Extracto
Hay una tendencia cada vez mayor para los investigadores a utilizar
in vitro
modelos 3D en estudios de cáncer, ya que pueden recapitular mejor la compleja
in vivo
situación. Y el hecho de que la progresión y el desarrollo de tumores están estrechamente asociados a su microambiente estromal ha sido cada vez más reconocido. El establecimiento de tales nicho de apoyo tumor es vital en el progreso comprensión del tumor y la metástasis. El origen mesenquimal de muchas células que residen en el nicho de cáncer se exponen las razones para incluir en las MSC imitando el nicho en el neuroblastoma. Aquí nosotros co-encapsulado y co-cultivo NBCs y MSC en un 3D
in vitro
modelo e investigar la morfología, la cinética de crecimiento y remodelación de la matriz en el entorno del estroma reconstituido. Los resultados mostraron que la incorporación de las MSC en el modelo de conducir a un crecimiento acelerado de las células cancerosas, así como recapitulación de al menos parcialmente el microambiente tumoral
in vivo
. Por tanto, el presente estudio demuestra la viabilidad de la microesfera colágeno para actuar como un 3D
in vitro
modelo de cáncer por varios temas en los estudios de cáncer
Visto:. Yeung P, Sin SA, Chan S, Chan GCF, Chan BP (2015) La microencapsulación de células de neuroblastoma y células mesenquimales estromales en microesferas de colágeno: un modelo 3D para el Estudio del lugar de Cancer Cell. PLoS ONE 10 (12): e0144139. doi: 10.1371 /journal.pone.0144139
Editor: Stan Gronthos, La Universidad de Adelaide, AUSTRALIA
Recibido: 21 Agosto, 2015; Aceptado: 14 Noviembre 2015; Publicado: December 14, 2015
Derechos de Autor © 2015 Yeung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el uso de cultivos en monocapa 2D de líneas celulares de cáncer como un modelo simple para estudiar la investigación del cáncer se puede remontar de nuevo a la década de 1950 [1, 2]. Sin embargo, similar a los tejidos sanos, los tejidos tumorales son entidades 3D con células, matriz extracelular y otros microambiente. Hasta la fecha, se acepta en general que la cultura línea celular monocapa no representa correctamente el
in vivo
fenómeno [3], donde existen célula-célula y célula-matriz interacciones, lo que limita su capacidad para predecir la respuesta de las células cancerosas en la realidad [4].
en los últimos años, hay una tendencia creciente para los investigadores a utilizar
modelos in vitro
3D en estudios de cáncer [3, 5, 6] sobre temas tales como microambiente tumoral [7], angiogénesis [8] y la metástasis [9]. Estos modelos incluyen esferoides [10] y [11 microesferas, 12]. Apoyan co-cultivo de múltiples tipos de células, permite célula-célula y célula-matriz de interacciones, y así preservar mejor los
in vivo
características del tejido tumoral. Algunos modelos son capaces de establecer la diversidad estructural de los tejidos tumorales con zonas de la proliferación de células quiescentes, o necróticas [4]. La capacidad de estos modelos en 3D para incluir múltiples factores de nicho permite la recapitulación parcial y semejanza de la
in vivo
microambiente de las células del cáncer [4, 13, 14], que contribuyen a modelar la enfermedad tumoral y personalizada en el cribado de la quimioterapia a largo plazo.
Los tumores son órganos no homogéneas, pero los tejidos muy complejos que implican diversos tipos de células incluyendo pero no limitado a las células cancerosas, células progenitoras cáncer, células endoteliales, células inflamatorias y fibroblastos asociados con el cáncer [3, 15 a 17 ]. Aparte de las células proliferantes neoplásicas del parénquima (células cancerosas), el estroma de apoyo formados por células de origen mesenquimal podría ser responsable de la mitad de la masa del estroma [3]. La progresión del cáncer no depende únicamente de las células cancerosas, pero también en las células del estroma que residen en el microentorno del tumor [18, 19]. Se ha demostrado que las células madre mesenquimales (MSC) multipotentes residen en tejidos adultos [20, 21]. A pesar de que si estas células se originan en la médula ósea sigue siendo controvertido, pero la estrecha semejanza de MSC con pericitos lo largo de la pared de los vasos sanguíneos que proporcionan otra explicación atractiva [22, 23]. evidencias crecientes muestran que el cáncer de estroma asociado particularmente células fibroblásticas aceleran el crecimiento del tumor [3] y promovieron un microambiente permisiva para la metástasis del cáncer [24, 25]. Algunos hallazgos indican que las células madre mesenquimales (MSC) puedan transitar desde la médula ósea de tumor durante el desarrollo del tumor [26-29]. Sin embargo, el papel de MSC en la tumorigénesis sigue siendo controvertida [26, 30-33]. Una noción bien conocida es que, la interacción heterotípica entre múltiples tipos de células es necesaria para la semejanza exacta de
in vivo
respuestas. Con el fin de lograr este objetivo, los modelos 3D que permiten interacciones entre múltiples tipos de células son atractivos en el estudio de tales interacciones complicadas.
Hemos establecido previamente una plataforma de microencapsulación de colágeno, que atrapa las células vivas dentro de una malla de colágeno reconstituido nanofibras [34 ]. La malla de colágeno es biocompatible, proporcionando un microambiente fisiológicamente relevante permisiva para la unión celular, la proliferación, la migración y la diferenciación en una amplia gama de células, incluyendo las MSC [34-37], células HEK293 [38], las células madre embrionarias [39], [condrocitos ,,,0],40], células de núcleo pulposo [41] y los osteoblastos [42]. Una ventaja importante del modelo de microencapsulación de colágeno es el hecho de que la malla de colágeno plantilla apoya remodelación de la matriz, que se refiere a la degradación simultánea y la deposición de matriz extracelular, cuando el cultivo de células maduras y diferenciar células madre en 3D. Esto justifica fuertemente su utilidad en la actuación como un modelo de recapitular el
in vivo
microambiente celular durante la formación de tejido estructural y funcional. Una segunda ventaja importante de la microencapsulación de colágeno es sus controlables y miniaturizados (cientos de micras de diámetro) tamaño [34] que un micro-tejido consta de varios cientos de células permite la capacidad sobre el cribado del rendimiento económico, personalizado y alto.
el neuroblastoma (NB) es un cáncer pediátrico que representa el 6% de todos los tumores malignos que se encuentran en los niños [43]. NB microambiente consta de matriz extracelular, fibroblastos del estroma, células vasculares y células inmunes [3]. Específicamente, los fibroblastos del estroma se ha demostrado que aumentar el crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis [44, 45]. Los informes también muestran que el co-cultivo de las células de neuroblastoma (CNB) con otro tipo de células podría conducir a comportamientos significativamente diferentes. Por ejemplo, sin contacto co-cultivo de la NBC con hepatocitos conduce a una menor actividad de la apoptosis y la más alta expresión del VEGF [46, 47]. En otro ejemplo, co-cultivo de NBCs con HUVEC reduce la detectabilidad de las células cancerosas a los neutrófilos [48]. Por otra parte, se ha demostrado cruzadas conversaciones entre las células de Schwann NBCs y para estimular la diferenciación NB, la reducción de la agresividad del tumor [49, 50] luces vertimiento sobre nuevas estrategias terapéuticas. Por otro lado, algunos informes han demostrado que la presencia de MSC aumentaría la invasividad de neuroblastoma [27, 51, 52]. Aunque el papel del MSC en neuroblastoma no se conoce completamente, la presencia de MSC da lugar a un cambio de comportamiento en NBCs. Mientras tanto, a pesar de todos estos estudios han demostrado que NBCs interactúan activamente con otros tipos de células, estos experimentos se llevaron a cabo todos en modelos 2D. Un modelo 3D permisivo para el crecimiento y la proliferación NBCs, así como las interacciones con las células del estroma aún no ha sido reportado. En este estudio, la hipótesis de que el co-microencapsulación de la NBC con las MSC en microesferas de colágeno hará una recapitulación, al menos parcialmente, el microambiente tumoral
in vivo
. En concreto, se puede investigar la morfología, la cinética de crecimiento y remodelación de la matriz en el entorno de co-microencapsulación.
El neuroblastoma (NB) es un cáncer pediátrico que representa el 6% de todos los tumores malignos que se encuentran en los niños [43]. NB microambiente consta de matriz extracelular, fibroblastos del estroma, células vasculares y células inmunes [3]. Específicamente, los fibroblastos del estroma se ha demostrado que aumentar el crecimiento tumoral, la angiogénesis y la metástasis [44, 45]. Los informes también muestran que el co-cultivo de las células de neuroblastoma (CNB) con otro tipo de células podría conducir a comportamientos significativamente diferentes. Por ejemplo, sin contacto co-cultivo de la NBC con hepatocitos conduce a una menor actividad de la apoptosis y la más alta expresión del VEGF [46, 47]. En otro ejemplo, co-cultivo de NBCs con HUVEC reduce la detectabilidad de las células cancerosas a los neutrófilos [48]. Por otra parte, se ha demostrado cruzadas conversaciones entre las células de Schwann NBCs y para estimular la diferenciación NB, la reducción de la agresividad del tumor [49, 50] luces vertimiento sobre nuevas estrategias terapéuticas. Por otro lado, algunos informes han demostrado que la presencia de MSC aumentaría la invasividad de neuroblastoma [27, 51, 52]. Aunque el papel del MSC en neuroblastoma no se conoce completamente, la presencia de MSC da lugar a un cambio de comportamiento en NBCs. Mientras tanto, a pesar de todos estos estudios han demostrado que NBCs interactúan activamente con otros tipos de células, estos experimentos se llevaron a cabo todos en modelos 2D. Un modelo 3D permisivo para el crecimiento y la proliferación NBCs, así como las interacciones con las células del estroma aún no ha sido reportado. En este estudio, la hipótesis de que el co-microencapsulación de la NBC con las MSC en microesferas de colágeno hará una recapitulación, al menos parcialmente, el microambiente del tumor in vivo. En concreto, se puede investigar la morfología, la cinética de crecimiento y remodelación de la matriz en el entorno de co-microencapsulación.
Métodos
cultivo de células de neuroblastoma
línea celular de neuroblastoma fue una especie de regalo NKV del Dr. Cheung del Memorial Sloan Kettering Cancer Center, EE.UU.. Las células se cultivaron a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alta glucosa (Gibco), con suplementos de 10% de suero bovino fetal (Gibco), 1% penicilina estreptomicina (Gibco), 1% glutar-max (Gibco).
madre mesenquimales /células del estroma (MSC) cultura y
MSC humanas de la médula ósea [53] fueron amablemente proporcionados por el Prof. GCF Chan, Departamento de pediatría y del Adolescente Medicina de la Universidad de Hong Kong y se cultivaron como monocapas como se describe anteriormente [53]. El actual protocolo ha sido aprobado por el Comité de Ética Clínica combinada de la Universidad de Hong Kong y Hong Kong West Hospitales racimo de Dirección de Hospitales. En breve, las MSC se cultivaron a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora en DMEM con bajo nivel de glucosa (Gibco), con suplemento de 10% de suero bovino fetal (Gibco), 1% penicilina estreptomicina (Gibco) y 1 % glutar-max (Gibco). El medio de cultivo fue reemplazado cada 3-4 días. En torno al 80% de confluencia, las hMSC se aislaron por tripsinización con tripsina-EDTA (1X) (Gibco) brevemente 0,05% antes de volver a suspender en medio completo para experimentos posteriores. Las células en P6 fueron utilizados para experimentos posteriores.
El colágeno microencapsulación
Las células fueron microencapsulados como se informó anteriormente [34]. En breve, hMSC y NBCs se cultivaron a sub-confluencia y luego se separaron por tratamiento NBCs y MSCs con 0,25% y 0,05% de EDTA tripsina (1X) (Gibco) durante 5 minutos. NBCs y MSCs se mezclaron a diferentes relaciones predeterminadas (NBCs: 100, 80, 50, 20 y 0%) antes de la microencapsulación. Tipo de cola de rata colágeno I (Becton Dickenson Biosciences, Bedford, MA) se neutralizó mediante NaOH 0,1 N y se diluyó en diferentes concentraciones finales (0,5, 1 y 2 mg /ml). mezclas de células se suspendieron en solución de colágeno neutralizado para compensar mezclas célula-matriz con diferentes densidades celulares finales (2.5x10e5, 5x10e5 células /ml y 1x10e6 células /ml, equivalente a 1250, 2500 y 5000 células /gotita 5μl, respectivamente). gotitas de líquido de las mezclas célula-matriz se dispensaron sobre una superficie no adhesiva, que es Parafilm irradiados con UV en un 90-mm de diámetro Petri plato (Sterilin, Londres, Reino Unido), y después se incubaron a 37 ° C con 5% de CO
2 durante 45 minutos para inducir la gelificación. microesferas de colágeno gelificado que contienen tanto la NBC y MSC en relaciones predeterminadas se lavaron suavemente con un medio de co-cultivo en una placa de Petri para cultivos en suspensión de libre flotación de distinta duración (7, 14 y 21 días). Un total de 100 microesferas se cultivaron en cada placa de Petri. El medio de co-cultivo se mezcló por medio de cultivo NBC y MSC de acuerdo con la relación de encapsulación de células, que se repone cada 2-3 días.
Medición de la dimensión de las microesferas célula-matriz
El temporal el cambio morfológico de las microesferas NBC-MSC-colágeno se registró bajo un microscopio de contraste de fase de hasta 21 días. Los diámetros de aproximadamente 10% de las poblaciones de microesferas fueron seleccionados al azar y se miden usando un micrómetro ocular.
cinética de crecimiento de las células
Cada 200 microesferas se encapsulan con 2.5e5 células con diferente NBC : Índices de MSC en el día 0, y se cultivaron durante 7, 14, y 21 días. En cada punto de tiempo, a 200 microesferas de cada grupo fueron digeridos enzimáticamente por la colagenasa de Clostridium histolyticum (Sigma) a 200 unidades /ml durante 45-60 min. suspensiones de células individuales se obtuvieron mediante el tratamiento de los agregados digerido con 0,25% de tripsina-EDTA (1X) (Gibco) antes de numeración por el ensayo de azul de tripano. El crecimiento de células en microesferas podría entonces ser calculada.
Citometría de flujo El análisis de la proporción de NBCS
suspensiones de células individuales (1x10e6 células) obtenido a partir de la digestión con colagenasa-tripsina de la NBC-MSC- microesferas de colágeno se resuspendieron en 500 l de medio de co-cultivo, se incubaron a temperatura ambiente durante una hora para permitir la recuperación de la expresión de la proteína de la superficie celular, y luego se fijaron por 0,01% PFA durante 15 minutos. Las células fueron bloqueadas por 2% de suero de cabra (Vector Laboratories) en PBS durante 30 minutos antes de la tinción indirecta de anticuerpos. Para cada muestra, 1μl de anticuerpo monoclonal de ratón contra Neuroblastoma (NB84a, Abcam) en suero de cabra al 2% (dilución 1: 100) se añadió. controles de isotipo (anticuerpo IgG de ratón normal, Millipore) se realizaron en cada punto de tiempo. Después de la tinción a temperatura ambiente durante 30 minutos, 1 ml de PBS se añadió a cada tubo para lavar el exceso de anticuerpos. Después de centrifugación a 2000 rpm durante 5 min, se retiró el sobrenadante y 0.5μl de Alexa Fluor 647 cabra anti-ratón anticuerpo secundario (Invitrogen) en suero de cabra al 2% (dilución 1: 200) se añadió a cada muestra. Después de la tinción en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos, 1 ml de PBS se añadió a cada tubo para lavar el exceso de anticuerpos. Después de centrifugación a 2000 rpm durante 5 min, se retiró el sobrenadante y los sedimentos celulares se resuspendieron y se conserva en 500μl 1% PFA a una densidad celular no menos de 4x10e5 células /ml para citometría de flujo análisis en FACSCanto II citómetro de flujo (BD Biosciences, Bedford , MA). Se analizaron 10.000 acontecimientos de cada muestra. Los resultados se analizaron con un chorro de software 2.5.1.
Histología e inmunohistoquímica de microesferas NBC-MSC-colágeno
microesferas NBC-MSC-colágeno se fijaron en PFA al 4% a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 minutos y se deshidrataron mediante un tratamiento con etanol gradiente de serie antes de procesamiento para las secciones de parafina de espesor 5μm. hematoxilina de rutina y eosina (Sigma) se llevó a cabo para revelar la morfología celular en las microesferas. Para evaluar la presencia de la NBC, un anticuerpo primario (ab49501, Abcam) se utilizó. Se utilizó anti-anticuerpo secundario del ratón (BA-1000, Vector Laboratories) en inmunohistoquímica, seguido de tinción ABC, etiquetado diaminobencidina, y counterstaining utilizando hematoxilina. Para evaluar la presencia de colágeno de tipo I, un anticuerpo primario (C2456, Sigma), fue utilizado. Se utilizó anti-anticuerpo secundario del ratón (BA-1000, Vector Laboratories) en inmunohistoquímica, seguido de tinción ABC, etiquetado diaminobencidina, y counterstaining utilizando hematoxilina. Para evaluar la presencia de Matrix-metaloproteinasa 9, un anticuerpo primario (ab38898, Abcam) se utilizó. Anti-anticuerpo secundario de conejo (BA-2000, Vector Laboratories) se utilizó en la inmunohistoquímica, seguido de tinción ABC, etiquetado diaminobencidina, y counterstaining utilizando hematoxilina.
Análisis de datos y estadísticas
Los resultados cuantitativos incluidos dimensión microesfera, el número de células y las proporciones de NBC se presentaron como media ± desviación estándar si no se indica lo contrario. ANOVA de dos vías con las pruebas post hoc apropiado se utilizaron para revelar diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes grupos. El nivel de significación se fijó en 0,05 y SPSS 19.0 (IBM, NY, EE.UU.) se utilizó para ejecutar a un análisis estadístico.
Resultados
Caracterización morfológica de microesferas NBC-MSC-colágeno
la figura 1A1-1E6 muestra el aspecto macroscópico de microesferas NBC-MSC-colágeno en diferentes grupos. Las apariciones esféricas fueron similares en el comienzo del cultivo, pero se convirtieron en diversa en una fase posterior, como microesferas en grupos con mayor proporción inicial NBC pierden gradualmente su forma esférica y se convirtieron irregular en la conformación, lo que sugiere el crecimiento excesivo. Durante el cultivo, se observaron pequeñas micro-masas en suspensión en NBC 100%, 80% y 50% de grupos después de la primera semana. Mientras que en el grupo NBC 20%, masas observables aparecieron después de la segunda semana. El grupo NBC el 80% tenían relativamente mayor cantidad de micro-masas que en otros grupos. No hubo crecimiento excesivo de microorganismos masas en el grupo 0% NBC (100% del grupo MSC). Fig 1F muestra el cambio en la dimensión de las microesferas durante el cultivo. Había contracción significativa de las microesferas en la primera semana para todos los grupos, seguido por aumentos de diámetro en todos los grupos de células de cáncer que contiene, lo que sugiere el crecimiento tumorigénico. Mientras tanto, la fusión y la agregación de microesferas se observan. El gráfico también muestra que el grado de contracción y ampliación es depende del contenido de NBCs. Todos los grupos, excepto el uno NBC% 100 disminuyeron drásticamente en tamaño en el primer día después de la encapsulación. Las microesferas que contienen MSC saludables solamente (NBC 0%) caen continuamente en tamaño con el tiempo. El grupo NBC 20% mostró una dimensión constante después de la caída inicial en el tamaño mientras que los grupos con 50% o más NBCs comenzaron a aumentar de tamaño después de 7 días, lo que sugiere el rápido crecimiento de las células tumorales. ANOVA de dos vías mostró que tanto el factor de tiempo (p & lt; 0,001) y la NBC: relación de MSC (p & lt; 0,001) significativamente afectados la dimensión de las microesferas. Bonferroni pruebas post hoc mostraron que, aparte del día1-día14 (p = 0,518) y el Día 3-day7 (p = 1,000) pares, todas las otras comparaciones fueron estadísticamente significativamente diferente de los demás (p & lt; 0,001), mientras que todos los NBC: grupos de relación de MSC fueron estadísticamente significativamente diferente de los demás (p & lt; 0,001)
Las microesferas con diferente porcentaje de la NBC y por lo tanto la NBC:. ratios de MSC: (a): 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (20% MSC) y (E): 100% NBC (0% MSC) se cultivaron durante diferentes periodos de tiempo: 0 (A1, B1, C1, D1, E1); 1 (A2, B2, C2, D2, E2); 3 (A3, B3, C3, D3, E3), 7 (A4, B4, C4, D4, E4), 14 (A5, B5, C5, D5, E5) y 21 (A6, B6, C6, D6, E6 ) días (barras de escala: 100 micras: A2, A3, A4, A5, A6, B2, B3, B4, B5, B6, C2, C3, C4, C5, D2, D3, D4; 500 micras: A1, D5, E3, E4, E6; 1,000 micras: B1, C1, C6, D1, D6, E1, E2, E5); (F): Gráfico de líneas que muestra el cambio temporal en la dimensión (media ± 1 DE) de las poblaciones de microesferas NBC-MSC-colágeno durante culturas
Los cambios morfológicos de microesferas NBC-MSC-colágeno en diferente. NBC: relaciones de MSC, los puntos de tiempo, la densidad celular inicial y la concentración de colágeno
Fig 2 muestra la H & amp; e tinción de las microesferas NBC-MSC-colágeno con diferentes proporciones de encapsulación y en diferentes puntos temporales durante el cultivo. El grupo 0% NBC (pura MSC) mostró estructuras cada vez más compactas con MSC distribuidos al azar para un máximo de 2 semanas (Figura 2A1 y 2A2), mientras que la mayor parte de las microesferas mostraron deserción completa a los 21 días de cultivo. Los grupos con el aumento de NBC: relaciones de MSC (20, 50 y 80%) (Fig 2B1-2D3) mostraron una tendencia similar que segregados en dos capas diferentes de tejidos. En resumen, a los 7 días de cultivo, una capa de células de lleno a los alrededores de microesferas de colágeno en el que las células con menor densidad estaban presentes (Figura 2B1, 2C1 y 2D1). En el grupo de NBC 20%, parece que hay una mayor proporción de células con morfología alargada a los 7 días (Fig 3B1) mientras que las células relativamente redondeadas con alta densidad celular y una baja densidad de la matriz eran dominantes en puntos de tiempo posteriores (Fig 2B2 y 2B3) . Por otra parte, las masas micro-tejidos estaban todavía en gran parte de forma esférica. En el grupo de NBC 50%, las formas de las micro-masas eran poblaciones de células irregulares densidad y altas parece superar la microesfera colágeno y más células invadidas en las microesferas de colágeno en el aumento del tiempo (Fig 2C1-2C3). En el grupo de NBC 80%, una capa delgada de células de alta densidad era encapsulando las microesferas, que contiene muchos grupos de células y "huecos" en 7 días de cultivo (Fig 2D1). A los 14 y 21 días, las estructuras fueron altamente irregular en forma y altamente poroso con células empaquetadas a alta densidad a lo largo de las estructuras mientras que las microesferas de colágeno parece ser desintegrado (Fig 2D2 y 2D3). Una vista ampliada de la figura 2D3 mostró claramente la capa de células de alta densidad y la región menos densa (Fig 2F). En el grupo de NBC 100%, la estructura todavía era esférica pero altamente compactado a los 7 días (Fig 2E1), mientras que las microesferas de colágeno fueron completamente desgarrados en los puntos de tiempo posteriores con estructuras altamente porosas e irregulares con baja densidad celular (Fig 2E2 y 2E3) .
(A): 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (30% MSC); (E): 100% de NBC (0% MSC). A1, B1, C1, D1, E1: el día 7; A2, B2, C3, D2, E2: el día 14; B3, C3, D3, D3a, E3: 21 días después del cultivo (Barras de escala: 100 micras) guía empresas
(A1-A3):. 1250 células /microesfera; (B1-B3): 2.500 células /microesfera; (C1-C3): 5000 células /microesfera; 1: 7 días; 2: 14 días; 3: 21 días (Barras de escala: 100 M)
Fig 3 muestra la H & amp; E tinción de las microesferas NBC-MSC-colágeno a diferentes densidades de células de encapsulación cuando NBC se fijó en 80%.. En 1250 células por microesfera, las células parece estar encapsulado dentro de la microesfera de colágeno, mientras que una capa delgada de células cubierta de la periferia de la microesfera en el punto de tiempo temprano (7 días) (Fig 3A1) pero a puntos de tiempo posteriores, no se encontraron excrecencias celulares irregulares dejando sólo muy pocas células dentro de la microesfera (Fig 3A2 y 3A3). A mayores densidades celulares (2500 y 5000 células por microesfera), se encontraron vacíos evidentes en las microesferas de colágeno con células densamente empaquetadas en excrecencias de forma irregular que rodean la microesfera a los 7 días (Figura 3B1 y 3C1). . En los puntos de tiempo posteriores, las excrecencias se hicieron más grandes y más poroso (figura 3B2, 3B3, 3C2 y 3C3)
La figura 4 muestra la H & amp; E tinción de las microesferas NBC-MSC-colágeno con diferentes concentraciones de colágeno. Una concentración de colágeno mayor parece encapsular las células mejor dentro de la microesfera, mientras que una capa delgada de células estaban creciendo en la periferia de la microesfera (Fig 4B1). A los 14 días, excrecencia irregular y masiva se encontró en el grupo de menor concentración de colágeno (Fig 4A2) pero densas colonias de células y huecos se encontraron dentro de las microesferas en la concentración de colágeno mayor (Fig 4B2).
(A ): 1 mg /ml; (B): 2 mg /ml; 1: 7 días; 2: 14 días (barras de escala: 100 m).
Cinética de crecimiento en microesferas NBC-MSC-colágeno
La figura 5A muestra el gráfico de líneas en el número de células en la NBC-MSC microesferas: el colágeno con diferentes NBC: ratios de MSC en diferentes puntos de tiempo durante el co-cultivo. Microesferas con 0% de NBC, es decir, 100% de las MSC mostraron una disminución continua en el número de células. Por otra parte, todos los grupos que contienen células de cáncer mostró un crecimiento positivo en el tiempo. El grupo de 20% mostró un aumento gradual en las primeras 2 semanas y todo en un repentino el número aumentado de manera espectacular exponencialmente en el día 21. El grupo 100% NBC (0% MSC) mostró un aumento significativo en las culturas antiguas en día 7 que otros grupos pero que no proporcionó ninguna ventaja a este grupo de crecimiento más en días posteriores. Se encontraron tendencias similares en los NBC el 50% y el 80%: grupos de MSC. ANOVA de dos vías mostró que tanto el factor de tiempo (p & lt; 0,001) y la NBC: factor de relación MSC (p & lt; 0,001) significativamente afectados número de células. Bonferroni pruebas post hoc mostraron que la NBC 0% (100% MSC) significativamente diferente de todos los otros grupos (p & lt; = 0,003). El grupo NBC 20% mostró diferencias significativas de 0% (p = 0,003), 80% (p = 0,033) y 100% (p = 0,008), respectivamente. El grupo 50% NBC y el 80% y después 100% no fueron significativamente diferentes entre sí (p & gt; = 0,342). El 100% NBC sólo mostró diferencia significativa desde el 0% y el 20% NBC: relaciones de MSC (p & lt; = 0,008). Curiosamente, comenzando con el mismo número de células, el grupo NBC 20% mostró una mucho más baja (~ 2 días) tiempo de duplicación, que mide el tiempo necesario para que la población de células de duplicar en sí, en comparación con una mayor NBC: relación de MSC (Fig 5B ). El grupo 0% NBC (100% MSC) no mostró crecimiento, mientras que el 100% de la NBC (0%) mostró mucho menor tiempo de duplicación (& gt; 6 días).
En el día 7, el día 14 y el día 21, 200 microesferas se digirieron para contar el número de células. (A): crecimiento curvas cinéticas que muestran los cambios en el número de células en el tiempo a diferentes relaciones de encapsulación (media ± 1 DE); (B):. Población tiempo de duplicación para diferentes grupos
Cambio temporal en el porcentaje de la NBC en las microesferas
La figura 6A muestra los porcentajes de la NBC entre los diferentes grupos a través del tiempo. En el grupo de NBC 20%, el porcentaje de NBCs se mantuvieron a alrededor de 20% en el día 7 y 14, pero aumentó drásticamente a 33% en el día 21 (Fig 6A). Por otra parte, 50% y 80% de grupos NBC mostraron nivel similar de NBCs con el tiempo. Fig 6C muestra el histograma representativo del flujo de enumeración citometría-base de NBCs en diferentes grupos. Fig 6B muestra el porcentaje de NBCs calculados a partir de datos obtenidos mediante citometría de flujo. Two-Way ANOVA mostró que la NBC: MSC factor de relación (p & lt; 0,001) afectó significativamente el porcentaje de NBC horas extras, pero no el factor tiempo (p = 0,85). Bonferroni pruebas post hoc mostraron que el grupo NBC 20% significativamente diferente de 50% (p & lt; 0,001) y 80% (p & lt; 0,001), respectivamente. El grupo NBC el 50% y el 80% no fueron significativamente diferentes entre sí (p = 0,366)
(A):. Gráficos de barras de error que muestra el porcentaje de la NBC determinados mediante citometría de flujo (media ± 1 DE); (B): Tabla que muestra el porcentaje medio de la NBC en diferentes grupos y en diferentes puntos de tiempo; (C): células histograma que muestra representativas teñidas con anticuerpo de control de isotipo y las células se tiñeron con anticuerpos NB84a en diferentes grupos en diferentes puntos temporales
La inmunohistoquímica del colágeno de tipo I
La figura 7. muestra el análisis inmunohistoquímico de colágeno tipo I en las microesferas NBC-MSC-colágeno. En el grupo 0% NBC (100% MSC), el colágeno de tipo I de microesferas positivo permaneció esférica aunque se hace más porosa a los 14 días (figura 7A y 7B). En los grupos de NBC 20%, la microesfera estaba intacto en día 7, pero comenzó a descomponerse en día 14 y fue casi completamente descompuesto en día 21 (Fig 7B2 y 7B3). Para el grupo NBC el 50%, las microesferas estaban intactas en el día 7 (Figura 7C1), pero más poroso en puntos de tiempo posteriores (Figura 7C2 y 7C3). Esta tendencia fue similar en el grupo de 80% NBC (Fig 5B). Colágeno de tipo I las células que expresan, que son propensos a ser MSCs, se limita principalmente dentro de las microesferas aunque algunos fueron identificados de vez en cuando en la consecuencia fuera de las microesferas (Fig 7F y 7G)
(A):. 0% NBC (100% MSC); (B): 20% NBC (80% MSC); (C): 50% NBC (50% MSC); (D): 80% NBC (30% MSC); (E): 100% de NBC (0% MSC). A1, B1, C1, D1, E1: el día 7; A2, B2, C3, D2, E2: el día 14; B3, C3, D3, D3a, E3: 21 días después del cultivo (Barras de escala: 100 micras).
La inmunohistoquímica de MMP9
La figura 8 muestra la tinción inmunohistoquímica de MMP9 de la microesferas de NBC-MSC-colágeno con 80% fijo NBCs y con diferentes densidades de células y concentraciones de colágeno. Las regiones de colágeno mostró tinción positiva, mientras que se encontraron células MMP9 que expresan tanto en el crecimiento fuera y las capas periféricas de masas de células (Fig 8A1, 8B1, 8B2 y 8C1) guía
(A):. 5000 células /ml; (B): 2500 células /ml; (C): 1250 células /ml; 1: 0,5 mg /ml; 2: 1 mg /ml; 3: 2 mg /ml (barras de escala: 100 m).
Discusión
in vitro modelos de cáncer
Con el fin de acelerar la detección de drogas y preclínico para lograr personalizado medicina en el futuro, el desarrollo de la enfermedad o específica del paciente en el modelo in vitro son de gran importancia [54]. Como se discutió anteriormente, los modelos de monocapas 2D convencionales están siendo criticados por su ambiente de cultivo no fisiológico y no son capaces de recapitular la condición in vivo, por lo tanto, la producción de datos poco fiables. Con el avance en el campo de la ingeniería de tejidos, el uso de un modelo tridimensional in vitro en tumores que imitan es cada vez más popular. [55-57]. Una cuestión importante en la fabricación de un modelo in vitro sería la opción de biomateriales, que podría ser de origen natural o sintetizado artificialmente. Numerosos estudios han mostrado resultados prometedores mediante el uso de biomateriales naturales tales como colágeno, fibrina, Matrigel [58] y el ácido hialurónico. Con su fácil disponibilidad, facilidad de uso y alta bioactividad, son opciones populares y atractivos para los investigadores. El colágeno tiene una excelente biocompatibilidad y la inmunogenicidad despreciable. Estas propiedades permiten a los científicos a utilizar colágeno como un material apropiado para el modelo de cáncer in vitro. Sin embargo, la facilidad de la degradación, la composición de la matriz definida y las propiedades mecánicas débiles son sus problemas. Además, la alta heterogeneidad de lote a lote en la composición hace que la comparación entre los diferentes estudios muy difíciles. Por otro lado, los materiales sintéticos, tales como PA, poliéster, PEG poseen parámetros ajustables y permiten un control más preciso de las propiedades del material [59], lo que lleva a una menor complejidad, una alta reproducibilidad y la comparabilidad entre los diferentes estudios. Sin embargo, algunos de ellos son tóxicos y requieren etapas de procesamiento más sofisticados antes de que puedan ser utilizados para el modelado. hidrogel a base de PEG, por ejemplo, tiene una estructura no fibrilar y requiere o bien procedimientos de reticulación físicos o químicos [60-62]. Estos serían afectar al comportamiento celular y la facilidad de uso cuando se compara con polímeros naturales como colágeno. De hecho, no existe un biomaterial universal, apto para todos los modelos de enfermedad.