede ser regulada por un mecanismo epigenético [3].
La metilación de los promotores del gen supresor de tumores en NSCLC se ha informado en más de 40 genes, algunos con frecuencias tan altas como 100% [4]. La pérdida de expresión de genes, tales como p16 /INK4a por metilación temprano en el desarrollo de NSCLC se ha propuesto como un biomarcador para la detección temprana [5]. La metilación de genes tales como FHIT se han correlacionado con la estadificación del tumor y el pronóstico en [6] NSCLC. Las diferencias en la metilación asociada con la histología del tumor se han identificado los genes, tales como RASSF1A y p16 /INK4a [7], [8]. Las asociaciones entre la exposición al humo del cigarrillo y la metilación aberrante se han observado para p16, RASSF1A, y RARβ2 entre otros [9], [10], [11]. Un vínculo entre la exposición a los carcinógenos del tabaco y la metilación puede existir a través de metiltransferasas de ADN (Dnmt) que son activados por estos carcinógenos. Si los objetivos de DNMTs responsables de la reparación del ADN convertido inapropiada inactivados por metilación, las lesiones resultantes de los carcinógenos pueden persistir, lo que conduce a la tumorigénesis [12].
Como la mayoría de Wnt y los estudios relacionados con la proteína Wnt en cáncer están relacionados con la señalización canónica , la identificación de la metilación Wnt-específico no es común. La metilación se sabe que es un mecanismo de pérdida para otros supresores de tumor en NSCLC, pero la mayoría de los estudios de Wnt metilación en los antagonistas de Wnt objetivo de pulmón en la vía canónica de señalización Wnt. Unos pocos estudios han identificado hipermetilación de Wnt5a y Wnt9a en los cánceres epiteliales y la hipermetilación de Wnt7a se ha observado en un subgrupo de cáncer pancreático ductal [13], [14], [15], [16]. En el presente estudio, hemos demostrado que la pérdida de Wnt7a es un evento significativo para las células epiteliales del pulmón y que esta pérdida es causada por la metilación mediante la actividad DNMT1 en un subconjunto de NSCLC.
Resultados
la pérdida de expresión Wnt7a en las células pulmonares conduce a un fenotipo transformado
Hemos demostrado anteriormente que la expresión Wnt7a altera las características de las células transformadas con CPNM. células de NSCLC con Wnt7a reintroducido han disminuido la proliferación, la disminución del crecimiento de anclaje independiente, y la restauración de un fenotipo epitelial. Lo contrario, la pérdida de Wnt7a partir de una célula no transformada epitelial, se espera que resulte en un aumento de las características de las células transformadas. En este estudio, hemos utilizado un enfoque shRNA para derribar la expresión del ARNm de Wnt7a en dos líneas de células epiteliales de pulmón no transformadas, HBEC y Beas2B (B2B), y se confirmó derribar por QPCR y Western Blot (Fig. 1A). Disminución de la expresión Wnt7a provocado un aumento de la proliferación celular en células B2B, demostrado por un ensayo de crecimiento celular de 6 días (Fig. 1B). la proliferación de células HBEC también se incrementó con la pérdida de Wnt7a como se mide por el ensayo de MTS (datos no mostrados). En las células B2B, se observó el crecimiento alterado en el cultivo Matrigel 3D a los 5 días con pérdida de expresión Wnt7a (Fig. 1C). se observó aumento de la migración de células en un ensayo de cero a 24 horas con la pérdida de expresión Wnt7a, donde las flechas indican los bordes de la cero introducido (Fig. 1C)
.
A) Expresión de Wnt7a se midió por QPCR en HBEC y células B2B después de la transfección estable con Wnt7a shRNA o un shRNA negativo. Los datos se presentan como factor de cambio en la expresión Wnt7a normalizado a GAPDH. Las barras de error son el SE de tres experimentos. Wnt7a tumbar también fue confirmada por Western blot con un control de carga β-actina. B) La proliferación celular se midió en las células que expresan B2B Wnt7a ARNhc shRNA o una negativa. Las células se analizaron en un ensayo de crecimiento de 6-día. células C) B2B con Wnt7a shRNA fueron analizados en un ensayo de cultivo 3D utilizando Matrigel y se observaron después de 5 días de crecimiento para cambios en la morfología en comparación con un control negativo shRNA. células B2B con Wnt7a shRNA también se analizaron en un ensayo de migración de cero y se observaron a las 24 horas para el movimiento en el cero introducido en comparación con un control negativo shRNA. Las flechas indican los bordes del cero. Imágenes representan tres experimentos.
Wnt7a está metilado en líneas celulares de cáncer y tejidos humanos
La cuestión de cómo la expresión Wnt7a se pierde podrían tratarse de varias maneras.
Wnt7a
podría suprimirse, mutado, o metilado, entre otros mecanismos. Mientras que el cromosoma que contiene
Wnt7a gratis (3p25) se elimina con frecuencia en el CPNM, este mecanismo de pérdida, junto con la mutación genética, actualmente ofrece poco en el camino de la intervención terapéutica [17]. La presencia del mecanismo epigenético de metilación ofrecería la posibilidad de utilizar las intervenciones clínicas actuales para el tratamiento de NSCLC. Se han tratado HBEC y células B2B con carcinógeno tabaco NNK, que se sabe que conducir a la acumulación de DNMT1 y el aumento de hipermetilación supresor tumoral en NSCLC [18]. En las células tratadas se observó una disminución en la expresión de mRNA Wnt7a por QPCR en comparación con las células no tratadas (Fig. 2A). El análisis de metilación demostró que el promotor Wnt7a en células B2B y HBEC ha aumentado metilación después de la exposición a 10 uM NNK (Figura 2A). Esto sugirió que
Wnt7a
está metilado con la exposición al tabaco y puede haber un mecanismo de pérdida en el CPNM asociadas al tabaco. Con el fin de determinar si la metilación de
Wnt7a
estaba presente en el tejido tumoral de pulmón humano, que mide la metilación de una isla CpG en el promotor en 82 pares de tejido tumoral de pulmón humano y el tejido de pulmón normal correspondiente. Porcentaje medio de metilación de los 13 sitios CpG medidos fue significativamente mayor en el tejido tumoral en comparación con el tejido normal cuando se analiza por una prueba t pareada (Fig. 2B). Tabla S1 muestra el porcentaje de metilación en cada sitio CpG analizado y comparado entre el tumor y los tejidos normales. No solo sitio CpG analizado puede ser identificado como críticos para la inactivación de la
Wnt7a
promotor, sin embargo, parece que hay una tendencia hacia el aumento de la metilación en los tumores en los sitios de CpG más cerca del sitio de inicio de la transcripción. Dos líneas celulares de células de NSCLC, H157 y H1299, fueron identificados como refugio a
Wnt7a
la metilación del promotor por pirosecuenciación y se usaron para posteriores experimentos in vitro (Fig. 2B). Estos datos sugieren que la pérdida de expresión Wnt7a por metilación se produce en un subconjunto de NSCLC.
) células B2B y HBEC A se trataron con 10 uM NNK durante 2 horas y la expresión Wnt7a se midió por QPCR en comparación con un control no tratado . Las barras de error son los SEM de los experimentos por triplicado. Porcentaje de metilación en B2B y las células HBEC se analizó utilizando el sistema de perfiles de metilo después de 2 h 10 uM tratamiento NNK en comparación con las células no tratadas. B) porcentaje medio de la metilación del promotor Wnt7a se midió mediante pirosecuenciación en el tejido NSCLC y se compara con el tejido pulmonar normal adyacente emparejado por la prueba t pareada. Porcentaje medio de metilación de B2B, las líneas celulares H157 y H1299 se midió mediante pirosecuenciación. C) Un promotor Wnt7a luciferasa fue modificada por enzimas metiladoras SSS I, HpaII, y HhaI y transfectadas transitoriamente en las líneas celulares B2B y HBEC. Se midió la tapa de cambio en la actividad luciferasa en comparación con la actividad de luciferasa promotor Wnt7a sin modificar. Las barras de error son el SE de tres experimentos.
El promotor Wnt7a desactivado por metilación se restaura con 5-aza-2 de tratamiento desoxicitidina '
A medida que la metilación de
Wnt7a
no se había estudiado previamente, hemos querido verificar que la metilación de la región promotora daría lugar a la inactivación del promotor. Un
Wnt7a
promotor de luciferasa se trató con SSS I, HpaII, y metilasas HhaI para determinar el efecto de la metilación en el
Wnt7a
región promotora. SSS I afecta a todos los sitios CpG, HpaII sólo el CpG dentro "CCGG 5, y sólo el HhaI CpG dentro 5'GCGC. La transfección de la
Wnt7a
promotor de luciferasa en B2B y líneas celulares HBEC demostraron disminución de la actividad de la luciferasa después del tratamiento con los tres metilasas en comparación con una no tratada
Wnt7a
promotor de luciferasa, lo que indica que incluso la metilación limitada inactiva el
Wnt7a
promotor (Fig. 2C). Habíamos identificado dos líneas celulares de cáncer con la metilación del
Wnt7a
región promotora, H157 y H1299, y querían determinar el efecto del tratamiento con un agente de desmetilación, desoxicitidina 5-aza-2 '(5 Aza). Las células se trataron con 6 uM 5 Aza durante 1-4 horas y la expresión de Wnt7a se midió por QPCR y Western blot. La exposición a 5 Aza condujo a una mayor expresión de Wnt7a ARNm y proteínas (Fig. 3A y B). Como era de esperar, 5 Aza también condujo a una disminución de la metilación del
Wnt7a
región promotora (Fig. 3D). Wnt7a se sabe que la señal a través de su receptor Fzd9 a diana aguas abajo de PPAR, por lo que las células tratadas con H157 y H1299 con 5 Aza, junto con la transfección transitoria de Fzd9, y se analizó la actividad de la vía de señalización Wnt7a [19]. El PPAR elemento de respuesta de luciferasa (PPRE), que se activa por PAPRγ, demostró una mayor actividad después de células con metilado
Wnt7a
fueron expuestos a 5 Aza y expresión de Fzd9 (Fig. 3C). Estos datos indican que el tratamiento farmacéutico de células de NSCLC puede invertir el estado metilado de la
Wnt7a
promotor.
A) 157 y 1299 células fueron tratadas con 5 Aza durante 2 horas y se midió por Wnt7a QPCR comparación con los controles no tratados. Las barras de error son los SEM de los experimentos por triplicado. B) 157 y 1299 células fueron tratadas con 5 Aza para 1, 2, y 4 horas y se compararon con células no tratadas. expresión de la proteína Wnt7a se midió por inmunotransferencia con β-actina como control de carga. C) 157 y 1299 células fueron transfectadas transitoriamente con Fzd9 y luciferasa PPRE y 48 horas después se trataron con 5 Aza durante 2 horas. La actividad de luciferasa se midió y las células tratadas se compararon con un control de vacío. Las barras de error son el SE de tres experimentos. D) 1299 células fueron tratadas con 5 Aza durante 2 horas y el porcentaje de metilación del promotor Wnt7a se midió por el sistema de metilo-Profiler. Las células tratadas se compararon con un control no tratado. barra de error es el SE de tres experimentos.
Wnt7a la metilación del promotor es modulada por DNMT1
metiltransferasas de ADN (Dnmt) modular la metilación del ADN y su sobreexpresión se ha relacionado con el cáncer de pulmón [4 ]. DNMT1 se sabe que se acumulan en el núcleo de células de NSCLC en respuesta a la exposición al carcinógeno NNK tabaco; se encontró que la exposición a NNK disminución de la expresión de mRNA Wnt7a medida por QPCR (Fig. 2A) [18]. Cuando derribaron expresión de DNMT1 en líneas celulares metilado WNT7A H157 y H1299 usando shRNA, expresión de DNMT1 disminuyó y la expresión de Wnt7a aumenta correspondientemente por QPCR (Fig. 4A). Disminución de la expresión de la proteína DNMT1 y aumento de la expresión Wnt7a también se observó en células H1299 (Fig. 4A). Como era de esperar, la metilación de Wnt7a en el DNMT1 derribar las células H1299 disminuyeron cuando se mide por pirosecuenciación (Fig. 4B). Al igual que en un estudio realizado por Kassis et al. disminución de la proliferación que se encuentran con RNAi agotamiento de DNMT1, se observó una disminución en la clonogenicidad en células H1299 con derribo de DNMT1 comparación con transfecciones vacías y negativos shRNA (Fig. 4C). También se observó un retorno a la clonogenicidad de la transfección vacío con la adición de Wnt7a shRNA a las células DNMT1 shRNA tratados. Esta disminución de la clonogenicidad observada con tratamiento imita DNMT1 shRNA disminuye en la proliferación observada con la restauración de la expresión Wnt7a en estudios anteriores [2]. Esto, combinado con el aumento de la clonogenicidad observado con la adición de Wnt7a shRNA, sugiere que la pérdida de expresión Wnt7a podría ser en parte responsable de los efectos negativos asociados con la sobreexpresión DNMT1 en NSCLC [20]. Derribar de DNMT3a o 3b en las células H1299 no resultar en el aumento de expresión Wnt7a, lo que sugiere que es el responsable de DNMT1
de novo
y la metilación de mantenimiento de la
Wnt7a
promotor (Figura S1).
a) 1299 células fueron transfectadas transitoriamente con DNMT1 shRNA y se compara con células de control transfectadas negativos vacíos y shRNA. DNMT1 y expresión Wnt7a mRNA se midió por QPCR y presentados como factor de cambio en comparación con el control vacío. Las barras de error son el SE de tres experimentos. DNMT1 shRNA y un control negativo shRNA fueron transfectadas de forma estable en las células 1299 y DNMT1 y proteína Wnt7a se midieron por immnoblot con un control de carga β-actina. B) Se analizaron 1299 células transfectadas transitoriamente para Wnt7a metilación del promotor mediante pirosecuenciación. DNMT1 shRNA y un control de las células transfectadas shRNA negativos se compararon con las celdas vacías. Las barras de error son el SE de tres experimentos. C) 1299 células con transitoria DNMT1 shRNA y /o expresión Wnt7a shRNA se compararon con un control de vacío y el control negativo shRNA en un ensayo de clonogenicidad. Las células se tiñeron después de 4 días de crecimiento, se fotografiaron y se contaron para la eficiencia de la clonación. Las barras de error son el SE de experimentos por duplicado.
exposición Humo del cigarrillo condensado conduce a la metilación del promotor Wnt7a
La metilación se ha demostrado ser aumentado con la exposición a los carcinógenos del tabaco, así que estábamos interesados en el efecto de condensado de humo de cigarrillo (CSC) en la metilación del
Wnt7a
promotor [20]. Hemos crecido las líneas de células no transformadas HBEC y B2B en 1% de medio CSC durante 12 semanas y después se extrajo RNA, DNA y proteínas. análisis QPCR encontrado disminución de la expresión de Wnt7a en ambas líneas celulares después de 12 semanas de exposición a la CSC (Fig. 5A). Aumento de la expresión de la proteína DNMT1 se confirmó en células B2B con exposición CSC (Fig. 5B). Como era de esperar, el aumento de la metilación de la
Wnt7a
región promotora se identificaron también en ambas líneas celulares (Fig. 5C). La exposición del epitelio pulmonar a los carcinógenos en el humo del cigarrillo está asociado con un aumento de la metilación y la disminución en la expresión subsiguiente de Wnt7a.
A) las células HBEC y B2B fueron tratados con 1% de CSC en medio de cultivo celular durante 12 semanas y Wnt7a expresión se midió por QPCR. Las barras de error son el SE de tres experimentos. B) Expresión de DNMT1 se midió por transferencia de western en células B2B tratados con 1% CSC durante 12 semanas. Control de carga es β-actina. C) HBEC y células B2B tratados con 1% de CSC se analizaron 12 semanas para el promotor Wnt7a metilación en comparación con los controles no tratados utilizando el sistema de Metil-Profiler. Las barras de error son el SE de tres experimentos.
Discusión
Los datos de este estudio apoyan el papel de Wnt7a como un supresor de tumores en las células epiteliales del pulmón y destacar el papel de Wnt7a en el mantenimiento de un fenotipo epitelial en el tejido pulmonar adulto. Wnt7a parece ser única en la literatura hasta la fecha, ya que ningún otro Wnt se ha identificado en NSCLC como un supresor de tumores o como relevantes para el mantenimiento de un fenotipo epitelial de pulmón. Wnt5a se conoce para antagonizar la señalización de β-catenina en cáncer de esófago, pero en NSCLC expresión de Wnt5a parece aumentar la proliferación [13], [21], [22]. El efecto significativamente adverso de la pérdida de Wnt7a en las células epiteliales del pulmón motivado nuestra determinación de un mecanismo de pérdida. También es importante el potencial para hacer frente a las estrategias terapéuticas que emplean reexpresión de Wnt7a
.
pérdida frecuente de Wnt7a en el CPNM se ha descrito anteriormente y en el presente estudio, hemos presentado datos que apoyan la importancia de la expresión de Wnt7a al pulmón epitelio [2]. Cuando la expresión Wnt7a se pierde a partir de líneas no transformadas de células epiteliales de pulmón, las células adquieren características de células transformadas y comienzan a parecerse más líneas celulares de NSCLC en la tasa de proliferación, crecimiento del cultivo 3D, y la migración. Si esta pérdida de Wnt7a fuera a ocurrir en un paciente humano en combinación con una mayor actividad de los oncogenes, los efectos podrían llevar al desarrollo de un tumor de pulmón que ha sufrido EMT, que está asociada con un peor pronóstico [23].
DNMT1 se cree que es responsable del mantenimiento de los patrones de metilación y su elevada expresión ha sido identificado como un factor pronóstico en CPNM progresión [24]. Hemos encontrado que cuando se reduce la expresión DNMT1, Wnt7a metilación se reduce y aumenta la expresión. También hemos demostrado que Wnt7a es responsable de una parte de la disminución del crecimiento celular observada con la pérdida de DNMT1. Típicamente, un DNMT adicional está involucrado en específica de novo gen promotor de la metilación, mientras que DNMT1 mantiene esta metilación. Sin embargo, estudios recientes han informado de que también tiene DNMT1
de novo metiltransferasa actividad Hoteles en regiones CpG [12]. Nuestro hallazgo de que la pérdida de DNMT3a o expresión 3b no da lugar a una mayor expresión en células H1299 Wnt7a sugiere que DNMT1 puede ser el único responsable de DNMT la metilación del promotor de Wnt7a. Si es así, esto puede hacer que la desmetilación terapéutico de
Wnt7a
través de la reducción de la actividad DNMT menos complicado ya que sólo una DNMT tendría que ser dirigido y supervisado.
La exposición a los carcinógenos del tabaco in vitro e in vivo se ha asociado con cambios en la actividad DNMT y alteraciones epigenéticas [11], [18], [25], [26]. En nuestro estudio, el tratamiento de células epiteliales no transformadas de pulmón con CSC condujo a un aumento de la metilación de Wnt7a y una disminución correspondiente en la expresión. Un estudio previo por Liu et al. encontrado disminución de la expresión Wnt7a por matriz después de la exposición CSC [11]. Varios estudios han demostrado la expresión de proteínas DNMT1 aumento o la acumulación y el aumento de la metilación de genes específicos después de la exposición a agentes carcinógenos del tabaco [18], [25], [26]. La pérdida de expresión Wnt7a ha sido identificado como un evento frecuente en el CPNM, pero este estudio es el primero en sugerir un mecanismo de pérdida y para demostrar que los carcinógenos del tabaco pueden influir en esta pérdida [2].
Wnt7a juega un importante papel en el mantenimiento de un fenotipo epitelial normal en el tejido pulmonar. Como tal, la pérdida de Wnt7a podría tener un impacto importante en el desarrollo de cáncer de pulmón, especialmente cuando se combina con la regulación al alza de un oncogén influyente. Este estudio investiga la importante cuestión de cómo Wnt7a expresión se pierde y cómo su expresión se puede restaurar en un esfuerzo para tratar el cáncer de pulmón. Restauración de expresión Wnt7a también puede tener aplicación potencial en otros cánceres epiteliales o enfermedades pulmonares. restauración terapéutico de Wnt7a señalización en el CPNM se podría lograr con agentes que ya están en uso clínico, incluyendo agentes demethylating y el análogo de la prostaciclina iloprost, que recientemente hemos identificado como un activador de la Wnt7a vía [27] señalización. Además se trabajará para establecer el momento de la pérdida Wnt7a y el potencial de efectos in vivo del tratamiento para
Wnt7a
metilación. Los datos de este estudio presentan un paso significativo y no descrita previamente para el desarrollo de estrategias terapéuticas para el NSCLC WNT7A.
Métodos
Cultura célula, tejido humano, y Reactivos
NSCLC y líneas celulares Beas2B se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C en una atmósfera humidificada 5% de CO
2 incubadora. La línea celular HBEC (células epiteliales bronquiales humanas) se cultivó en epitelial bronquial basal de medios a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 incubadora. Las líneas celulares se obtuvieron a partir de ATCC (www.atcc.org), a excepción de la línea celular HBEC, que se obtuvo en el año 2009 por el Dr. Robert Doebele en la Universidad de Colorado en Denver [28]. Morfología de todas las líneas de células se monitorizó dos veces por semana y los stocks de líneas celulares fueron a pases no más de diez veces para su uso en experimentos. ARN y ADN de 82 pares de tejido pulmonar humano y el tejido de pulmón normal adyacente se obtuvieron de la Universidad de Colorado Cancer Center SPORE en cáncer de pulmón de Patología Core. NNK (Sigma) se aplicó en 10 uM durante 2 horas en medio de crecimiento celular. Las células fueron tratadas con 5-aza-2 'desoxicitidina (5 Aza) (Sigma) en 6 uM en los medios de crecimiento de las células durante 1-4 horas, dependiendo del ensayo. condensado de humo de cigarrillo (CSC) (Murty Pharmaceuticals) se aplicó a una concentración constante del 1% en el medio de cultivo celular de las 12 semanas.
desmontables estudios, la proliferación, la cultura 3D, y el ensayo cero
expresión Wnt7a fue derribado de forma estable en HBEC y líneas celulares B2B utilizando un sistema de ARNhc lentiviral de Applied abiertas con la selección de puromicina. Dnmt expresión fue derribado usando Sure-silenciamiento de shRNA SABiosciences con la selección de higromicina para la expresión estable. golpe hacia abajo transitoria de Wnt7a se logró con un sistema de shRNA retroviral Abiertas Biosystems. El análisis se llevó a cabo la proliferación de células B2B utilizando un recuento de células de 6 días, en el mismo número de células se colocan en seis pozos y uno bien se cuenta cada día. En las células HBEC, se utilizó el ensayo de valoración acuoso celular (Promega) y se analizaron las células cada 24 horas durante 72 horas. En 1299 células, se utilizó un ensayo de clonogenicidad, donde se sembraron 1000 células en medios de crecimiento normales y se tiñeron con cristal violeta para el crecimiento clon en día 4. Las colonias se fotografiaron y se contaron para la clonación de la eficiencia. La clonación de la eficiencia es el número de colonias dividido por el número de células sembradas. Se establecieron cultivos de membrana basal tridimensional como se describe anteriormente [29]. Brevemente, 5.000 células /pocillo se cultivaron en 2% matrigel (BD Bioscience) con EGF en una capa de base matrigel 50%. Para el ensayo de cero, se cultivaron las células en medio de crecimiento completo hasta 90-100% de confluencia. Un espacio de 3 mm se introdujo a través del diámetro de cada placa. A tiempo cero, las células fueron tratadas con 1 ug /ml de mitomicina para inhibir la proliferación celular. La migración celular se registró a las 24 horas. Las imágenes fueron capturadas usando una lente de 40 × en un microscopio de luz y una cámara digital.
La transfección
El plásmido indicador de luciferasa PPAR elemento de respuesta (PPRE) (3 g), plásmido Fzd9, y Wnt7a -luciferase se transfectaron en las células usando Lipofectamina Reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las células se recogieron, se lavaron con PBS, y se resuspendieron en tampón de lisis informador de luciferasa (Promega). Los datos se presentan como factor de cambio en unidades de luz relativas /miliunidades de β-galactosidasa y representan la media de tres experimentos independientes. Modificación de la luciferasa Wnt7a se llevó a cabo con SssI, HpaII, HhaI y de acuerdo con el protocolo del fabricante (New England Biolabs). La transfección transitoria o estable de DNMT y Wnt7a shRNA se llevó a cabo utilizando Sure-silenciamiento de shRNA SABiosciences o retroviral shRNA desde Abiertas Biosystems y Attractene reactivo de transfección (Qiagen).
PCR cuantitativa
Se extrajo ARN de células con el Kit AllPrep DNA /RNA Mini (Qiagen) y 5 g de ARN se convirtió en ADNc. La PCR se llevó a cabo utilizando SABioscience RT
2 cebadores y mezcla maestra. GAPDH se utilizó para normalizar todas las muestras. Los datos QPCR se presenta como factores de cambio en los niveles de ARNm normalizados en el control vs muestras experimentales y son el promedio de experimentos por triplicado, al menos, con el error estándar que se presentan como barras de error.
El análisis por inmunotransferencia
Células se recogieron y los extractos de proteínas se prepararon utilizando un tampón de quinasa MAP. Las proteínas se detectaron por quimioluminiscencia y el sistema ChemiDoc (BioRad). Los siguientes anticuerpos se utilizaron para la inmunotransferencia: Wnt7a (R & amp; D Systsems), DNMT1 (Abcam) y β-actina (Abcam). β-actina se utilizó como control de carga.
metilación del ADN análisis
ADN fue aislado de las líneas celulares y muestras de tumor utilizando el Kit AllPrep DNA /RNA Mini (Qiagen) y modificado usando el EZ kit de metilación del ADN-Gold (Zymo Research). 1 ug de ADN se utilizó para la pirosecuenciación para
Wnt7a Hoteles en un ensayo diseñado y realizado por Epigendx. Los datos de pirosecuenciación se presenta como porcentaje medio de metilación, que es la media de la metilación por ciento a los 13 sitios CpG dentro de la isla CpG en el promotor Wnt7a. Se utilizó el sistema de metilo-Profiler de SABiosciences para medir Wnt7a metilación en 5-aza y CSC células tratadas. Los datos se presentan como porcentaje de ADN metilado en el promotor Wnt7a.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Expresión de Wnt7a no se incrementa con DNMT3A o desmontables 3B. QPCR se utilizó para medir los niveles de mRNA de DNMT3A o 3B y Wnt7a en células H1299 con desmontables de DNMT3A o 3B. shRNA datos se compara con un control negativo y se presenta como factor de cambio normalizado a GAPDH
doi:. 10.1371 /journal.pone.0032921.s001 gratis (TIF)
Tabla S1.
metilación del tejido del tumor de pulmón humano se analizó utilizando la pirosecuenciación. Cada tumor se analizó a los 13 sitios CpG en el
Wnt7a
promotor. El porcentaje de tumores metilados en más del 0% del ADN se indica en la parte inferior de la mesa para cada sitio. La metilación del tejido pulmonar normal correspondiente a los tejidos tumorales en la Tabla S1 se analizó mediante pirosecuenciación. Cada muestra se analizó a los 13 sitios CpG en el promotor Wnt7a. El porcentaje de muestras con la metilación mayor que 0% se indica en la parte inferior de la mesa para cada sitio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0032921.s002
(PDF)