Extracto
aumenta la terapia anti-VEGF tanto la libre de progresión (SLP) y en general la supervivencia (OS) de los pacientes con cáncer de células renales metástasis (CCRm). Identificación de fenotipos moleculares de RCC podría mejorar la estratificación del riesgo y la predicción de la evolución de la enfermedad clínica. Hemos investigado si los genes específicos de la hipermetilación del ADN puede predecir la SLP y la SG entre los pacientes sometidos a terapia basada en el anti-VEGF. tejidos de tumores primarios de 18 pacientes que recibieron terapia dirigida se examinaron de forma retrospectiva mediante el análisis por PCR específica de metilación cuantitativa de
CST6
,
LAD1
, HSA
MIR
-124-3, y HSA
miR
9-1 islas CpG. SLP y la SG fueron analizadas para determinar de primera línea y secuenciales terapias antiangiogénicas utilizando las estadísticas de log rank. La sensibilidad y la especificidad se determinaron para predecir el fracaso de la terapia de primera línea. Hipermetilación de
CST6
y
LAD1
se asoció tanto con un PFS acortada (log rank p = 0,009 y p = 0,004) y OS (p = 0,011 y p = 0,043). La mediana de la SLP observado para los grupos de alto y bajo de metilación de
CST6
y
LAD1
fue de 2,0 meses vs.11.4.
LAD1
metilación tenían una especificidad de 1,0 (IC 95% 0,65 a 1,0) y una sensibilidad de 0,73 (IC del 95%: 0,43 a 0,90) para la predicción de la terapia de primera línea.
CST6
y
LAD1
metilación son biomarcadores epigenéticos candidatos que muestran asociación sin precedentes con la SLP y la SG, así como la especificidad para la predicción de la respuesta al tratamiento. marcadores de metilación de ADN deben ser considerados para la evaluación prospectiva de grandes cohortes de pacientes en estudios futuros
Visto:. Peters I, Dubrowinskaja N, Abbas M, Seidel C, Kogosov M, Scherer R, et al. (2014) La metilación del ADN Biomarcadores Predecir libre de progresión y la supervivencia global del cáncer de células renales metastásico (CCRm) tratados con terapias antiangiogénicos. PLoS ONE 9 (3): e91440. doi: 10.1371 /journal.pone.0091440
Editor: Zhang Dong, Universidad de Medicina de Nanjing, China
Recibido: 7 Octubre de 2013; Aceptado: 11 Febrero 2014; Publicado: 14 de marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 Peters et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de células renales (CCR) es uno de los más. top diez causas de muerte por cáncer en los países industrializados [1]. A pesar de las recientes mejoras en la terapia dirigida han dado como resultado una supervivencia prolongada de los pacientes con CCR metastásico (CCRm), el resultado global es aún pobre [2], [3].
Debido a las diferentes compuestos disponibles y un número cada vez mayor de nuevos agentes que afectan a las estructuras moleculares específicas, como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y mamíferos objetivo de rapamicina (mTOR) de señalización [4] podría existir una secuencia óptima de terapias dirigidas para los pacientes, lo que podría aumentar la supervivencia con el tratamiento de cáncer renal metastásico. Aunque los modelos de pronóstico, como el MSKCC (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) y anotando Heng sistemas, se han notificado a ser predictores independientes de los resultados clínicos, [5], [6] la discriminación entre los resultados es aún limitada. parámetros con base biológica tumorales específicos se han sugerido para mejorar estas cuestiones [7].
La mayoría de los CRC tener células claras (ccRCC) histología y exhibir la inactivación funcional de la enfermedad de von Hippel-Lindau (
BVS
) de genes debido a mutaciones o silenciamiento epigenético en aproximadamente el 80% de los tumores [8], [9]. Sin embargo, la supervivencia (PFS) libre de progresión y global (SG) de los pacientes con cáncer renal metastásico son independientes de la pérdida de
BVS
función [10]. En contraste, el análisis basado en la sangre de polimorfismos de nucleótido único (SNP) que puedan afectar a los genes diana de sunitinib y ligandos identificados dos polimorfismos en
VEGFR3 que están asociados con la SSP, pero no del sistema operativo, de los pacientes sometidos a terapia [11 dirigidos ]. Medición de los niveles de proteína de suero de la anhidrasa carbónica IX (CA9) en pacientes metastásicos ccRCC reveló disminuyó significativamente OS entre los pacientes con las concentraciones séricas más altas CA9 [12]. Una ventaja de las mediciones individuales tejido o basados en la sangre de pacientes sometidos a terapia es perceptible, pero la precisión, sensibilidad y especificidad de estos métodos aún no han sido reportados o validado [13].
Aunque las grandes cohortes de pacientes han sido objeto de amplia exom-análisis de mutaciones, sólo un número limitado de genes distintos de
BVS Opiniones y polybromo 1 (
PBRM1
) han sido identificados para tener mutaciones en el RCC, y la mayoría con baja frecuencia [14]. Por lo tanto, el número limitado de genes mutados con frecuencia reduce la probabilidad de identificar predictores a base de mutación con sensibilidad y especificidad apropiada. la metilación del ADN de las islas CpG (CGIs) en un número sustancial de los genes supresores tumorales o de regulación ha sido identificado como un sustituto funcional de mutaciones y se ha informado que es un evento frecuente en RCC [15]. Además, la pérdida funcional de
VHL
se ha encontrado para asociar con el aspecto más amplio de alteraciones epigenéticas [16], y todos los segundos-frecuentes mutaciones están relacionados con la estabilización de la cromatina alterado /histona o modificación, mecanismos vinculados a CGI metilación y la expresión génica [17]. Por lo tanto, la detección frecuente de alteraciones epigenéticas en RCC RCC diferencia a la biología del tumor y proporciona a los candidatos para los nuevos marcadores de diagnóstico, pronóstico o predictivos [18]. metilación CGI en varios genes ya ha sido identificado como pronosticadores candidatos independientes de parámetros clínico [19] - [21]. Sin embargo, han, a lo mejor de nuestro conocimiento, no se ha informado de biomarcadores epigenéticos que predicen la evolución clínica de los pacientes mRCC sometido a terapia dirigida,.
La hipótesis de que la metilación del CGI se relaciona con la respuesta al tratamiento, así como la supervivencia de los pacientes sometidos a terapia antiangiogénica mRCC. Se investigaron cuatro genes candidatos, tres de los cuales, la cistatina E /M (
CST6
) y los genes micro ARN
miR-9-1
y
miR-124-3,
fueron identificados recientemente con la hipermetilación CGI específico de tumor y una posible asociación con el pronóstico de los pacientes con CCR [19], [21], [22]. El Ladinin 1 (
LAD1
) gen fue identificado recientemente por nuestro grupo como un nuevo candidato marcador de metilación en el RCC mostrando asociación univariante con los parámetros clínico-patológicos adversos tales como el grado del tumor, metástasis a los ganglios linfáticos, el estado de metástasis distinta y enfermedad avanzada (datos no publicados).
LAD1
codifica una proteína de filamento de anclaje, un componente de la membrana basal que probablemente contribuye a la estabilidad de la interacción epitelio-mesenquimal [23].
el presente estudio investigó si una marca metilación del ADN puede predecir la respuesta de la terapia antiangiogénica seleccionados de pacientes mRCC y describe la identificación de dos marcadores de metilación del ADN en el
CST6
y
LAD1
CGI como predictores candidatos epigenéticos de la SLP y la SG de los pacientes que se someten a terapia dirigida mRCC.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente, y la ética locales comité (Comité de ética; Prof. HD Tröger, Escuela de Medicina de Hannover, Carl-Neuberg-Str. 1, Hannover, Alemania; Study_No: 1213-2011) aprobado específicamente este estudio. Los pacientes estuvieron de acuerdo en una forma escrita para la utilización de la muestra de tejido para la investigación básica. Se obtuvo una declaración escrita de nuestro comité de ética para este estudio.
Características de los pacientes y las pautas de tratamiento
Clinicopathological de datos, los tejidos correspondientes, y los datos de seguimiento, incluyendo la SLP y la SG de los pacientes con cáncer renal metastásico que fueron tratados con la terapia dirigida-VEGF de primera línea fueron recogidos entre noviembre de 2005 y octubre de 2011 en la Clínica de Hematología y el Departamento de Urología y Oncología urológica de la Facultad de Medicina de Hannover (Tabla 1). La puntuación MSKCC o el estado funcional del ECOG no estaban disponibles. Los pacientes recibieron los siguientes regímenes de tratamiento en la primera línea de ajuste: sunitinib (n = 12, 67%), sorafenib (n = 4, 22%), axitinib (n = 1, 5,5%), y bevacizumab (n = 1, 5,5%).
PFS se definió como el tiempo desde el comienzo de la primera día de la terapia sistémica a la detección de un evento progresiva de acuerdo con RECIST 1.1 criterios en una tomografía computarizada (TC) [ ,,,0],24]. OS se define como el período comprendido entre el primer día de la terapia sistémica hasta la muerte del paciente o censurado en el último seguimiento. El término "no evaluable" en la Tabla 1 se describen los pacientes con un PFS & lt; 2 meses debido a una interrupción temprana de la terapia causada por la toxicidad o la muerte temprana antes de la primera CT scan recomendada después de iniciada la terapia. La clasificación inicial TNM de los tumores primarios se evaluó de acuerdo con la Unión Internacional contra el Cáncer 2002 de clasificación [25]. El seguimiento del paciente incluye hasta tres cambios de secuencia en el régimen de terapia.
Los términos'prognostic` y'predictivè se utiliza de acuerdo a la definición por el Instituto Nacional del Cáncer [26].
las muestras de tejidos, el aislamiento y el bisulfito de conversión de ADN tumoral
el control independiente de la histopatología, el contenido de las células tumorales de muestras patológicas de rutina, y la selección de las áreas de tejido para la extracción de tejido se determinaron por el patólogo. Posteriormente, los cilindros de 1,5 mm de longitud y 2 mm de altura se hayan eliminado de los bloques (FFPE) los tejidos fijados en formalina y embebidos en parafina utilizando un sello de Charrière núcleo 18 y se sometieron a aislamiento de ADN. El ADN genómico fue extraído utilizando el sistema automatizado Magna Pure LC 2.0 y Magna kit de aislamiento de ADN Pure LC II - tejido (Roche Diagnostics Deutschland, Roche Ciencias Aplicadas, Mannheim, Alemania). La calidad del ADN extraído se evaluó mediante espectrofotometría, electroforesis en gel, y PCR cuantitativa, que caracteriza el rendimiento, la pureza, y el grado de degradación del ADN aislado. conversión de bisulfito de ADN se llevó a cabo usando el kit de ADN EZ metilación-Gold (Zymo Research Corporation, Irvine CA, EE.UU.) y 1 g de ADN aislado. Totalmente metilados y convertido de ADN, así como controles de ADN de bisulfito-convertido no metilados, se utilizaron como se informó anteriormente [21].
cuantitativo de metilación específicos de análisis en tiempo real PCR
cuantitativa en tiempo real se realizaron PCR (qMSP) ensayos fluorimétrica 'exonucleasa 5 para cuantificar los niveles de metilación de CGI
CST6, LAD1, España HSA
-miR-124-3, España y HSA
miR 9-1
. El análisis de metilación de hsa
-miR-124-3
se llevó a cabo como se describe anteriormente [21]. Se establecieron sistemas qMSP para
CST6, LAD1, España y HSA
miR-9-1
utilizando el software Beacon Designer (PREMIER Biosoft, Palo Alto CA, EE.UU.). Las posiciones de las bases de los sitios investigados para CGI
CST6, LAD1, España HSA
-miR-124-3, España y HSA
miR-9-1 ¿Cuáles son presentados en la Tabla 2. las posiciones de las bases se refieren al Navegador USCS genoma [27]. Los sistemas qMSP se caracterizaron como se describe para la HSA
-miR-124-3 mediciones de metilación
[21]. Duplicados en tiempo real PCR se realizaron en un ABI 7900HT (Life Technologies, Foster City, EE.UU.) en placas de 384 pocillos como se describe anteriormente [21]. Los experimentadores estaban cegados al estado histopatológico y clínico de las muestras. los niveles de metilación relativos se calcularon como un análogo del método ΔΔCt por la normalización de la diferencia en la metilación CGI determinada por la detección en tiempo real y las mediciones de control interno independientes a la diferencia correspondiente en las muestras de control de ADN completamente metilados como se describe anteriormente [21], [28 ].
Análisis estadístico de la supervivencia
se utilizaron gráficos de Kaplan-Meier para presentar la supervivencia relativa en el PFS y análisis OS siguiente dicotomización de los tumores en los fenotipos altos y bajos de metilación. se informó de la mediana de supervivencia y los correspondientes intervalos de confianza del 95% (IC). Las diferencias en la SLP y la SG se sometieron a pruebas estadísticas log-rank y ratios de la mediana de supervivencia calculados.
P-valores
& lt; 0,05 se consideró significativo. Para permitir una comparación con la literatura, se realizaron análisis de regresión de Cox univariante para estimar los cocientes de riesgos instantáneos (CRI). Para calcular la sensibilidad y especificidad para el fracaso de la terapia, se utilizó un valor de corte de la SSP de 6 meses para la dicotomización [29] en los respondedores de terapia y no respondedores.
El mapa de calor y las curvas ROC se construyeron utilizando el heatmap2 y la función ROCR en el paquete R (versión 2.11.0.1) con un algoritmo de agrupamiento por defecto y el paquete gplot [30].
Resultados
distribución bimodal de los niveles de metilación relativos en el CGI de genes candidatos
metilación análisis cuantitativos de la CGI de
CST6
,
LAD1
, HSA
miR-124-3, España y HSA
MIR -9-1
reveló la presencia de una distribución bimodal de los valores de metilación relativos (Figura 1 a y D; datos no mostrados para HSA
miR-124-3 Opiniones y HSA
miR-9 -1
). La aplicación de un único valor de corte de 0,02% (correspondiente a -8.75 en el ln-escala utilizada para gráficos de densidad de Kernel en la Figura 1A y D) para la metilación relativa, alta y baja epigenotypes metilados fueron uniformemente distinguido para todos los genes analizados y utilizados para dicotomización constante en los análisis de supervivencia.
a y D. ISTRIBUCIÓN de los valores relativos de metilación
CST6 gratis (a) y
LAD1 gratis (D) en pacientes mRCC. Un valor de corte se presenta para dicotomización. B y E. de Kaplan-Meier parcelas de la supervivencia libre de progresión de los pacientes mRCC dicotomizadas por alta y baja metilación de
CST6 gratis (B) y
LAD1 gratis (E). parcelas C y F de Kaplan-Meier de la supervivencia global de los pacientes mRCC dicotomizadas por alta y baja metilación de
CST6 gratis (C) y
LAD1 gratis (F).
análisis de la SSP
Kaplan-Meier y análisis de registros rango de SLP en tumores metilados de alta y baja demostraron una diferencia significativa tanto para
CST6
y
LAD1
. Alta metilación se asoció con una supervivencia media de 2,0 meses, en comparación con 11,4 meses entre los pacientes con bajo metilación (p = 0,009 y p = 0,004, Tabla 3A). En cambio, ni
miR-124-3
ni
miR-9-1
demostró una relación estadística con la SLP (p = 0,339 y p = 0,319).
análisis del OS de prueba
Kaplan-Meier y log rank estadísticas revelaron que la metilación de alta
CST6
y
LAD1
se asoció con OS deteriorada. Se obtuvo una mediana de SG de 22,9 y 3,4 meses (p = 0,011, Tabla 3B) para baja y alta
CST6
metilación, respectivamente. Se obtuvo una mediana de SG de 16,4 y 3,4 meses (p = 0,043, Tabla 3B) para baja y alta
LAD1
metilación.
Análisis de Sensibilidad y Especificidad
Para determinar la sensibilidad y la especificidad de
CST6
y
análisis LAD1
metilación para la predicción de fracaso de la terapia de primera línea, los valores de metilación se dicotomizaron en fenotipos bajas y altas de metilación utilizando el mismo valor de corte de 0,02%, como se especifica encima. valores PFS se dicotomizaron utilizando un punto de corte de 6 meses, un parámetro que fue sugerida previamente para distinguir mejor entre los respondedores de terapia y no respondedores [29]. Metilación de alta
LAD1
y
CST6
era una característica de la terapia fallado (Figura 2A). En el caso de
LAD1, España los ocho pacientes con alta metilación eran no respondedores. La especificidad fue (IC del 95% 0,65 a 1,0) 1,0 y la sensibilidad de 0,73 (IC del 95% 0,43 a 0,90) para la detección del fracaso de la terapia utilizando
LAD1
metilación (Tabla 4), mientras que la especificidad fue de 0,86 (95 0,49 hasta 0,97% IC) y la sensibilidad de 0,82 (IC del 95%: 0,52 hasta 0,95) para
CST6
metilación (Tabla 4).
a. mapa de calor de los valores de metilación relativos normalizados (logaritmo natural) detectada en
LAD1
,
CST6
,
miR-9-1, España y
miR-124-3
CGI para cada paciente. Menor a valores altos de metilación se codifican como violeta (bajo) a (altas) tonalidades rojas. Las líneas punteadas y sólidas describen los valores medios e individuales de metilación, respectivamente. El número de pacientes dados de la izquierda corresponden a la numeración se presenta en la Tabla 1. La respuesta de la terapia (0) y el fracaso del tratamiento (1) se indican para cada paciente a la derecha. Cabe destacar que todos los pacientes (n. 1-8) presentan una alta metilación de
LAD1 Opiniones y 9 de 10 pacientes (n. 1-9, 14) presentan una alta metilación (de color rojo) de
CST6
formaban parte de la no respondedor (1) grupo. B. El receptor de características de funcionamiento (ROC) curvas ilustran la discriminación de las mediciones de metilación y el área bajo la curva (AUC) muestra que incluso con nuestra pequeña cohorte de pacientes, un resultado robusto de la exactitud de los dos marcadores de metilación (AUC
CST6
= 0,88 y AUC
LAD1
= 0,90) se puede detectar. La sensibilidad (tasa de verdaderos positivos) se representa frente a 1-especificidad (tasa de falsos positivos).
Discusión
Los resultados clínicos de los pacientes con cáncer renal metastásico han mejorado desde VEGF terapias dirigidas y los inhibidores de mTOR se pusieron a disposición [2], [3]. Sin embargo, la estratificación de los pacientes que utilizan biomarcadores podría permitir una mejor comprensión de la resistencia a fármacos e identificar una secuencia específica del paciente optimizado de las terapias antiangiogénicas, la mejora de la supervivencia individual [7]. Por otra parte, los efectos secundarios de los tratamientos anti-VEGF-basada, como la diarrea, erupción cutánea, síndrome mano-pie, la hipertensión y la astenia, que a menudo perjudican gravemente la calidad de vida durante el tratamiento pueden ser minimizados.
Hemos encontrado que la hipermetilación del ADN de
CST6
y
LAD1 Hoteles en RCC primaria tejido tumoral se asocia significativamente con la PFS de los pacientes que reciben medicación a base de anti-VEGF como terapia de primera línea y también el sistema operativo de los pacientes tratados con fármacos dirigidos secuencialmente anti-VEGF e inhibidores de mTOR en la terapia de segunda y tercera línea. Nuestros marcadores de metilación predijeron el fracaso de la terapia con alta especificidad y una buena sensibilidad.
A lo mejor de nuestro conocimiento, estos hallazgos no tienen precedentes en varios aspectos, ya que estudios previos no estaban basadas tejidos y bien proporcionado ninguna asociación significativa con la respuesta al tratamiento [12] o reportado sólo se limita el poder estadístico [11]. Mientras que las mediciones de los niveles séricos CA9 no revelaron diferencias significativas entre los respondedores de terapia y no respondedores [12], el análisis de variantes genéticas, posiblemente interactuando con la vía de sunitinib, identificaron dos
VEGFR3
SNPs estar asociados con la respuesta al tratamiento y PFS, pero no con OS [11]. Este estudio muestra que las variables biológicas individuales pueden afectar a la respuesta a la terapia. Por otro lado, nuestros predictores candidatos a base de metilación van más allá de la medición de variantes de genes en varios aspectos importantes. En primer lugar, el potencial
LAD1
y
marcadores a base de metilación se midieron en las células tumorales, que exhiben directamente las características del tumor que pueden representar los conductores de la resistencia y de la agresividad biológica CST6
ADN. Hipermetilación de
CST6
y
LAD1
exhibido valor pronóstico y predictivo en nuestro estudio y es un biomarcador putativo para la selección de pacientes. Con base en los resultados clínicos en nuestro estudio, se requerirán diferentes estrategias terapéuticas para tumores hypermethylated. Después de la red de alteraciones epigenéticas y comportamientos biológicos ha sido desenredado, se pueden identificar nuevas dianas terapéuticas adicionales de las intervenciones.
Si la diferencia de tejido- epigenética y las mediciones basadas en sangre genéticos representa para ambos marcadores epigenéticos que se relacionan con la SLP y la SG de los pacientes mRCC es una pregunta interesante. variantes genéticas se asocian únicamente con la SLP, un criterio indirecto de valoración para las mediciones de supervivencia en cáncer renal metastásico que tiene posibles limitaciones [31]. A lo mejor de nuestro conocimiento, un marcador molecular a base de tejidos no ha sido previamente asociado con el sistema operativo. Desde un punto de vista estadístico, nuestro estudio epigenético entregado CRI más altos en los análisis de supervivencia y proporciona una clasificación más equilibrada en respondedores y no respondedores que en el estudio de García-Donas et al. [11], y por lo tanto juntos contribuyen a un poder superior de este estudio. Teniendo en cuenta que una cohorte de pacientes mucho más pequeño estaba disponible para nuestras mediciones, nuestros resultados indican que un fuerte efecto posiblemente ha sido identificado. Por otra parte, teniendo en cuenta que un número cada vez mayor de agentes puede ser utilizado para el tratamiento del cáncer renal metastásico, la identificación futura de un régimen de terapia óptima podría facilitarse mediante marcadores epigenéticos que permiten una buena separación de los pacientes en los respondedores y no respondedores.
Curiosamente, los niveles de metilación de todos los marcadores candidatos claramente decayó en grupos fácilmente distinguibles de alta y baja de metilación, lo que elimina la necesidad de definir arbitrariamente puntos de corte para dicotomización. Por lo tanto, prácticamente solapamiento existente entre los respondedores y no respondedores en el presente estudio. Por lo tanto nuestro
LAD1
y
CST6
análisis de metilación produjo altas especificidades de 1,0 y 0,86 para la detección del fracaso de la terapia, lo que subraya la posible relevancia de estos marcadores en cáncer renal metastásico.
Este estudio también puede responder si los pronosticadores de ADN basada en la metilación representan predictores adecuados de la enfermedad. Tanto
miR-9-1
y
miR-124-3
[21], [22] fallaron como predictores porque no se encontró asociación con el PFS o OS de los pacientes sometidos a terapia. Este hallazgo podría explicarse por el hecho de que los pacientes mRCC generalmente se enfrentan a un mal pronóstico, y muchos tumores presentan una alta metilación para el
miR
genes como se esperaba para los pronosticadores candidatos.
La independencia de clínica o parámetros de laboratorio no se pudo determinar en el presente estudio debido a los bajos números de muestra impidieron el análisis multivariante. En consecuencia, las preguntas pertinentes si los marcadores podrían combinarse para optimizar la capacidad de predicción o si los marcadores exhiben información redundante sólo pueden ser respondidas en futuros estudios mediante el uso de las cohortes del estudio agrandadas.
Sin embargo, los CR observados para los parámetros clínicos para el resultado del paciente fueron más bajos con una precisión limitada potencia /discriminatorio. Nuestros resultados requieren confirmación en un estudio de validación independiente, incluida la consideración de los sistemas de puntuación clínica como factores de confusión.
En conclusión, nuestro estudio identificó
LAD1
y
CST6
CGI metilación como dos marcadores epigenéticos que están asociados con la SLP y la SG de pacientes sometidos a terapia antiangiogénica mRCC. También hemos demostrado el potencial de mejorar la predicción molecular de la respuesta a la terapia. Nuestros resultados subrayan aún más la noción de que existen los CRC epigenetically alterados, y novedosas estrategias específicas pueden ser necesarios para tratar a los pacientes con estos tumores.
Reconocimientos
Agradecemos a Margrit Hepke y Christel Reese para la asistencia técnica.