Extracto
Anti-mesotelina
Pseudomonas
inmunotoxinas recombinantes basados en una exotoxina (RIT) presentan una modalidad de tratamiento potencial para el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC). Para el estudio de mecanismos de resistencia, la línea celular sensible PDAC KLM-1 fue intermitente expuesto al antimesotelina SS1-LR-GGS RIT. Las células supervivientes eran resistentes a varios RIT anti-mesotelina (IC
años 50 & gt; 1 mg /ml), incluyendo la novela de-inmunizado RG7787. Estas células KLM-1-R resistentes fueron igualmente sensibles a la anti-CD71 HB21 (Fv) -PE40 RIT como KLM-1, lo que indica resistencia era específico para RIT anti-mesotelina. la expresión del gen de mesotelina fue parcialmente reducido regulado en KLM-1-R, lo que resulta en 5 veces los niveles de proteína de superficie inferior y una disminución de la captación celular de RG7787 en comparación con KLM-1. análisis de secuenciación de bisulfito encontró que la región promotora mesotelina fue significativamente más metilado en KLM-1-R (59 ± 3,6%) en comparación con KLM-1 (41 ± 4,8%), lo que indica la hipermetilación como un mecanismo de regulación a la baja de mesotelina. El inhibidor de la ADN metiltransferasa 5-azacitidina restauró la expresión en superficie de mesotelina original, a más de medio en KLM-1-R y el aumento de la sensibilidad a la RG7787 (IC
50 = 722.4 ± 232.6 ng /ml), aunque las células se mantuvieron significativamente menos sensible en comparación con parentales células KLM-1 (IC
50 = 4,41 ± 0,38 ng /ml). La mesotelina cDNA introducción en KLM-1-R dio lugar a 5 veces los niveles de proteína de la superficie superior y significativamente mayor absorción de RG7887 en comparación con KLM-1. Como resultado, la sensibilidad original al RG7787 se restauró completamente (IC
50 = 4,49 ± 1,11 ng /ml). A captación RG7787 significativamente mayor fue por lo tanto necesario para alcanzar la citotoxicidad original en células resistentes, dando a entender que el tráfico intracelular RIT es también un factor limitante. ARN análisis de secuenciación profunda de las células KLM-1 y KLM-1-R apoyado nuestros hallazgos experimentales; en comparación con KLM-1, las células resistentes muestran la expresión diferencial de genes relacionados con el transporte intracelular y un patrón de expresión que coincidió con un estado más general hipermetilación. En conclusión, la resistencia a la RIT antimesotelina en KLM-1 está vinculada a una metilación asociada a la baja regulación de la mesotelina, mientras que las aberraciones en el tráfico de RIT también podrían desempeñar un papel
Visto:. Hollevoet K, Mason- osann E, F Müller, Pastan I (2015) la metilación parcial asociada a la baja regulación de mesotelina causa resistencia a antimesotelina inmunotoxinas en una línea celular de cáncer de páncreas. PLoS ONE 10 (3): e0122462. doi: 10.1371 /journal.pone.0122462
Recibido: December 23, 2014; Aceptado: February 17, 2015; Publicado: 24 Marzo, el año 2015
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la licencia Creative Commons CC0 dominio público dedicación
Disponibilidad de datos:. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación: Esta investigación fue apoyada por el intramural Programa de Investigación de los Institutos nacionales de Salud, Instituto Nacional del cáncer, Centro de Investigación del cáncer, y por un acuerdo de investigación y desarrollo en colaboración (# 2791) entre el Instituto Nacional del cáncer y Roche Pharmaceuticals. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales. K. H. fue apoyado en parte por el Fondo para la Investigación Científica de Flandes (FWO, Bélgica). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión de publicar o preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Esta investigación fue apoyado en parte por Roche Pharmaceuticals. I.P. es un inventor en varias patentes de inmunotoxinas que todos se han asignado a NIH (incluyendo US 8.357.783 "anticuerpos monoclonales anti-mesotelina Humanos", US 20120263674 "exotoxina A de Pseudomonas con inmunogenicidad reducida" y US 20140094417 "exotoxina A de Pseudomonas con células T menos inmunogénicos y /o epítopos de células B "). Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
Nuestro laboratorio desarrolla inmunotoxinas recombinantes (RIT) para el tratamiento del cáncer. RIT actuales en los ensayos clínicos se componen de un Fv de unión al antígeno fusionado a una porción de 38 kDa de la
exotoxina de Pseudomonas
A (PE) [1]. Después de la endocitosis mediada por receptor, RIT se procesan proteolíticamente, y PE se propone tráfico a la red trans-Golgi y peligrosa de una vía retrógrada al retículo endoplasmático, donde se somete a la translocación al citoplasma [2]. A su llegada en el citosol, el PE se dirige Alargamiento Factor-2 (EF-2). Maduro EF-2 se produce por la modificación postraduccional de la histidina 715 por las proteínas Diphthamide Biosíntesis (DPH) 1-5 y 7 [3, 4]. Este histidina modificada ( «diphthamide ') es ADP-ribosylated por PE, que inactiva EF-2 y se detiene la síntesis de proteínas, que finalmente llevan a la muerte celular programada [2].
previamente aislado y caracterizado varias líneas de células leucémicas resistente a los
Moxetumomab pasudotox
[5-7], un anticuerpo anti-CD22 RIT actualmente en ensayo clínico de fase III (ClinicalTrials.gov identificador: NCT01829711). Estas líneas celulares resistentes muestran diversas aberraciones en la expresión DPH, que impiden EF-2 ADP-ribosilación y protegen a las células de la inhibición de la síntesis de proteínas [5-7]. SS1 (dsFv) -PE38 (SS1P), otro RIT en ensayos clínicos, se dirige a la mesotelina, una superficie celular glicofosfatidilinositol 40-kDa (GPI) anclada a la proteína [8] que se expresa altamente en varios tumores malignos, incluyendo el mesotelioma y adenocarcinoma ductal pancreático ( PDAC) [9-11]. SS1P ha limitado la actividad clínica como agente único, principalmente debido a la limitante de la dosis inmunogenicidad EP en pacientes [12, 13]. En respuesta, SS1P se ha combinado con RIT-inmunes ozono quimioterapéuticos, lo que resulta en respuestas sin precedentes en los pacientes con mesotelioma avanzado refractario [14], y de bajo inmunogénicos han sido diseñados en el que muchos B o de células T epítopos y regiones sensibles a la proteasa de PE38 se eliminan. Este último resultó en un resto truncado y inmunizado de-toxina 24-kDa (PE24) que tiene menos reactividad con anti-suero humano, es resistente a la degradación lisosomal, y muestra una disminución de la toxicidad no específica en modelos de roedores
in vivo
[15-18]. En colaboración con Roche Innovación Centro de Penzberg, Alemania, esta columna vertebral PE24 se ha integrado en una novela RIT antimesotelina, llamado RG7787, vinculándolo a un Fab humanizado anti-mesotelina, lo que aumenta el tamaño y la vida media en circulación [19].
recientemente hemos demostrado que RG7787 tiene una actividad significativa en un modelo de xenoinjerto PDAC, que se estableció mediante el injerto de células KLM-1 en ratones inmunodeficientes. RG7787 también fue citotóxica contra varias otras líneas celulares PDAC, aunque
in vitro
la muerte celular no era en absoluto [19]. Hemos informado anteriormente de que un desequilibrio entre las proteínas pro y anti-apoptóticos protege a las células cancerosas, incluyendo PDAC, de la muerte celular inducida por PE [20-22]. Para conocer otros mecanismos de resistencia, el objetivo de este estudio fue aislar y caracterizar las células de KLM-1 que eran resistentes a la RIT antimesotelina.
Material y Métodos
inmunotoxinas recombinantes y reactivos
clínica grado antimesotelina SS1P y anti-CD25 LMB-2 [anti-Tac (Fv) -PE38] fueron fabricados y suministrados por Advanced BioScience Laboratories, Inc. (Kensington, MD). huSS1 (Fab) -LR-GGS-LO10-PE24 (RG7787) fue suministrado por Roche Innovación Centro de Penzberg, Alemania, bajo un acuerdo de investigación y desarrollo en colaboración (# 2791). Anti-mesotelina SS1 (dsFv) -LR-GGS-PE24 (SS1-LR-GGS) y la inmunotoxina anti-CD71 HB21 (Fv) -PE40 fueron producidas en nuestro laboratorio, de acuerdo con un protocolo estándar [23]. Tanto SS1-LR-GGS y RG7787 se rediseñaron las versiones de bajo inmunogénicas de SS1P que consisten en un fragmento de PE24. Las modificaciones específicas incluyen la eliminación de la mayor parte de dominio II de PE, dejando un sitio de escisión de furina, y la adición de una Gly-Gly-Ser (GGS) basado enlazador péptido después de que el sitio de escisión de furina. RG7787 se optimiza aún más para el uso clínico mediante la sustitución del ratón anti-mesotelina Fv (SS1) con un Fab humanizado (huSS1), para aumentar el tamaño y por lo tanto vida media circulatoria, y mediante la introducción de siete mutaciones (R505A, R427A, R490A, R467A, D463A, R456A, R538A y) en el dominio catalítico III de PE para silenciar a los epítopos de células B [19]. 5-azacitidina (AZA) (Sigma) es un inhibidor de la ADN metiltransferasa, y se disolvió en medio RPMI-1640.
Cultivo de células
línea celular PDAC KLM-1 [24] se mantuvo en RPMI-1640 y proporcionada en 2011 por el Dr. Udo Rudloff (NCI, Bethesda, MD), que originalmente obtuvo la línea celular del banco de células RIKEN. línea celular A431 de cáncer epidermoide se mantuvo en DMEM y donado en 1982 por el Dr. George Todaro (NCI, Bethesda, MD), que aisló originalmente la línea celular [25]. Los medios se suplementaron con 10% de FBS, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen). Para aislar las células resistentes, 3 x 10
5 KLM-1 células fueron sembradas en una placa de 6 pocillos y se incubaron con 1 mg /ml SS1-LR-GGS durante 72 horas, que mataron a más del 90% de las células (S1 Higo.). células residuales se expandieron durante 5 semanas en medio de células RIT-libre, después de lo cual una segunda ronda de selección se realizó de manera similar con 1 mg /ml SS1-LR-GGS, resultando en KLM-1-R. Estas células se expandieron en medio RIT-libre y se almacenan de forma viable congelaron en N
2 para estudios posteriores. identidades de líneas celulares fueron verificadas mediante análisis de repetición en tándem corto (NCI, Frederick, MD). Todas las células se mantuvieron a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO
2.
proliferación celular, la muerte celular y la síntesis de proteínas ensayos de inhibición
KLM-1 y KLM-1 -R crecimiento celular se comparó contando las células viables con una visión Cellometer (Nexcelom). Se excluyeron las células muertas mediante tinción con azul tripán, y cada punto de tiempo se contó por triplicado. Para evaluar el efecto del tratamiento, se añadieron RIT aproximadamente 16 horas después de la siembra de las células en una placa de 6 ó 96 pocillos. La inhibición del crecimiento se evaluó midiendo los niveles de ATP con el título-Glo Luminescent ensayo de viabilidad celular de la célula (Promega). Los valores se normalizaron entre los controles de 1 M estaurosporina (Sigma-Aldrich) y tampón (solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin Ca y Mg (D-PBS), Quality Biological, Inc.) que contiene 0,2% de albúmina de suero humano (División de Recursos Veterinarios, NIH , Bethesda, MD) o medio. De campo claro fotos fueron tomadas en un microscopio Zeiss con un objetivo de 10X CE Plan-Neofluar utilizar la cámara AxioCam MRc y el software de adquisición AxioVision 4.7.2. La muerte celular se evaluó mediante el V-PE Kit Anexina Apoptosis Detección I (BD Pharmingen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se consideraron Anexina V-positivo células apoptóticas, determinado por conmutar los células no tratadas. inhibición de la síntesis de proteínas se cuantificó mediante la medición de [
3H] leucina incorporación (Perkin Elmer) como se ha hecho anteriormente [22]. Los valores se presentan en relación con los controles de D-PBS albúmina de suero humano 0,2% y los controles de 100 mg /ml cycloheximide- (Sigma-Aldrich) tratada.
Real-time RT-qPCR
ARN era aislado y purificado a partir de células utilizando el kit RNeasy (Qiagen), la transcripción inversa se realizó con el kit QuantiTect transcripción inversa (Qiagen), y la amplificación con el kit de PCR verde SYBR QuantiFast (Qiagen). primer secuencias de DPH1-5, DPH7, mesotelina, y β-actina se muestran en la Tabla S1. Real-time RT-PCR cuantitativa se realizó en un ABI 7900 HT máquina de RT-PCR, se analizaron utilizando el comparativo C
método T (ΔΔ
C
T) método con el gestor de SDS (Applied Biosystems) . y normalizado para la endógeno β-actina
expresión de la proteína de superficie por citometría de flujo
Mouse mesotelina anti-humano (MN; Rockland Immunochemicals, Inc.) y R-PE CD71 anti-humano ( Biolegend) se utilizaron para evaluar la expresión de proteína de superficie. Un ratón de control de isotipo IgG-R-PE (BD Biosciences) se utilizó como control negativo para la tinción de mesotelina. Anti-mesotelina y el control de isotipo se tiñeron con un secundario de cabra anti-ratón IgG-R-PE (dilución 1: 250, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). La intensidad de fluorescencia se analizó mediante citometría de flujo en un FACSCalibur. perlas QuantiBRITE R-PE (BD Pharmingen) se utilizaron para cuantificar el número de sitios de unión a mesotelina por célula.
Shed niveles de mesotelina en medio celular
Se midieron los niveles de mesotelina soluble en medio de la línea celular por duplicado con una mesotelina Meso Escala de ensayo (Morphotek, Inc.), utilizando la tecnología de electroquimioluminiscencia de Meso Escala Discovery. Las células se sembraron en medio de cultivo celular regular en una placa de 12 pocillos. Después de 20 horas, se recogieron los medios, se midió el volumen y el número de células por pocillo en cuenta. Después de centrifugar el medio, los sobrenadantes se almacenaron a -80 ° C hasta su análisis. Cell sobrenadante se diluyó 50 veces y se añadió a pocillos de una placa de 96 pocillos previamente recubiertas con anticuerpo de captura. El procedimiento se realizó como se ha descrito anteriormente [26], y las señales se midieron en un MSD Descubrimiento Workbench (Meso Escala Descubrimiento). La cantidad de mesotelina derramada por KLM-1 y KLM-1-R se calcula multiplicando la concentración mesotelina obtenido con el volumen bien, y estandarizada para el número de células contadas por pocillo.
RG7787 captación celular
RIT se marcaron con la Alexa Fluor 647 Labeling Kit (Invitrogen) durante 3,5 horas y se purificaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se incubaron las células recogidas de 30, 75 y 150 min a 37 ° C con una saturación de 2 mg /ml de SS1P-Alexa647 o RG7787-Alexa647 y procesaron como se describe anteriormente [22]. La intensidad de fluorescencia se analizó en un citómetro. La absorción se expresa en número de moléculas RG7787 internalizados, que se calculó suponiendo que la expresión de la superficie media geométrica RG7787-Alexa647 de KLM-1 igual a 60 x 10
3 moléculas RG7787 (= mesotelina superficie sitios por KLM-1 de células de unión, como evaluadas por citometría de flujo y los granos QuantiBRITE R-PE).
el análisis de metilación
Evaluación del estado de metilación de una región en el sitio promotor del gen de mesotelina hecho por EpigenDx (Hopkinton, MA). modificación con bisulfito fue ejecutado utilizando el kit EZ Zymo Investigación La metilación del oro. se utilizó ADN genómico (500 ng) para la modificación con bisulfito, seguido por amplificación por PCR usando Hot-Star Taq polimerasa (Qiagen). Pirosecuenciación se realizó utilizando el sistema PSQ SA 96 pirosecuenciación (Qiagen). La región analizada fue elegido sobre la base de cebadores disponibles (ADS2475-RS1 y RS2-ADS2475) en EpigenDx, que cubría una región de 147 pb aguas arriba del sitio de inicio de transcripción mesotelina (chr16: 808.890 a 808.742; ENST00000563941). La metilación cuantificación se realizó con software PyroQCpG, que calcula para cada solo CpG la relación entre su forma metilada y no metilada, lo que resulta en el porcentaje promedio de grado de metilación.
mesotelina transfección en KLM-1-R
células KLM-1-R se transfectaron por Lipofectamine (Invitrogen) con pcDNA3.1 control (+) (Invitrogen) o pMH107, un vector pcDNA3.1 (+) con ADNc de longitud completa mesotelina y geneticina como marcador seleccionable [27]. Las células fueron transfectadas durante tres días, seleccionado con 6 mg /ml de geneticina, y se mantuvieron en medio RPMI normal con 3 mg /ml de geneticina. Una sola célula de la clasificación con un FACSVantage SE (BD Biosciences) y la posterior expansión posterior dio lugar a la línea celular monoclonal KLM-1-R-
Msln con descuento que altamente homogénea y expresa la mesotelina sobre su superficie.
inducida por toxina ADP-ribosilación de EF-2
Las células se lisaron en tampón RIPA con inhibidores de proteasa (Roche Applied Science), y 3 g de lisado de células se incubaron con tampón de ADP-ribosilación [20 mM Tris-HCl (pH 7,4), EDTA 1 mM, y DTT 50 mM], 5 mM 6-biotina-17-NAD (Trevigen) y 10 ng de RG7787 para varios puntos de tiempo a 25 ° C. Las muestras se sometieron a SDS /PAGE seguido de transferencia Western con estreptavidina HRP conjugado (Invitrogen) para detectar biotina ADP-ribosylated EF-2.
Western blot
Las células se recogieron, se lavaron con D- PBS, y se solubilizaron en tampón RIPA con inhibidores de proteasa (Roche Applied Science). Las concentraciones de proteína se determinaron usando un kit Coomassie Plus (Pierce). Igual cantidad de proteína se cargaron en NuPAGE 4% -12% en geles de Bis-Tris (Invitrogen) para SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Invitrogen). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-ratón MN (Rockland), de conejo anti-EF-2#ab33208 (Abcam) y el ratón anti-β-actina#8226 (Abcam). ratón anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Santa Cruz Biotechnology) se visualiza con ECL o ECL Plus sustratos (GE Healthcare). EF-2 niveles de proteína se cuantificaron y se ajustan para β-actina con la imagen J [28].
ARN secuenciación de profundidad y análisis de datos
ARN total fue extraído de KLM-1 y KLM-1 células -R utilizando digestión del ADN kit RNeasy de Qiagen, y en columna (Qiagen) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después del control de la calidad del ARN con un Bioanalyzer Agilent, muestras de ARN total fueron enviados a la construcción de la biblioteca y la secuenciación de profundidad a la facilidad de la base NCI (Bethesda, MD). Las secuencias primas fueron de calidad controlados y alineados con RefSeq [29]. los recuentos en bruto se normalizaron y se carga en Qlucore ómicas Explorador v_3.0 (35) para el análisis de expresión diferencial. De aplicar el filtro de varianza Qlucore, se generó una lista de los 989 genes modificados los más significativamente que separamos en los genes regulados hacia arriba y hacia abajo.
conjunto de genes de enriquecimiento de análisis gratis (GSEA) La alineación se realizó desde dentro Qlucore. Para la alineación a Gene ontología (GO), Kyoto Enciclopedia de genes y genomas (KEGG) - y Reactome-vías, la lista de genes arriba y hacia abajo reguladas se cargó en string-db.org [30] y los valores de p de se extrajeron los conjuntos de datos con cambios significativos.
El análisis estadístico
Los experimentos se suelen llevar a cabo de forma independiente al menos dos veces, y se muestran los datos representativos o medios. Los datos se presentan como media ± error estándar de medición de replicar los experimentos. estadística aplicada incluyen pruebas t de Student o ANOVA de una vía con pruebas de comparación múltiple de Tukey. El análisis estadístico y la figura de redacción se realizó utilizando GraphPad PRISM 6 (GraphPad Software, Inc). Un
p-valor
de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo, a menos que se indique lo contrario.
Resultados
células KLM-1 aislados después de SS1-LR-GGS de incubación son resistentes a RIT antimesotelina
Tal como se describe en la sección Métodos, células KLM-1 fueron expuestos de forma intermitente con SS1-LR-GGS y las células supervivientes (KLM-1-R) se expandieron en un medio libre de RIT. Las células-R-KLM KLM 1-1 y no se distinguían por microscopía de campo claro (Figura S2A.) y en la citometría de flujo dispersión frontal y lateral, lo que indica un tamaño de celda similar y granularidad (S2 B Fig.). La proliferación celular se comparó mediante la siembra de 1 x 10
5 células en el día 0, y el recuento de células viables al día durante 6 días. Las células-R-KLM 1 crecieron significativamente más rápido que las células KLM-1 desde el día 2 en (
p Hotel & lt; 0,0001) (Figura S2C.). Para evaluar el nivel de resistencia, KLM-1 y KLM-1-R se incubaron las células durante 72 horas con RIT anti-mesotelina. los ensayos de viabilidad de ATP mostraron que las células KLM-1 eran sensibles a SS1-LR-GGS (IC
50 = 1,73 ± 0,01 ng /ml) y RG7787 (IC
50 = 4,41 ± 0,38 ng /ml), de acuerdo con resultados anteriores [19]. En contraste, las células KLM-1-R fueron altamente resistentes a ambos RIT (IC
50s & gt; 1 mg /ml) (Fig 1A.) Y SS1P (datos no mostrados). En las células resistentes, se produjo una pequeña disminución en la proliferación de células a concentraciones por encima de un RIT 100 ng /ml. Como control, se ensayó la actividad de LMB-2, un anti-CD25 RIT [31] que no se une células KLM-1, y observó una disminución no específica a 1 mg /ml LMB-2. Esto indica que la disminución en 1 mg /ml en RG7787 KLM-1-R se podría atribuir a la absorción no específica (Fig. 1A). La resistencia establecido era estable; no se observó cambio cuando las células KLM-1-R fueron en cultivo RIT-libre para varios meses (datos no mostrados). Debido a que los ensayos de ATP no pueden diferenciar entre la detención del crecimiento celular y la muerte celular [32], se evaluó la respuesta con el kit Annexin V-PE de detección de apoptosis. En contraste con KLM-1 (
p
& lt; 0,0001), las células KLM-1-R no mostraron apoptosis o limitado cuando se trataron durante 72 horas con 100 ng /ml (
p = 0,33
) o 1 mg /ml RG7787 (
p
= 0,02), en comparación con las células no tratadas (Fig. 1B). Estos datos confirman que las células KLM-1-R son altamente resistentes a la actividad de la muerte celular de RIT anti-mesotelina
A:. Células resistentes KLM-1 (KLM-1-R) KLM-1 y se incubaron durante 72 horas con el anti-mesotelina SS1-LR-GGS, RG7787 o anti-CD25 LMB-2 como control. La inhibición del crecimiento se evaluó con un ensayo de viabilidad celular ATP. Con IC
50 por debajo de 10 ng /ml, KLM-1 es sensible a la RIT anti-mesotelina, que no es el caso para KLM-1-R (IC
50 & gt; 1 mg /ml). 1 mg /ml LMB-2 disminuyó la viabilidad celular, lo que indica que esta concentración RIT induce la absorción no específica. B: células KLM-1 y KLM-1-R se incubaron durante 72 horas con 100 o 1000 ng /ml RG7787. La apoptosis se evaluó con la anexina V-PE Apoptosis Detección Kit I. RG7787 induce un aumento significativo de las células apoptóticas KLM-1, mientras que las células KLM-1-R no muestra un incremento significativo en la apoptosis. C: células KLM-1 y KLM-1-R se incubaron durante 72 horas con HB21 (Fv) -PE40. La inhibición del crecimiento se evaluó con un ensayo de viabilidad celular ATP. Ambas líneas celulares son altamente sensibles a este RIT.
Resistencia en células KLM-1-R es específico de RIT antimesotelina
Para evaluar si la resistencia en KLM-1- R también se aplica a RIT dirigidos contra otros receptores en las células-R KLM-1, hemos probado HB21 (Fv) -PE40 que se dirige a CD71 [33]. CD71 se expresa en la superficie en un nivel similar en KLM-1 y KLM-1-R (datos no mostrados), y las dos líneas celulares tenían una sensibilidad similar a HB21 (Fv) -PE40 después de una incubación de 72 horas (Fig. 1C). Para evaluar la sensibilidad a otros agentes terapéuticos, las células también se trataron durante 72 horas con paclitaxel, un inhibidor mitótico, y gemcitabina, un análogo de nucleósido. Ensayos de viabilidad no mostraron diferencias en la sensibilidad a paclitaxel entre KLM-1 y KLM-1-R (IC
50 KLM-1 = 3,0 ± 1,6 ng /ml vs. IC
50 KLM-1-R = 3,7 ± 1,7 ng /ml) (
p
= 0,80). KLM-1-R (IC
50 = 44,2 ± 5,7 ng /ml) fue 3 veces menos sensible a la gemcitabina de KLM-1 (IC
50 = 15,2 ± 1,9 ng /ml) (
p
= 0,04), que es mucho menos pronunciada que la resistencia a RG7787. Estos resultados muestran que la resistencia en KLM-1-R no es general y, por tanto, específica para RIT anti-mesotelina.
expresión mesotelina y la absorción RG7787 disminuye en KLM-1-R
La primer paso en el mecanismo de acción RIT es vinculante para el antígeno de superficie celular específico seguido de RIT internalización. expresión de la superficie La mesotelina, como se evaluó por citometría de flujo, fue 4,9 ± 0,5 veces menor en KLM-1-R (12 x 10
3 sitios por célula) en comparación con KLM-1 (60 x 10
3 sitios por de células) (Fig. 2A). Flujo indicado citometría de una población homogénea de células KLM-1-R, lo que sugiere una disminución uniforme en la expresión de superficie de mesotelina. Análisis de las células A431 mesotelina negativos y uso de un anticuerpo de control de isotipo confirmó que la señal de mesotelina en células KLM-1-R era específica. Como era de esperar, transferencias Western mostraron que las células KLM-1 contenían una banda principal de mesotelina madura a 37 kDa y una banda precursora más débil a 72 kDa. Las células resistentes tenían pequeñas cantidades de mesotelina madura, pero el precursor no se detectó, probablemente debido a su baja abundancia (Fig. 2B). El exceso de derramamiento de mesotelina en KLM-1-R podría ser responsable de los bajos niveles superficiales mesotelina. Usando la escala de ensayo Meso, encontramos que arrojar mesotelina fue 4,8 ± 0,03 veces menor en los medios de KLM-1-R (40,7 ± 5,3 pg /10
5 células) en comparación con KLM-1 (149,0 ± 23,4 pg /10
5 células). En medio sin células (control negativo), no se detectó la mesotelina. Estos datos son consistentes con la diferencia en los niveles de superficie e indican que la baja mesotelina en KLM-1-R no se debe a la mayor difusión. Para determinar si la mesotelina disminución fue debido a la menor mRNA, se realizó RT-PCR y encontramos que el ARN mesotelina fue 7,3 ± 4,3 veces menor en KLM-1-R (C
T = 24,1 ± 0,09) en comparación con KLM-1 (C
T = 21,54 ± 0,73). Para evaluar si la mesotelina que queda en la superficie de KLM-1-R podría obligar a internalizar RIT antimesotelina, se evaluó la internalización celular de la RG7787-Alexa647. La captación por KLM-1-R aumentó con el tiempo, pero fue significativamente menor que KLM-1 en cada punto de tiempo (de 4 a 5 veces,
p
& lt; 0,01). Después de 150 minutos de incubación, por ejemplo, KLM-1 internalizado aproximadamente 40 x 10
moléculas 3 RG7787, en comparación con sólo 8 x 10
3 en KLM-1-R (Fig. 2C). Estos datos demuestran que las células KLM-1-R tienen una baja regulación parcial en la mesotelina y por lo tanto internalizan significativamente menos RG7787, proporcionando una posible explicación para la resistencia observada
A:. Mesotelina niveles superficiales se 5 veces menores en resistente KLM-1 (KLM-1-R) en comparación con KLM-1. La mesotelina expresión de KLM-1, KLM-1-R y células A431 mesotelina negativo (control negativo) se evaluaron mediante citometría de flujo. histogramas llenos son controles de anticuerpos secundarios. B: nivel de proteína mesotelina entera se redujo en KLM-1-R. Precursor (72 kDa) y mesotelina madura escindida (37 kDa) estaban presentes en KLM-1. En KLM-1-R, se detectó la porción escindida en niveles bajos. Los niveles de proteína se probaron en no tratado KLM-1 y lisado celular por transferencia Western-R KLM-1. ß-actina actúa como control de carga. C: En cada punto de tiempo, la captación celular de RG7787-Alexa647 en KLM-1 es significativamente mayor que en KLM-1-R, y significativamente más bajo que en KLM-1-R-
Msln
(transfectadas con mesotelina ). La captación se evaluó a los 30, 75 y 150 min. la intensidad de fluorescencia media geométrica promedio convierten en cantidad de moléculas RG7787.
AZA restaura parcialmente la expresión en la superficie de mesotelina en KLM-1-R con un efecto limitado sobre la sensibilidad a la RG7787
expresión
La mesotelina puede ser silenciado por la metilación del ADN de los sitios CpG en su región promotora [34-37]. AZA, un inhibidor de la ADN metiltransferasa, puede revertir tales hipermetilación. Dimos células 500 nM AZA al día durante 3 semanas, y se encontró que la expresión de la mesotelina se incrementó en KLM-1-R (KLM-1-R-AZA) por alrededor de 3 veces, hasta 34 x 10
3 sitios por celular, que es todavía menor que el 60 x 10
3 sitios por célula en KLM-1 (Fig. 3A). AZA mejoró la sensibilidad a la RG7787 en KLM-1 y KLM-1-R, aunque este último se mantuvo altamente resistente después de una incubación de 72 hr (IC
50 = 722.4 ± 232.6 ng /ml) (Fig. 3B). Estos datos enlazan mesotelina baja regulación de la hipermetilación
A:. AZA conduce a un aumento de 2,8 veces de la expresión superficial de mesotelina resistentes KLM-1 (KLM-1-R). La citometría de flujo histograma de KLM-1, KLM-1-R, y KLM-1-R-AZA. histogramas rellenos representan los controles de anticuerpos secundarios. B: Tres semanas de incubación con AZA, un inhibidor de la ADN metiltransferasa, aumenta la sensibilidad a la RG7787. las células tratadas con AZA KLM-1, KLM-1-R, y (KLM-1-AZA y KLM-1-R-AZA) se trataron durante 72 horas con RG7787. La inhibición del crecimiento se evaluó con un ensayo de viabilidad celular ATP. Las líneas de puntos representan las células tratadas con AZA. C: CpG en una región aguas arriba del sitio de inicio de transcripción mesotelina son más metilado en KLM-1-R que en KLM-1. Tres semanas de incubación con AZA disminuye la metilación en células KLM-1-R. La región analizada se encuentra en chr16: desde 808.890 hasta 808.742 y se extiende 147 pb y siete CpG. D: transfección mesotelina en KLM-1-R da como resultado la sobreexpresión significativa de mesotelina en comparación con KLM-1 (5 veces) y KLM-1-R (23 veces). La citometría de flujo niveles de mesotelina superficie de KLM-1, KLM-1-R y las células resistentes a la mesotelina transfectadas (KLM-1-R-
Msln
). E: La mesotelina sobreexpresión de KLM-1-R restaura la sensibilidad RG7787. KLM-1 y KLM-1-R-
se incubaron Msln
células durante 72 horas con RG7787. La inhibición del crecimiento se evaluó con un ensayo de viabilidad celular de ATP.
CpG en la región promotora mesotelina se hypermethylated en KLM-1-R
Para confirmar que el gen de mesotelina es de hecho sujeta a la hipermetilación KLM en-1-R, se realizó un análisis exploratorio del estado de metilación de CpG siete en la región promotora mesotelina (chr16: 808.890 hasta 808.742 mil., S3 figura) usando la secuenciación de bisulfito. Esta región de 147 pb sitio fue seleccionado sobre la base de los iniciadores disponibles en EpigenDx. Los resultados demostraron que estos CpG tenían una metilación significativamente mayor en KLM-1-R (59 ± 3,6%) en comparación con KLM-1 (41 ± 4,8%) (
p
& lt; 0,05) (Fig. 3C) . El tratamiento con AZA llevó a los niveles de metilación en KLM-1-R de nuevo a las de KLM-1 (p & gt; 0,05). Estos datos apoyan, además, que la regulación negativa de mesotelina en KLM-1-R se asocia con la hipermetilación del gen de mesotelina.
La sobreexpresión de mesotelina en KLM-1-R restaura la sensibilidad a la RG7787
Para restaurar la mesotelina expresión en KLM-1-R, que introdujo la mesotelina de longitud completa de cDNA (KLM-1-R-
Msln
). expresión de mesotelina de la superficie de KLM-1-R-
Msln
era 22,6 ± 5,3 veces mayor que la de KLM-1-R, y superó la expresión original en KLM-1 por 5,3 ± 1,3 veces, lo que resulta en aproximadamente 300 x 10
3 puntos por célula (Fig. 3D). Como consecuencia, la absorción de RG7787-Alexa647 en KLM-1-R-
Msln
en cada punto de tiempo fue significativamente mayor que en KLM-1 (de 5 a 10 veces,
p
& lt; 0,05) y KLM-1-R (de 24 a 46 veces,
p
. & lt; 0,001) (Fig 2C). Después de una incubación de 72 h, RG7787 tenía una IC similares
50 en KLM-1-R-
Msln
(4,49 ± 1,11 ng /ml) como en KLM-1 (4,41 ± 0,38 ng /ml) (
p
= 0,80). Sin embargo, KLM-1-R-
Msln
fue más sensible que KLM-1 a concentraciones RG7787 más altas, con la disminución de la viabilidad celular a cero a 100 ng /ml (Fig. 3E). Introducción de pcDNA3.1 control (+) no tuvo ningún efecto sobre los niveles de mesotelina o resistencia a RG7787 (datos no mostrados). Estos datos confirman que la resistencia en KLM-1-R está vinculada a una disminución de la mesotelina. Con el fin de lograr un nivel similar de sensibilidad a RG7787 ve en KLM-1, KLM-1-R requiere niveles de mesotelina significativamente más altos que KLM-1. Este descubrimiento sugiere que la resistencia también podría estar vinculado con el tráfico ineficiente de RG7787 al citosol, o que la inhibición de la síntesis de proteínas se ve afectada de KLM-1-R.
inhibición de la síntesis de proteínas por RG7787 está limitado en KLM-1- R, EF-2 ADP ribosilación está intacto
inhibición de la síntesis de proteínas se inicia después de que los tráficos de la toxina de la superficie de la célula al citosol y la inactiva EF-2 por ADP-ribosilación. células KLM-1 se incubaron con RG7787 durante 16 horas, y KLM-1-R células durante 16 y 48 horas, después de lo cual la síntesis de proteínas fue examinado por la medición [
3H] leucina incorporación (Fig. 4A). Después de 16 hrs, RG7787 indujo una disminución dependiente de la dosis en la síntesis de proteínas en KLM-1, pero no en KLM-1-R.