Extracto
Los microARN se han implicado en la regulación de varias vías de señalización celular de células de cáncer colorrectal (CRC). A pesar de la evidencia emergente demuestra que microARN (MIR) -106a se expresa altamente en el tumor primario y las muestras de heces de pacientes con CCR; si es o no el miR-106a media la metástasis del cáncer se desconoce. Mostramos aquí que el miR-106a es altamente expresado en células con CCR metastásico, y regula la migración de las células del cáncer y la invasión positivamente
in vitro
y
in vivo
. Estos fenotipos no implican influencias de confusión sobre la proliferación de células de cáncer. MiR-106a inhibe la expresión de
de crecimiento transformante-β del receptor del factor 2 gratis (
TGFBR2
), lo que lleva a un aumento de la migración celular y la invasión CRC. Es importante destacar que el miR-106a niveles de expresión en los CRC primarias se correlacionan con la progresión clínica del cáncer. Estas observaciones indican que miR-106a inhibe el objetivo anti-metastásico directamente y los resultados en la migración celular y la invasión CRC
Visto:. Feng B, Dong TT, Wang LL, Zhou HM, Zhao HC, Dong F, et Alabama. (2012) Cáncer Colorrectal migración y la invasión iniciada por el microARN-106a. PLoS ONE 7 (8): e43452. doi: 10.1371 /journal.pone.0043452
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: Abril 23, 2012; Aceptado: July 24, 2012; Publicado: 17 Agosto 2012
Copyright: © Feng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen financiación o apoyo al informe
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las metástasis llevan a aproximadamente el 90% del cáncer colorrectal ( CRC) relacionados con la PI mortalidad, sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen siendo en gran medida poco clara [1]. La metástasis es un proceso complejo, procesos múltiples el cual las células de CRC invaden los tejidos circundantes, intravasate en la vasculatura, trasladar a través de la circulación sistémica, extravasate en el parénquima de los tejidos distantes (hígado y pulmones), establecen las micrometástasis, y forman tumores secundarios macroscópicos [2]. En los últimos años, se han realizado varios estudios para investigar los genes y sus productos que están implicados en la metástasis [3] - [7].
microARNs (miRRNs) comprenden una clase conservada evolutivamente de ARN pequeños que pueden la expresión génica silencio post-transcripcionalmente a través de interacciones específicas de secuencia con las regiones 3 'no traducidas (UTRs) de mRNA objetivos afines [8]. Recientemente, el papel de miRNAs en el establecimiento y progresión de la CRC ha hecho evidente. Mayor que 50% de los genes miARN están situados en regiones cromosómicas frágiles que son alterados durante la progresión tumoral [9], y algunos miRNAs han sido identificados como oncogenes o genes supresores de tumor en CRC [10] - [14]. Además, el análisis de perfiles de expresión ha revelado característicos firmas de miARN que pueden predecir los resultados clínicos de CRC [15], [16]
miR-106a. (MiRBase: MIMAT0000103) ha demostrado ser altamente expresado en el cáncer tejidos y muestras de heces de pacientes con CRC [16] - [18]; Sin embargo, el papel exacto desempeñado por el miR-106 en los CRC se desconoce. Por lo tanto, hemos correlacionado miR-106a con la migración y la invasión de CRC, con la esperanza de que tal asociación podría dar una idea de los mecanismos por los cuales las células CRC metástasis.
Resultados
miR-106a es altamente expresado en metastásico las células CRC
Se determinó en primer lugar los niveles de expresión de miR-106a en una variedad de células humanas de CRC. De acuerdo con los informes anteriores [16] - [18], el miR-106a fue hasta reguladas en los seis líneas celulares de CRC humanos en comparación con inmortalizada espontáneamente, las células epiteliales de colon humanas normales (NCM640; la figura 1A.). miR-106a fue más altamente expresado en las células más invasivos en relación con las células con capacidad de menos invasiva (Fig. 1A y B). Por ejemplo, el nivel de expresión de miR-106a fue 9 veces mayor en la línea más invasiva de células SW480 de la línea celular HT29 menos invasiva.
A, en tiempo real RT-PCR análisis de miR-106a la expresión en células inmortalizadas, normales de colon humano epiteliales y una variedad de células de CRC. U6 pequeños ARN nuclear se utilizó como control interno. Un experimento representativo se muestra por triplicado, y las barras indican los errores estándar. B, la capacidad invasiva de una serie de células de CRC determinados por ensayos de invasión de Matrigel. Un experimento representativo por triplicado se muestra, junto con los errores estándar. C, Western blot de N-cadherina, E-cadherina, vimentina, y la expresión en células ZEB1 CRC. D, el análisis cuantitativo con el intensificador de imágenes.
n = 3
,
bares, España ± SD.
Además, la expresión de la transición epitelio-mesenquimal (EMT), marcadores (E-cadherina, N- cadherina, vimentina, y ZEB1) se determinó por análisis de transferencia Western. EMT se puede considerar un proceso patológico que contribuye a la progresión del cáncer, particularmente en lo que se refiere a la invasión y metástasis. Como se muestra en la Fig. 1C y D, los niveles de expresión de E y N-cadherina variada entre siete líneas celulares. E-cadherina se expresa en NCM640 y cinco líneas celulares de CRC, pero no SW480, y más fuertemente expresada en NCM640, HT29, SW620, y LOVO. N-cadherina, vimentina, y la expresión ZEB1 fue menor en las cuatro líneas celulares
.
Las dos líneas celulares de CRC, RKO y SW480, que tienen el mayor potencial de invasión, exhibieron consistentemente baja expresión de E-cadherina y alta expresión de N-cadherina, vimentina, y ZEB1.
miR-106a Inicia migración y la invasión
in vitro
a continuación realizamos
in vitro
la pérdida de la función de análisis para determinar el papel desempeñado por el miR-106a en la migración celular y la invasión CRC. miR-106a fue silenciado
in vitro
a través de oligonucleótidos antisentido, a continuación, los niveles de expresión se determinaron por tiempo real de RT-PCR [19]. Se encontró que la transfección de oligonucleótidos anti-sentido miR-106a en células SW480 resultó en 7,3 veces los niveles más bajos de expresión de miR-106a (Fig. 2A). inhibidores antisentido de miR-106a condujo a una disminución de 2,5 veces en la migración de las células SW480, según lo determinado por ensayos de migración
in vitro
, relativa a los oligonucleótidos de control (Fig. 2B). inhibidores de miR-106a causaron una reducción de 2,7 veces en la capacidad invasiva de las células SW480 medidas por ensayos de invasión
in vitro
en comparación con oligonucleótidos de control (Fig. 2C). Es importante destacar que esta reducción no podía atribuirse a la destrucción de la viabilidad celular (Fig 2D, P & gt;. 0.05). Por lo tanto, estas observaciones indican que el miR-106a es necesaria para la migración y la invasión de estas células metastásicas CRC más
in vitro
, pero no es necesario para la viabilidad.
A, los niveles de miR-106a la expresión en células SW480 después de la transfección con inhibidores de miR-106a, según lo determinado por análisis en tiempo real de RT-PCR. Los datos se normalizaron con U6 pequeños ARN nucleares. Se muestra un experimento representativo por triplicado, junto con los errores estándar. B, Transwell ensayos de migración de células SW480 transfectadas con inhibidores de miR-106a o vectores de control. Un experimento representativo se muestra por triplicado y las barras indican los errores estándar. También se muestran las imágenes de contraste de fase de células SW480 que migran a través de las membranas. C, Matrigel ensayos de invasión de las células SW480 transfectadas con oligonucleótidos contra el miR-106a o oligonucleótidos de control. Se muestra un experimento representativo por triplicado, así como los errores estándar. También se muestran imágenes de contraste de fase de células SW480 invadido a través de membranas. D, ensayo de exclusión de azul de tripán de células SW480 con inhibidores de miRNA. Un experimento representativo se muestra por triplicado, junto con los errores estándar. E, en tiempo real el análisis RT-PCR de la expresión de miR-106a en las células HT29 infectadas con vectores de control de miR-106a-expresión o. U6 pequeños ARN nuclear se utiliza como un control interno. Un experimento representativo se muestra por triplicado, y las barras indican los errores estándar. F, el potencial de migración de las células infectadas con NCM640 miR-106a que expresan o de control de vectores, como se determina por los ensayos de migración transwell. Se muestra un experimento representativo por triplicado, así como los errores estándar. También se muestran imágenes de contraste de fase de células HT29 migrado a través de membranas. G, el potencial invasivo de las células HT29 después de la transducción de miR-106a o el control de vectores de transducción medido por ensayos de invasión Matrigel. Un experimento representativo se muestra por triplicado y las barras indican los errores estándar. También se muestran las imágenes de contraste de fase de células HT29 invadido a través de membranas. H, Curvas de crecimiento de células HT29 infectadas con el vector de miR-106a-expresión o control
in vitro
. Un experimento representativo se muestra por triplicado, junto con los errores estándar.
Para determinar si la sobreexpresión de miR-106a o no confirió potencial migratorio e invasivo de las células metastásicas CRC no metastásicos o menos, hemos clonado el secuencia genómica del gen miR-106a humano en un retrovirus derivado del vector de células madre de ratón [20]. A continuación, utiliza los vectores resultantes para expresar el miR-106a en las células HT29 y NCM640 inmortalizadas con menos potencial metastásico. transducción exitosos de miR-106a se determinaron por tiempo real de RT-PCR (Fig. 2E)
.
En ambos de estas dos líneas, la expresión ectópica de miR-106a causó un aumento significativo en la migración celular y la invasión ( La Fig. 2F y 2G). Tal aumento no puede ser debido a las mayores tasas de proliferación de estas células (Fig 2H, P & gt;. 0,05 para los días 0, 2, 4, y 6). Estas observaciones sugieren que la sobreexpresión de miR-106a es suficiente para iniciar la migración y la invasión de las células CRC
in vitro
.
miR-106a Promueve CRC Invasión
in vivo
a continuación se determinó si o no el miR-106a inducida por la invasión
in vivo
. Con este fin, overexpressed miR-106a en las células de CRC que son normalmente menos invasiva. En primer lugar, se implantó HT29 células transducidas con el miR-106a o infectados con vectores de control por vía subcutánea en ratones desnudos. Los ratones receptores crecieron tumores notables dentro de 2 semanas después de la inyección, y se convirtieron en moribunda en la semana 8 después de la inyección debido a la carga tumoral cuando se dio por terminado el experimento.
En la semana 4 después de la implantación, los tumores de miR-106a que sobreexpresan HT29 células y tumores de las células de control infectadas fueron similares en tamaño, lo que sugiere que miR-106a tuvo un efecto mínimo en el crecimiento del tumor primario (Fig. 3A). Como era de esperar, los tumores de las células de control eran no invasivo, que se muestra como masas tumorales confinados dentro de cápsulas fibrosas (Fig. 3B, panel izquierdo). Por el contrario, los tumores de células miR-106a-overexpressing tenían islas de células cancerosas epiteliales invasoras en los tejidos estromales adyacentes (Fig. 3B, panel izquierdo). Por lo tanto, la expresión ectópica de miR-106a confirió la capacidad invasiva de las células cancerosas que son de otra manera no invasiva.
A, Curvas de crecimiento de tumores formados por HT29 células infectadas con vectores de control miR-106a-expresión o. Cada punto de datos representa la media ± error estándar de 3-4 ratones. B, hematoxilina y eosina secciones manchadas de CRC formados por células HT29 infectadas con miR-106a-expresan o control de vectores 8 semanas después de la implantación.
TGFBR2
es un objetivo directo de miR-106a
para entender el mecanismo por el que el miR-106a inducir la migración celular y la invasión del cáncer, hemos utilizado dos algoritmos (PicTar y TargetScan) para identificar los objetivos de miR-106a humana [21], [22]. Entre 990 objetivos previsto por TargetScan, el
Lama3- gratis (Gene ID: 3909) y
TGFBR2
genes (Gene ID: 7048) previamente han sido implicados en la regulación de la migración celular y /o invasión [23] - [27].
TGFBR2
es particularmente interesante debido a que la expresión de
TGFBR2
se ha demostrado que se pierde progresivamente durante la progresión maligna de diversos tipos de cáncer [23], [25], [27], [28 ]. Además, TGFBR2 codifica mRNA tiene un elemento 3'UTR que es complementario a miR-106a (Fig. 4A)
.
A, la formación de dúplex entre prevista humano
TGFBR2
3'UTR y miR-106a. B, análisis en tiempo real de RT-PCR de
TGFBR2 Hoteles en células HT29 infectadas con miR-106a-expresión o vector de control.
GAPDH
mRNA se usa como un control interno. Un experimento representativo se muestra por triplicado, junto con los errores estándar. C, la actividad de la luciferasa de tipo silvestre
TGFBR2
3'UTR del gen indicador en las células HT29 infectadas con vectores de control de miR-106a-expresión o. Un experimento representativo se muestra por triplicado, junto con los errores estándar. D, la actividad de la luciferasa de tipo mutante
TGFBR2
3'UTR del gen indicador en las células HT29 infectadas con vectores de control de miR-106a-expresión o. Un experimento representativo se muestra por triplicado. Barras indican los errores estándar.
De hecho, la sobreexpresión de miR-106a condujo a la degradación de los
TGFBR2
ARNm, tal como se mide por tiempo real de RT-PCR (Fig. 4B). A continuación se determinó si
TGFBR2
es un objetivo directo de la inhibición mediada-106a-MIR mediante el ensayo de la actividad de un gen reportero de luciferasa fusionado en el 3'UTR de la de tipo salvaje
TGFBR2
gen. miR-106a reduce la actividad del informador de la luciferasa significativamente (P & lt; 0,05, Fig 4C.). La inhibición de
TGFBR2
ha mediado por miR-106a depende de la presencia de sitios de unión de miR-106a homólogas en el 3'UTR de la
TGFBR2
gen. Debido a que el indicador de luciferasa lleva un mutante
TGFBR2
3'UTR, la sustitución de 4 nucleótidos dentro de los sitios de unión de miR-106a no fueron inhibidas por miR-106a expresión ectópica (Fig 4D, P & gt;. 0.05). En conjunto, estas observaciones indican que
TGFBR2
puede funcionar como un blanco directo de silenciamiento mediado por el miR-106a.
TGFBR2
es un objetivo funcional de miR-106a
a continuación se determinó si la expresión del redujo el
es necesaria para la inducción de la migración celular y la invasión observada después de la sobreexpresión de miR-106a TGFBR2
gen. Overexpressed miR-106a y una construcción que expresa
TGFBR2
constitutivamente. Este constructo codifica toda la secuencia de codificación de
TGFBR2, España mientras que carecen del elemento 3'UTR, produciendo de este modo un tipo de resistente a miR-106a mediada por la inhibición de ARNm. Sorprendentemente, la resultante expresada constitutivamente
TGFBR2
ha abrogado la migración previamente elevado y la invasión iniciada por miR-106a (Fig 5A.), Pero no tuvo efecto sobre la viabilidad celular (figura 5B, P & gt;. 0,05), lo que sugiere que
TGFBR2
es de hecho un objetivo funcional de miR-106a.
a, ensayos de invasión de Matrigel de las células HT29 miR-106a transducidas o infectadas de control-transfectadas transitoriamente con
TGFBR2
. Un experimento representativo se muestra por triplicado junto con los errores estándar. B, Trypán ensayo de exclusión de azul de las células HT29 miR-106a-expresando transducidas
TGFBR2
o el control de vectores. Se muestra un experimento representativo por triplicado, junto con los errores estándar. C, inmunotransferencia para
TGFBR2 Hoteles en células HT29 transfectadas transitoriamente con
TGFBR2
siRNA. Un experimento representativo se muestra por triplicado, junto con los errores estándar. D, La comparación del aumento del potencial de migración y la invasión entre las células HT29 células transducidas con el miR-106a y HT29 transfectadas transitoriamente con
β
siRNA. Un experimento representativo se muestra por triplicado. Barras indican los errores estándar.
También queríamos aclarar si la degradación de
TGFBR2
es suficiente para el aumento de miR-106a-mediada de la migración y la invasión. La transfección de
TGFBR2
pequeños ARN de interferencia (siRNA), lo que resultó en un & gt; 90% de reducción en los niveles de
TGFBR2
proteína (Fig. 5C), dio lugar a un notable, pero no inducción completa de la migración celular y la invasión en comparación con la inducción causada por miR-106a sobreexpresión (Fig. 5D). Colectivamente,
TGFBR2
parece ser un objetivo necesario, pero no suficiente de miR-106a.
expresión de miR-106a está aumentada en CCR metastásico primaria
Es importante destacar que una reciente el análisis de microarrays mostró que miR-106a se encuentra entre los miRNAs que son altamente expresado en CRC primaria en comparación con el tejido normal colorrectal epitelial [16], [18]. Determinamos si o no la expresión de miR-106a en los tumores de metástasis-positivo es mayor que los tumores sin metástasis, y si es o no la expresión de miR-1061 se asocia con resultados clínicos en pacientes con CCR. Se reclutaron 28 pacientes con CRC que eran sobrevivientes sin metástasis a largo plazo después de la resección quirúrgica completa del tumor primario, y se compararon los pacientes a una cohorte de control de los pacientes con metástasis al momento del diagnóstico o la metástasis en el seguimiento (& lt; 60 meses ) (Tabla S1). Por otra parte, las tasas de supervivencia libre de metástasis de los pacientes sin metástasis al momento del diagnóstico fueron estratificados en función del estado de expresión de miR-106a. De hecho, los pacientes metástasis positivos tenían niveles significativamente más altos de miR-106a en sus tumores primarios con respecto a los pacientes sin metástasis (Fig 6A, P & lt;. 0.05). Cabe destacar que, entre todos estos pacientes, los que tenían niveles más bajos de miR-106a tenían mejores resultados clínicos (Figura 6B,
p
. & Lt; 0,05). En conjunto, estos resultados indican que el miR-106a tiene un papel importante en la metástasis CRC.
A, los niveles de expresión de miR-106a en los CRC primaria con o sin metástasis. Hubo una diferencia significativa en la expresión de miR-106a en estos dos grupos. B, de Kaplan-Meier de supervivencia libre de metástasis durante 28 CRC pacientes sin metástasis al momento del diagnóstico, estratificados en base a los niveles de expresión de miR-106a en sus tumores primarios. Aχ
2 se utilizó la prueba para el análisis estadístico y un P. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Discusión
El presente trabajo identificado miR-106a como un pro-miARN que lleva la metástasis a la promoción de la migración y la invasión de las células CRC. La reducción de este miARN en las células de CRC que son de otro modo metastásico disminuyó el potencial migratorio e invasivo de las células de CRC. En contraste, la sobre regulación de miR-106a en las células de CRC con menor potencial de la migración y la invasión aumento de la migración celular y la invasión. Hemos demostrado que el miR-106a no influye significativamente en las tasas de proliferación de células CRC
in vitro
y
in vivo
. Tal evidencia sugiere que el miR-106a solamente podría desempeñar un papel en la invasión de células CRC.
Curiosamente, a pesar de la misma paciente, las células SW480 y SW620 tenían diferente potencial invasión y la expresión de miR-106a (fig. 1A y B ). Es posible que este hallazgo fue porque las células SW480 son de un cáncer primario experimentando células EMT y SW620 son de un cáncer secundario. La disminución de la expresión de ZEB1 en las células SW620 en comparación con las células SW480 puede dar lugar a la restauración de los niveles de E-cadherina e inducir un proceso inverso de la EMT, o mesenquimal-epitelial (MET) [29], en el que el miR-106a puede desempeñar un papel como un factor de aguas arriba o aguas abajo de ZEB1.
Nuestros hallazgos reportan por primera vez que, como un gen diana de miR-106a,
TGFBR2
puede ser regulada negativamente por el miR-106a en el nivel de la transcripción mediante la unión de la 3'UTR de
TGFBR2
ARNm en el CCR.
TGFBR2
es una molécula importante la señalización de TGF-β se encuentra a menudo a ser uno de los genes alterados en el cáncer. La vía de señalización de TGF-β juega un papel complejo, que sigue siendo controvertido, en la progresión maligna de los tumores. Se ha demostrado que el TGF-β puede inducir la EMT y promover la invasión de células tumorales [30], mientras que otro estudio ha demostrado que reduce
TGFBR2
expresión se asocia con características agresivas de carcinoma hepatocelular [25]. En CRC, TGF-β puede inducir la inhibición del crecimiento de células cancerosas, y
TGFBR2
era una proteína supresora de tumor que se requiere para TGF-β señalización [31]. El presente estudio mostró que la baja regulación de
TGFBR2
aumenta la migración celular y la invasión de HT29 (Fig. 2G y 5D). Por lo tanto, la señalización de TGF-β puede ser un método importante por el cual miRNAs regulan el desarrollo de tumores. Un estudio reciente informó que el miR-17~92, activado por c-Myc, atenúa la vía de señalización de TGF, estimulando así la angiogénesis y el crecimiento tumoral de células [32]. Aunque
TGFBR2
parece ser un objetivo necesario, pero no suficiente de miR-106a en el estudio actual, la relación entre el miR-106a y la señalización de TGF-β merece más estudio.
análisis clínico-patológico demostrado aún más la conexión entre el miR-106a y la metástasis. supervivientes a largo plazo sin metástasis tenían niveles significativamente más bajos de miR-106a en sus tumores primarios relativos a los pacientes con recurrencia de la enfermedad, y los niveles más bajos de miR-106a sugiere una mayor tasa de supervivencia libre de metástasis (Fig. 6). Este hallazgo apoya firmemente la idea de que la sobreexpresión de miR-106a está íntimamente involucrada en la metástasis de CCR.
En conclusión, hemos demostrado que la expresión de miR-106a se correlacionó positivamente con el potencial de la migración y la invasión de CRC las células, y la baja regulación de
TGFBR2
, como uno de los genes diana de miR-106a, podría aumentar la migración celular y la invasión.
Más importante aún, los niveles de expresión de miR-106a en CRC primarias se correlacionan con la progresión clínica del cáncer, lo que sugiere que el miR-106a puede representar una nueva diana para la intervención terapéutica para prevenir la metástasis CRC.
Materiales y Métodos
Líneas celulares
La línea de células epiteliales de colon humano inmortalizado, NCM640, fue un regalo de JQ Zhang y se cultivaron en DMEM suplementado con 10% FBS HT29, SW480, LOVO, SW1116 y SW480 líneas celulares se adquirieron de la ATCC (Manassas, VA, EE.UU.) y se cultivaron en condiciones de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Aislamiento de ARN y miRNAs Ensayos
El ARN total de las células cultivadas se extrajo con mirVana kit de aislamiento (AM1560, Ambion, Austin, TX, EE.UU.). miRNAs ensayos se realizaron con QRT-PCR Kit de Detección mirVana miARN (AM1558, Ambion) junto con QRT-PCT conjuntos de cebadores (4395280, Ambion) de acuerdo con los manuales de los fabricantes. U6 pequeños ARN nucleares se utilizó como control interno.
El oligonucleótido transfección
El inhibidor miRIDIAN microARN, miRIDIAN Mimic hsa-miR-106a y siRNA de
TGFBR2
se adquirió de Dharmacon (IH-300526-08, 300526-07-C, y D-003930, Dharmacon, Lafayette, CO, EE.UU.). Las células fueron transfectadas con 200 nM de los oligonucleótidos indicados utilizando Oligofectamine Reactivo (12252011, Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las células se utilizaron para los experimentos posteriores 48 h después de la transfección.
Gene Clonación y expresión ectópica
El gen miRNA humano se amplificó por PCR a partir de ADN genómico normal y se clonó en el Mdh1-PGK-GFP 2,0 retrovirus derivado de vector.
TGFBR2
ADNc que carecen de la 3'UTR se amplificó por PCR a partir de ADN genómico normal y expresado a partir del vector pWZL-blasticidin. generación viral y la infección de las células diana se han descrito anteriormente [33]. se seleccionaron las células infectadas con 2 g /ml de puromicina (p9620, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.), 200 g /ml de higromicina (H9773, Sigma), y 10 g /ml de blasticidina (sc-205 604, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EE.UU.).
in vitro Ensayos de migración y la invasión
se evaluó el potencial de la migración y la invasión de las células CRC, como se ha descrito anteriormente con ligeras modificaciones [34].
CRC células (2,5 × 10
5) se sembraron en cámaras sin recubrimiento superior (inserciones de 24 pocillos; tamaño de poro, 8 micras; BD Bioscience, Bedford, MA, EE.UU.) para los ensayos de migración transwell. CRC células (2,5 × 10
5) fueron colocados en cámaras recubiertas con Matrigel superiores (inserciones de 24 pocillos; tamaño de poro, 8μm; BD Bioscience). para ensayos de invasión
El medio en el componente de la parte superior era aspiró y se reemplazó con medio libre de suero 2 h después de la siembra, y medio que contiene 20% de suero se utilizó como un quimioatrayente en las cámaras inferiores. Las células se dejaron migrar durante 24 h, y después las células en ambos lados de la cámara se fijaron con 50/50% de acetona /metanol. Las células en la parte inferior de la cámara se tiñeron con violeta cristal (C3886, Sigma). Entonces, la imagen de cada pocillo fue llevado a la imagen de los núcleos de las células con el objetivo × 10, y los núcleos de células en cada campo se contó usando el software Image-J (NIH; http://rsb.info.nih.gov /ij /).
experimentos con Animales
de seis a ocho semanas de edad ratones desnudos fueron utilizados para el estudio, y todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Cuidado de Animales de la Universidad de Shanghai Jiaotong . 10
6 HT29 células en 200 l DMEM se inyectaron en los costados de ratones por vía subcutánea. Los diámetros de los tumores se midieron dos veces a la semana con calibradores de precisión. De tres a cuatro ratones por grupo fueron sacrificados a cada uno de los 4 puntos de tiempo (semanas 2, 4, 6 y 8 después del trasplante). Los tumores se retiraron y se pesaron. Las muestras de tejido se fijaron en 10% de formalina tamponada durante 12 h, después se lavaron con PBS y presentados al 70% de etanol, seguido de ser incrustado en parafina, seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina (H9627 y E4009, Sigma).
SYBR verde en tiempo real RT-PCR
se extrajo el ARN total de las células y transcrito de forma inversa, tal como se describe anteriormente [35]. Los cebadores ascendentes y descendentes de la
TGFBR2
gen se obtuvieron a partir PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/): 5'-GTAGCTCTGATGAGTGCAATGAC-3 'y 5'-3-CAGATATGGCAACTCCCAGTG '. SYBR en tiempo real verde RT-PCR y el análisis de datos correspondiente se han descrito anteriormente [35]. β-actina mRNA se utilizaron como un control interno (cebadores: 5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3 'y 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3').
Immunoblotting
Las células se recogieron en tampón de lisis RIPA . Las proteínas de los lisados celulares se resolvieron con gel PAGE, se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore Corp., Billerica, MA, EE.UU.), entonces bloqueados en la leche no grasa 5% en PBS /Tween-20, seguido de incubación con anticuerpo againstN-cadherina (sc-271386, Santa Cruz), E-cadherina (sc-21791, Santa Cruz), vimentina (sc-373717, Santa Cruz), ZEB1 (sc-25388, Santa Cruz) o TGFBR2 (sc-17799, Santa Cruz) . La cantidad de proteína diana se calibró utilizando β-actina (sc-130656, Santa Cruz), y se obtuvieron intensidades relativas.
Construir
TGFBR2
secuencias 3'UTR fueron clonados en una construcción de PMIR-INFORME luciferasa (AM5795, Ambion) [36]. Mutant
TGFBR2
3'UTR se generó con un QuickChange mutagénesis dirigida Kit (200519, Stratagene, Palo Alto, CA, EE.UU.).
luciferasa reportero de ensayo
Las células a 50% de confluencia en placas de 24 pocillos se transfectaron con Fugene6 (e2691, Promega, Madison, WI, EE.UU.). El constructo de gen indicador de luciferasa (200 ng) y pRL-SV40 Renilla constructo de luciferasa (1 ng [utilizados para la normalización]) fueron co-transfectadas en cada pocillo. Se prepararon extractos celulares de 24-48 horas después de la transfección y se midieron con un Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (E1910, Promega).
Clínica colorrectal Tumores
tumores colorrectales primarios y los correspondientes tejidos normales fueron colorrectal recogidos entre 2004 y 2006, y procesados de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité ético del hospital Ruijin de la Escuela de Medicina de la Universidad de Shanghai Jiaotong. El estadio TNM del tumor se determinó de acuerdo con la clasificación propuesta por el AJCC Cancer Staging Manual [37]. Los datos de seguimiento se resumen al final de 2011, con una mediana de seguimiento de 60 meses. tejido fresco fue cosechada de los pacientes, congelado-complemento, y se conserva a -80 ° C. secciones parciales de los mismos tejidos fueron teñidas con hematoxilina-eiosin para validar la presencia de tumor y de los tejidos que contienen & gt; se utilizaron células tumorales 90% para QRT-PCR como tumores. ARN total fue aislado de tejido congelado mediante la extracción de TRIzol (15596, Ambion) y un kit de mirVana miARN Aislamiento (AM1560, Ambion). miARN ensayos se realizaron con un kit de detección de miRNA QRT-PCR mirVana (AM1558, Ambion) junto con QRT-PCT conjuntos de cebadores (4395280, Ambion) de acuerdo con los manuales del fabricante. U6 pequeños ARN nuclear se utilizó como control interno. Los tumores primarios fueron estratificados como miR-106a inferior o superior a discernir si o no los niveles de miR-106a correlacionan con metástasis. Los tumores se consideran miR-106a menor o mayor si la expresión normalizada de miR-106a residía en la parte inferior o superior al 50% de los tumores en el grupo, respectivamente.
El crecimiento celular y la viabilidad Ensayo
Para determinar las tasas de crecimiento, 2,5 × 10
4 células se sembraron en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Veinticuatro horas más tarde, se recogieron y se contaron en un hemocitómetro cada 2 días hasta el día 6. Para determinar la viabilidad celular de las células, las células se tripsinizaron y se diluyeron con 0,4% de azul de tripano (302643, Sigma) solución de tinción y se contaron en un hematocitómetro. Análisis FODA
estadística
los datos se expresan como la media ± error estándar. Una prueba t de Student (dos colas) se utilizó para comparar dos grupos (P & lt; 0,05 se consideró significativo) a menos que se indique lo contrario (χ
2 pruebas)
Apoyo a la Información sobre Table S1. .
Correlación de la expresión de miR-106a con metástasis en pacientes con cáncer colorrectal.
doi: 10.1371 /journal.pone.0043452.s001 gratis (DOC)