Extracto
TWIST1 sobreexpresión se observa con frecuencia en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer gástrico (CG). Aunque la metilación del ADN del gen
TWIST1
se ha informado en las células del cáncer, los mecanismos subyacentes de activación transcripcional siguen siendo inciertas. En este estudio, se examinó por primera vez las alteraciones epigenéticas de la
TWIST1
utilizando
TWIST1
líneas de transcripción-positivas y células -negativo que se derivan de nuestro modelo de ratón GC establecida de tipo difuso. El tratamiento con un agente de desmetilación del ADN 5-aza-DC reactivado la expresión en células TWIST1 GC negativa en expresión de TWIST1. De acuerdo con la metilación específica de PCR y análisis de secuenciación de bisulfito, la metilación en la región rica en CpG dentro de
TWIST1
exón 1 de codificación, en lugar de su región promotora, estaba estrechamente ligada con el silenciamiento transcripcional del
TWIST1
expresión en células de GC ratón. ensayos de inmunoprecipitación de cromatina revelaron que marca la histona activa H3K4me3 fue enriquecida en células de expresión positiva TWIST1, e inactivo marca de histona H3K9me3 fue enriquecida en células de expresión negativo TWIST1. Los niveles de expresión de
Suv39h1
y
Suv39h2
, histonas methyltransferases para H3K9me3, se correlacionaron inversamente con
TWIST1
expresión y desmontables de
Suv39h1
o
Suv39h2
indujo
TWIST1
expresión. Por otra parte, el factor de transcripción Sp1 ligado al exón 1 región rica en CpG en líneas celulares de expresión positiva TWIST1, y
TWIST1
expresión se ve disminuida por mitramicina, que interfiere con SP1 que la unión a secuencias reguladoras ricas en CpG. Nuestros estudios sugieren que el
TWIST1
la transcripción en células de GC pueden ser regulados a través de la cooperación potencial de metilación del ADN, modificación de las histonas en el complejo con Sp1 unión a regiones ricas en CpG dentro de la región del exón 1.
cita: Un Sakamoto, Akiyama y, Shimada S, Zhu WG, Yuasa y, Tanaka S (2015) la metilación del ADN en el exón 1 Región y el Reglamento del Complejo TWIST1 Expresión en células de cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (12): e0145630. doi: 10.1371 /journal.pone.0145630
Editor: Roh Tae-Young, Universidad Pohang de Ciencia y Tecnología (POSTECH), República de Corea
Recibido: 21 Septiembre, 2015; Aceptado: 6 de diciembre de 2015; Publicado: December 22, 2015
Derechos de Autor © 2015 Sakamoto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas-en-Ayudas a la Investigación Científica (C) (24590444) y (a) (25253081), y el Programa Foresight A3 (AA005) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP), y la investigación práctica para el control de Innovative Cancer (15Ack0106017h0002) de la Agencia Japonesa para la Investigación y Desarrollo, AMED médica; https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html, https://kaken.nii.ac.jp/d/r/80262187.ja.html.
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
abreviaciones: Bs., secuenciación de bisulfito; CGI, isla CpG; Chip, la inmunoprecipitación de la cromatina; DCKO, doble ratón knockout condicional; DGC, difusa de tipo cáncer gástrico; GAPDH, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa; GC, cáncer gástrico; H3K4me3, la histona H3 lisina 4 tri-metilación; H3K9me3, histona H3 lisina 9 tri-metilación; H3K27me3, histona H3 lisina 27 tri-metilación; MSP, reacción en cadena de la polimerasa específica de metilación; RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa de transcripción; QRT-PCR, RT-PCR cuantitativa; ETG, genes supresores de tumores; TSS, sitio de inicio de transcripción; 5-aza-DC, 5-aza-2'- deoxycitidine
Introducción
TWIST1, que actúa como un factor de transcripción básica hélice-bucle-hélice, se une directamente a los elementos de E-box (NCANNTGN ) en genes específicos [1]. TWIST1 es ampliamente conocido por ser esencial para la formación de mesodermo durante el desarrollo embrionario temprano de Drosophila y ratón [2, 3]. En los cánceres humanos, se informa que la expresión ectópica TWIST1 estar asociado con la progresión maligna, la invasión, la transición epitelio-mechencymal, metástasis y stemness, indicando posibles funciones oncogénicas de TWIST1 [4-6]. Por lo tanto, es muy importante aclarar los mecanismos reguladores de la transcripción para TWIST1 en células de cáncer.
Los cambios epigenéticos, como la metilación del ADN y la modificación de histonas, están estrechamente relacionados con el silenciamiento de genes [7-9]. Aunque las alteraciones epigenéticas en el CGI (isla CpG) región promotora de los genes supresores de tumores (ETG) son bien conocidos por estar asociados con su inactivación de genes [10], los mecanismos de regulación epigenética de oncogenes son poco conocidos. Varios grupos han demostrado que
TWIST1
fue re-activa por tratamiento con un fármaco de-metilación, 5-aza-2 'deoxycitidine (5-aza-dC), en células de cáncer [11, 12]. metilación aberrante del ADN en el promotor CGI en humanos
TWIST1
se ha detectado con frecuencia en los cánceres primarios, con inclusión de cáncer gástrico (CG) [11-14]. Sin embargo, hay una gran cantidad de los resultados que la metilación del ADN en el
TWIST1
región promotora no se correlaciona con la expresión del gen en diversos tipos de cáncer [12, 14]. Mientras que
TWIST1
metilación puede ser un biomarcador útil para predecir los resultados clínicos en cuanto a la recurrencia y la supervivencia en pacientes con cáncer [12, 13, 15], sigue siendo controvertido si el
TWIST1
metilación en la región del promotor conduce a silenciamiento del gen.
regulación transcripcional de genes se correlaciona con patrones de lisina (K) de metilación en la cola de la histona que consisten en tres diferentes estados de metilación de lisina (mono-, di- y tri-). Tri-metilación de H3K4 (H3K4me3) está relacionada con la activación de genes, y la de H3K9me3 y H3K27me3 a gen represión [7-9]. A pesar de estos patrones H3-methyaltion tres histonas están ligadas a la metilación del CGI, así, los mecanismos reguladores de la transcripción de
TWIST1
subyacente a la modificación de histonas, son poco conocidos en las células cancerosas.
GC es el segundo más frecuente causa de muerte por cáncer en el mundo [16]. GC se clasifica en dos principales tipos histológicos; difuso e intestinal, que son dos vías distintas cancerígenos [17]. cáncer gástrico de tipo difuso (DGC) es conocido para mostrar frecuente invasión y la metástasis, lo que resulta en un mal pronóstico [18]. La pérdida de E-cadherina y p53 se ha informado en de tipo difuso carcinogénesis gástrica [19-21]. Varios informes han demostrado la sobreexpresión frecuente de TWIST1 en los PED humanos [22, 23].
previamente diseñado una doble knockout condicional (DCKO) como línea de ratones a E-cadherina y p53, que son inactivados específicamente en el estómago [ ,,,0],19]. Todos los ratones desarrollaron DCKO PED fatales dentro de un año, los fenotipos siendo alta capacidad de invasión y metástasis a los ganglios linfáticos frecuente. Es de notar que los patrones de expresión génica de PED en los ratones DCKO detectadas en el análisis de microarrays fueron muy similares a los de los PED primarios humanos distintos de los intestinales. Por lo tanto, nuestro modelo de ratón DCKO es una herramienta poderosa para investigar el papel de la función del gen en la carcinogénesis y la DGC para el desarrollo de una estrategia terapéutica. En este estudio, hemos establecido líneas de expresión TWIST1-positivos y negativos de células DGC que se derivan de los ratones DCKO. Como consecuencia del análisis de las alteraciones epigenéticas, el mecanismo regulador común de
TWIST1
fue aclarada, y se evalúa tanto en murinos y humanos PED en este estudio.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todo
in vivo
los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de Tokio la Universidad médica y Dental (permiso No. 0160073A). En cuanto a las muestras mucosas gástricas humanas normales, el consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los sujetos, y el estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Tokio Médica y Dental (No.1115).
culturas y muestras de tejido celular
previamente establecido un E-cadherina /p53 DCKO (
Atp4b-Cre
+
;
Cdh1
loxP /loxP
;
Trp53
loxP /loxP
) modelo de ratón [19]. Desde sus los tejidos cancerosos, establecimos cinco líneas celulares de ratón DGC y los llamó MDGCs (Shimada S, observación no publicada). MDGC-1 y MDGC 3-células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía alta glucosa suplementado con suero bovino fetal 10%, y MDGC-7, MDGC-8 y MDGC-9 fueron cultivadas en F12 de Ham suplementado con 5% de suero de caballo. El análisis del ADN se realizó con el fin de detectar el truncado
Cdh1
y
Trp53
alelos (S1 FIG). Ocho líneas de células GC humanos (KATO-III, GCIY, AGS, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4 y HSC60) también se utilizaron en este estudio. MKN7, MKN45, MKN74, GCIY y Kato-III fueron adquiridos de banco de células RIKEN (Tsukuba, Japón). NUGC4 células AGS y se obtuvieron a partir de la investigación de la ciencia Banco de Recursos Humanos (Osaka, Japón) y ATCC (Colección Americana de célula Tipo). HSC60 células se obtuvieron del Dr. Kazuyoshi Yanagihara (Centro Nacional de Investigación del Cáncer, Tokio, Japón) [24]. células KATO-III, MKN7, MKN45, MKN74, NUGC4, AGS y HSC60 se cultivaron en RPMI 1640, y GCIY se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco, ambos de los cuales fueron suplementados con suero bovino fetal 10%. Para los estudios de-metilación, murino y células GC humanos fueron tratados a diario con 500 nM 5-aza-desoxicitidina (5-aza-dC, Sigma;#A3656) durante 72 horas. Se han tratado estas células con 100 nM GC tricostatina A (TSA, Wako;#200-11993) durante 24 horas o 100 nM mitramicina A (Wako;#132-17101) durante 24 horas
Dieciocho tejidos primarios y GC correspondiente. mucosas gástricas no cancerosas se obtuvieron de 15 ratones DCKO. En cuanto a los tejidos del estómago humanos, utilizamos tres mucosa gástrica no cancerosos de pacientes con cáncer gástrico. También obtuvimos cinco mucosa gástrica normal de
Atp4b-Cre
-
;
Cdh1
loxP /loxP
;
Trp53
loxP /loxP
los ratones que fueron utilizados como controles negativos en nuestro estudio anterior [19]. En este estudio, que se llama "la mucosa gástrica normal," si los especímenes fueron obtenidos de los ratones de control, y "la mucosa gástrica no canceroso" Si las muestras se obtuvieron a partir de ratones DCKO y pacientes GC humanos en este estudio.
Transcripción reversa (RT) -PCR y RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
ARN total se aisló con un kit RNeasy Mini (Qiagen;#74134) y se preparó ADNc a partir de ARN utilizando un kit Superscript III (Invitrogen;#18080044) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Punto final de la RT-PCR realizada con múltiples números de ciclo, 28-35 ciclos. Como control interno, la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (
GAPDH
) se amplificó con 21 ciclos para asegurar la calidad de ADNc y la cantidad de cada RT-PCR. Los productos amplificados se cargaron a 2% en geles de agarosa o cuantificaron por RT-PCR cuantitativa utilizando LightCycler DNA Maestro SYBR Green I (Roche Diagnostics;#04707516001). Los programas de amplificación para PCR se repitieron durante 40 ciclos para GAPDH y 45cycles para otros genes, excepto para GAPDH. Los productos de PCR se clonaron en el vector T-pMD20 mediante el uso de un kit de Mighty de clonación de TA (Takara Bio INC;#6028), y luego secuenciados directamente. Las secuencias de los cebadores y tamaños de productos de PCR se muestran en la Tabla S1.
análisis de metilación
Se extrajeron el ADN genómico de murino y las líneas celulares GC humanos por el método de fenol-cloroformo, y luego llevar a cabo bisulfito modificación y el procedimiento de MSP. tratamiento con bisulfito del ADN se realizó con EZ metilación del ADN-Gold (Zymo RESEARCH;#D5006), y se llevó a cabo a continuación la metilación específica de PCR (MSP). Brevemente, la reacción de PCR se realizó durante 35 ciclos en una mezcla 25 l que comprenden ADN bisulfite modificados, 2.5μl de 10x tampón de PCR, 1,25 l de 25 mM dNTPs, 25 pmol /l de cada cebador y 1 U de JumpStart RedTaq polimerasa (Sigma ;#D0563). Las condiciones para la PCR fueron las siguientes: 95 ° C durante 5 minutos; 35 ciclos de 95 ° C para 1 minuto, 53 ° C durante 2 minutos, y 72 ° C durante 1,5 minutos; y una extensión final a 72 ° C durante 5 minutos. En cuanto a los tejidos GC de ratón, el ADN fue extraído de los tejidos embebidos en parafina fijados con formalina (FFPE). ADN bisulfito se amplificó con cebadores flanqueantes de PCR y MSP entonces anidada se realizó [25, 26]. Las secuencias de los cebadores y tamaños de productos de PCR se muestran en la Tabla S2
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) ensayo de
El chip de ensayo se realizó con un kit de chip-IT Express (Active Motif;#53008). de acuerdo con el protocolo del fabricante. enriquecimiento de ADN inmunoprecipitado se normalizó como a la entrada. Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron anti-histona H3K4me3 (Active Motif;#39915), (Active Motif;#39765) anti-H3K9me3, anti-H3K27me3 (Active Motif;#39155), anti-H3K36me2 (Abcam;#ab9049) , anti-Sp1 (Abcam;#ab13370), y (Active Motif;#39163) anti-histona H3 anticuerpos. normal de conejo IgG (Cell Signaling Technology;#2729s) se utilizó como control negativo para el chip. Las secuencias de los cebadores y tamaños de productos de PCR se muestran en la Tabla S2.
Análisis de derribo utilizando ARN de interferencia pequeños
desmontables basado en siRNA de
Suv39h1
y
Suv39h2
se realizó utilizando un (sistema de neón de la transfección, Invitrogen) electroporación de acuerdo con las instrucciones del fabricante. MDGC células fueron transfectadas con 50 nM siRNA de Suv39h1 (SASI_Hs02_00335192, Sigma), Suv39h2 (SASI_Hs01_00101226), o un control negativo (control negativo siRNA Misión universal, Sigma) siRNA. Después de 48 horas de cultivo, las células fueron recolectadas para la RT-PCR, análisis de Western blot, la migración, invasión y proliferación de ensayo.
Análisis Western Blot
GC células se lisaron con tampón RIPA Pierce (Thermo científica;#89900). Las proteínas se separaron en geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a continuación a fluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas, seguido de incubación con anticuerpos disueltos en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contiene 2% de leche desnatada y 10% de Tween 20. Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio fueron monoclonal de ratón anti-TWIST1 (1: 100, Santa Cruz Biotecnología;#sc-81417), policlonal de conejo anti-Sp1 (1: 200, Active Motif;#39058), y monoclonal de ratón anti-α-tubulina ( 1: 200, Santa Cruz;#sc-8035) anticuerpos. Los anticuerpos secundarios fueron alcalina IgG anti-conejo conjugado con fosfatasa (1: 3000, Laboratorios Bio-Rad;#1706518) y anti-IgG de ratón (1: 3000, Bio-Rad Laboratories;#1706520). Las transferencias se desarrollaron con sustrato ImmunoStar AP (Bio-Rad Laboratories;#1705018)
La inmunohistoquímica
secciones FFPE (4 micras) se deparaffinized en xileno, rehidratada en soluciones de etanol graduado y luego la recuperación de antígenos. se llevó a cabo en tampón de ácido cítrico 10 mM en el microondas. La inmunohistoquímica se realizó utilizando anticuerpos anti-TWIST1 (Santa Cruz, 1:20) como se describe anteriormente [19]. Expresión de TWIST1 se definió como la tinción nuclear positiva en más de 10% de las células, y la intensidad se obtuvo AS (negativo), + (débil) y ++ (moderada a fuerte) por tres investigadores de forma independiente.
Resultados
TWIST1 expresión en líneas celulares murinos y humanos GC
A partir de los tejidos de ratones DGC DCKO,
TWIST1
líneas celulares de transcripción positivos (MDGC-7, MDGC- 8 y se establecieron MDGC-9) y líneas de células negativas (MDGC-1 y MDGC-3) (Fig 1A y S2A Fig), y la expresión de la proteína TWIST1 se confirmó en cada línea celular (Fig 1B). TWIST1 expresión se ha mejorado en los niveles de ARNm y de proteína en células MDGC negativa en expresión de TWIST1 después del tratamiento con el agente de desmetilación del ADN 5-aza-dC (Fig 1C y 1D), mientras que su expresión no se cambió después del tratamiento con TSA inhibidor de la histona deacetilasa (S2B Higo). En las ocho líneas de células GC humanos examinados,
TWIST1
expresión se downregulated en cuatro líneas celulares (Figura 1E, izquierda), tres (KATO-III, GCIY y AGS) de los cuales demostrado la reactivación de
TWIST1
expresión después del tratamiento con 5-aza-dC por RT-PCR (ejemplo, la figura 1E, derecha). En cuanto a
TWIST1
líneas celulares de expresión GC-positivo, después de 5-aza-DC tratamiento, 2.1- y 3.2-veces sobre regulación de
TWIST1
se detectó en MKN45 y MKN7, respectivamente, por QRT-PCR, mientras que la expresión TWIST1 no se ha modificado en MDGC-9 células (figura 1F).
(a) análisis de RT-PCR de
TWIST1
mRNA expresión en líneas celulares de ratón de cinco GC MDGC-1, MDGC-3, MDGC-7, MDGC-8 y MDGC-9) de ratones DCKO. Ratón
Gapdh
se utilizó como control interno. (B) Expresión de la proteína en las células TWIST1 MDGC por Western blot. α-tubulina se utilizó como control interno. Efectos de un agente de desmetilación del ADN en las células MDGC (C y D). Después del tratamiento con 5-aza-DC,
TWIST1
expresión era-regulada de manera ascendente en el ARNm (C) y los niveles de proteína (D) en células TWIST1 MDGC-1 y MDGC-3-expresión negativa, pero no en TWIST1 MDGC-9-células de expresión positiva. M, simulacro; A, 5-aza-DC. análisis (E) RT-PCR de
TWIST1
mRNA expresión en líneas celulares humanas GC (KATO-III, GCIY, AGS, MKN74, MKN7, MKN45, NUGC4 y HSC60) (izquierda).
TWIST1
expresión era-regulada de manera ascendente en el nivel de ARNm en células GCIY KATO-III y después del tratamiento con 5-aza-DC (derecha). Human
GAPDH
se utilizó como control interno. análisis (F) QRT-PCR de
TWIST1
expresión de mRNA en MDGC-9, las células MKN7 y MKN45 con y sin 5-aza-DC tratamiento (** P & lt; 0,01).
metilación CGI y la expresión de
TWIST1 Hoteles en líneas celulares GC
TWIST1
tiene una región densa CGI a partir del promotor de todo el exón 1, esta región está altamente conservada entre los vertebrados, incluyendo ratón y humano (figura S3). Para aclarar el CGI en ratones y humanos
TWIST1
, se realizó un análisis computacional utilizando la UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/index.html) y MethPrimer (http: //www.urogene. org /methprimer /) que se utiliza ampliamente como la identificación de CGI y los cebadores MSP [27]. Se analizaron aproximadamente 1,4 kb región que incluye el promotor y el exón 1. toda UCSC Genome Browser en el ratón y análisis humano exhibido una CGI en la región examinados (datos no mostrados). Sin embargo, se detectaron dos supuestos sitios de CGI en la región, tanto en ratón y humano cuando se utilizaron los criterios de CGI con contenido de GC de 50% y observada /esperada relación CpG del 0,8 por MethPrimer (figura 2A y 2C). Estas dos regiones CGI putativo se encuentra en el promotor y el exón 1. Puesto que la metilación en la región promotora se ha informado en diversos cánceres humanos [12, 14], examinamos inicialmente el estado de metilación en la región en murinos y las líneas celulares de GC humanos por MSP. Sin embargo, el estado de metilación de la región promotora del
TWIST1
no correspondía a su expresión en las líneas celulares GC examinada (región P1, figura 2A). Para determinar las regiones críticamente metilados asociadas con la expresión en las células TWIST1 MDGC, se realizó más MSP en la región de CGI en el exón 1 (E1-1, E1-2 y E1-3), y el sitio CpG orilla predicho localizado aproximadamente a 1,6 kb a partir de TSS (sitio de inicio de transcripción, S1) (figura 2A). Como resultado, la metilación CGI en la región (E1-1 y E1-2) alrededor de la TSS en
TWIST1
exón 1 se encontró que corresponden a la expresión del gen en las células MDGC, aunque no había correlación entre ellos en la región predicha orilla (S1) y el extremo de la región del exón 1 (E1-3) (Fig 2B, izquierda) en las células MDGC. No se detectó metilación en las regiones CpG en tres mucosa gástrica normal sin expresión TWIST1 de
Atp4b-Cre
-
;
Cdh1
loxP /loxP
;
Trp53
loxP /loxP
ratones (Figura 2B). En la mucosa gástrica humana, sin
TWIST1
metilación también se constató en tres mucosa gástrica no cancerosos de pacientes GC (figura 2D), uno de los cuales mostraron muy débil
expresión TWIST1
(datos no mostrados ). También se examinaron las mucosas adicional de cuatro no canceroso gástrica de pacientes GC, mientras que no se detectó metilación en la región de E1-2 en ningún caso (datos no mostrados). secuenciación de bisulfito (BS) demostró que la región de CGI en el exón 1 mostró densa metilación en células MDGC-3 de expresión-negativo TWIST1 pero no en TWIST1-positivo MDGC-9 células (BS-c, Fig 2A y 2B, derecha), mientras que hay hubo diferencias en los patrones de metilación entre ellos en la orilla CpG y regiones promotoras (BS-a y BS-b, S4A Fig). Entre las líneas de células de GC humanos, KATO-III y GCIY sin
TWIST1
expresión mostró metilación CGI densa en la región del exón 1 (E1-2) que es consistente con los de ratón
TWIST1
(figura 2C y 2D, izquierda). Tanto metilación y no metilación en la región E1-2 se detectaron en las células MKN7 y MKN45 por MSP y secuenciación de bisulfito (Fig 2D), que se expresan basalmente TWIST1 pero sus niveles de expresión se incrementaron después de tratamiento con 5-aza-dC (Fig 1F). Por lo tanto, nuestros datos indican que la metilación en la región de exón 1 de
TWIST1
ha detectado en este estudio se correlaciona con su expresión.
(A) Representación esquemática de la estructura genómica y la CGI predicho con MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/) del ratón
TWIST1
gen. Dos CGIs (regiones delgadas azules, izquierda, -358 a -149; derecha, -96 a +759) se observaron en la región del promotor a todo el exón 1 (Obs /Exp = 0,8,% GC & gt; 50%). La flecha doblada indica el sitio de inicio de transcripción (TSS). sitios CpG individuales se indican como líneas verticales de color naranja. Las cajas denotan el exón. Las flechas de doble punta negros indican las regiones (S1, P1, E1-1, E1-2 y E1-3) examinados por PCR específica de metilación (MSP). Las flechas de doble punta azules indican las regiones examinadas por el chip de ensayo. Las barras rojas indican las regiones examinadas por secuenciación de bisulfito (BS). (B) Análisis de MSP de líneas celulares MDGC y tres normales de la mucosa gástrica de
Atp4b-Cre
-
;
Cdh1
loxP /loxP
;
Trp53
loxP /loxP
ratones en las cinco regiones (izquierda). U: alelos no metilados; M: metilado alelos. BS de la región 322 a 670 (BS-c) en MDGC-3 y MDGC-9 (derecha). BS-a y BS-B se muestran en la Fig S3. La región del MSP y BS E1-2-c corresponde a
TWIST1
expresión. Los círculos negros representan el sitio CpG metilado; los círculos blancos representan los sitios CpG no metilados. (C) Representación esquemática de la estructura genómica y la CGI predicho con MethPrimer del gen
TWIST1
humano. Dos CGI (a la izquierda, -369 a -138; derecha, 91-742) fueron observados (Obs /Exp = 0,8,% GC & gt; 50%). (D) MSP y BS análisis de líneas celulares humanas GC y tres mucosa gástrica no cancerosos de pacientes con cáncer gástrico. Se evaluaron cuatro regiones (izquierda, P1, E1-1, E1-2 y E1-3) y el exón 1 (a la derecha, 315 a 651, BS-c) en el ser humano
torcedura 1 | gen, los cuales están situados de forma análoga a la del ratón MSP y BS regiones. Se detectó metilación densa en las células que carecen de KATO-III
TWIST1
expresión, mientras que las células que expresan MKN45
TWIST1
exhibido ambos alelos metilados y no metilados.
TWIST1
metilación y de expresión en muestras de tejido de ratón DCKO GC
Hemos examinado el estado de metilación de
TWIST1
usando 18 GC tejidos primarios de 15 ratones DCKO. Como las regiones GC eran muy pequeñas y su ADN a partir de muestras FFPE mostraron bajas concentraciones, se realizó MSP anidada [25, 26].
TWIST1
fue metilado significativamente (9/18, 50%) en comparación con los GC primarios correspondientes tejidos no cancerosos (1/10, 10%), siendo la diferencia estadísticamente significativa (P & lt; 0,05, Tabla 1). Los datos representativos de MSP se muestran en la Fig 3A. Entre ellos, 4 de 10 (40%) casos eran intramucoso y 5 de 8 (62,5%) fueron GCs invasiva (Tabla 1). En este estudio,
TWIST1
casos de metilación positivo demostró bandas MSP no metilados, así, que debido a la presencia de estroma /fibroblastos normales y células inflamatorias en secciones de tejido de cáncer, aunque no pudimos negar la posibilidad de metilación parcial como MKN45 y MKN7 y la heterogeneidad del tumor.
(a) Los resultados representativos de análisis MSP anidada de
TWIST1 Hoteles en los PED de ratones DCKO y una mucosa gástrica no canceroso correspondiente (carril N). Las regiones (E1-2) analizados se muestran en la Fig 2A. U: alelo no metilado; M: alelo metilado. (B) tinción inmunohistoquímica Representante de la proteína en los tejidos TWIST1 DGC de ratones DCKO. (I) la tinción nuclear fuerte de la proteína TWIST1 en un cromatógrafo de gases sin metilación. (Ii) expresión negativa proteína TWIST1 en un GC con la metilación. Aumento original, x400. (C) Resumen de los
TWIST1
metilación y de expresión en los PED primarias.
TWIST1
fue metilado en 9 de 18 GCs, como se indica por M. La intensidad de la tinción se anotó TWIST1 AS (negativo), + (débil) y ++ (moderada a fuerte). GC ratón se dividieron en dos grupos, intramucoso y GC invasivos de acuerdo con los criterios de la CG humana establecidos por la Asociación Japonesa del Cáncer gástrico [53].
TWIST1 expresión de la proteína se detectó en 7 de las 18 (38,9%) en comparación con los GC correspondiente mucosa gástrica no canceroso mediante técnicas de inmunohistoquímica. imágenes representativos se muestran en la figura 3B. Además, se analizó la relación entre
TWIST1
de expresión y de metilación niveles en estos casos. Entre el 18 GC primaria examinó, nueve casos se observó correlación entre la
TWIST1
metilación y de expresión (Figura 3C). Tres de los cuatro casos con TWIST1 expresión débil exhibieron su metilación, posiblemente que la baja expresión de TWIST1 puede ser causada por su metilación. Sin embargo, otros cinco casos no mostraron metilación y de expresión (Tabla 1).
metilación de histonas está relacionado con la regulación de los
TWIST1
expresión
A continuación se investigó si la nivel de metilación de las histonas H3 lisina contribuye a
TWIST1
expresión. immunoprecipitation (CHIP) ensayos de la cromatina se realizaron en la orilla CpG predicho (CP1.3k), promotor (CP1), y los exones 1 2 regiones (CE2) (figura 2A) (CE1-1 y CE1-2) y. En las regiones CP1 y CE1-2, marca de histona activa H3K4me3 fue enriquecida en células de expresión positiva TWIST1 (MDGC-7 y MDGC-9), pero inactivo marca de histona H3K9me3 fue enriquecida en células de expresión negativo TWIST1 (MDGC-1 y MDGC -3) (Fig 4A y 4B). ensayos de chip mostraron señales tanto H3K9me3 H3K4me3 y en MDGC-1 y las células MDGC-3 con 5-aza-dC tratamiento, indicando los niveles elevados H3K4Me3 en estas células (Fig 4C). Por el contrario, los niveles H3K27me3 y H3K36me2 no se correlacionaron con la expresión TWIST1 en cualquier célula MDGC examinados en este estudio. En cuanto a las líneas celulares humanas GC, una región similar se encuentra desde el promotor al exón 1 mostró H3K4me3 enriquecimiento en
TWIST1
expresión positiva MKN45 células, y H3K9me3 en
TWIST1
negativa en expresión de KATO-III células (figuras 2C y 4D).
(a) el estado de metilación de histonas en células TWIST1 expresión positiva (MDGC-7 y MDGC-9) y las células gramnegativas (MDGC-1 y MDGC-3). chip de ensayo se llevó a cabo utilizando anticuerpos H3K4Me3, H3K9me3, H3K27me3 y H3K36me2. Las cinco regiones chip (CP1.3k, CP1, CE1-1, CE1-2 y CE2) analizados se muestran en la figura 2A. muestras de ADN de entrada se utilizaron como controles internos. análisis (B) chip semi-cuantitativa de la histona H3K4me3 y H3K9me3 enriquecimiento. intensidades de chip se analizaron usando el software Image J 1.47v, y luego se calculó chip /Entrada. marca de la histona activa H3K4me3 fue enriquecida en células de expresión positiva TWIST1, pero marca la histona inactiva H3K9me3 fue enriquecida en células de expresión negativo TWIST1. (C) La relación entre la metilación de histonas y CGI en las células MDGC. células MDGC-1 y MDGC-3 fueron tratados con 5-aza-DC, y el estado de metilación de histonas y de su H3K4me3 H3K9me3 fue examinado por chip de ensayo. Los niveles H3K4Me3 se incrementaron en estas células tratadas con 5-aza-dC en comparación en los controles no tratados (figura 4A), como se muestra por triángulos. (D) Chip análisis semi-cuantitativo de H3K4me y H3K9me3 en las células humanas GC. Las regiones (CP1, CE1-2) analizados se muestran en la figura 2C. De manera similar a los datos para ratón
TWIST1 gratis (figura 4B), los niveles H3K4Me3 y H3K9me3 fueron enriquecidos en células MKN45 y Kato-III, respectivamente. El promedio (columna) ± SD (bar) durante tres electroforesis en gel de agarosa independiente en diferentes experimentos se indica (** p & lt; 0,01).
Suv39h1
y
Suv39h2
, una histona metiltransferasa, regula H3K9me3
Hay una gran cantidad de histonas methyltransferases asociados con H3K4, H3K9 y H3K27 [28]. Por lo tanto, para determinar qué modificación de las histonas enzimas son responsables para el enriquecimiento H3K4me3 o H3K9me3 en el
TWIST1
exón 1 región en las células de GC, hemos examinado diez H3K4me3 (
mLL1
,
mLL2
,
MLL3
,
Mll4
,
Setd1a
,
Setd1b
,
Ash1
,
Ash1l
,
Smyd3
y
Meisetz
), siete H3K9me3 (
Suv39h1
,
Suv39h2
,
G9a
,
Setdb1
,
Clld8
,
Glp
y
RIZ1
), y uno H3K27me3 (
Ezh2
) los genes relacionados. Los datos representativos se muestran en la figura 5A. Entre ellos, los niveles de expresión de
Suv39h1
y
Suv39h2
fueron inversamente correlacionado con
TWIST1
expresión. Sin embargo, los niveles de expresión de genes histona restante 16 methylatasferase examinados no se asociaron con
TWIST1
expresión en células MDGC. Se realizó la precipitación a base de siRNA de
Suv39h1
o
Suv39h2 Hoteles en los respectivos MDGC-1 y MDGC-3 células de expresión positiva por electroporación (Figura 5B). Desmontables de
Suv39h1
o
Suv39h2
en estas líneas celulares llevado a un aumento de
TWIST1
expresión observable sobre la RT-PCR (Figura 5B) y QRT-PCR (MDGC- 1, la figura 5C).
(a) Expresión de las histonas methyltransferases de H3K4 (
mLL1
,
mLL2
,
MLL3
,
Mll4
,
Setd1a y Ash1l
), H3K9 (
Suv39h1
,
Suv39h2
,
G9a y Setdb1
), y H3K27 (
Ezh2
) se determinó por RT-PCR. Los niveles de expresión de
Suv39H1
y
SUV39H2
fueron inversamente correlacionado con
TWIST1
expresión.
Gapdh
se utilizó como control interno. (B y C) Efecto de
Suv39h1
o
Suv39h2
caída en
TWIST1
expresión en células MDGC. RT-PCR se realizó en MDGC-1 y MDGC 3-células con
TWIST1
expresión después de la transfección de Si
Suv39h1 gratis (SIH1), Si
Suv39h2 gratis (sih2) o control negativo (SINC) siRNA. (C) El
TWIST1
,
Suv39h1
y
SUV39H2
niveles de mRNA en células MDGC-1 fueron confirmados más de QRT-PCR. Las columnas y barras indican los promedios y S. D., respectivamente. ** P & lt;. 0,01
Asociación de SP1 con la regulación transcripcional de
TWIST1
El consenso 5 '- (G /T) GGGCGG (G /a) (G /a) (C /T) -3 'secuencia se conoce como el motivo de unión de factor de transcripción Sp1, y una relación entre la metilación y CGI Sp1 de unión en el promotor ha informado [29, 30].