Extracto
El efecto de la vacunación preventiva virus del papiloma humano (VPH) en la reducción de la carga del cáncer cervical (CC) no se conocerán durante 30 años. Por lo tanto, sigue siendo necesario mejorar los procedimientos de detección y tratamiento CC. El objetivo de este estudio fue identificar y caracterizar los objetivos celulares que podrían ser considerados marcadores potenciales para el cribado o dianas terapéuticas. Se utilizó una estrategia piramidal. Inicialmente, la expresión de los genes 8.638 se comparó entre 43 CC HPV16-positivas y 12 epitelios cervicales sanas utilizando microarrays. Un total de 997 genes fueron desregulados, y 21 genes que mostró la mayor desregulación fueron validados mediante QRT-PCR. Los 6 genes regulados positivamente (más
CCNB2, CDC20, PRC1, SYCP2, NUSAP1
,
CDKN3
) pertenecen a la vía de la mitosis. Ellos fueron exploradas aún más en 29 neoplasias de bajo grado intraepitelial cervical (CIN1) y 21 CIN de alto grado (CIN2 /3) para investigar si podían diferenciar CC y CIN2 /3 (CIN2 +) de CIN 1 y los controles.
CCNB2
,
PRC1
, y
SYCP2
estaban asociados sobre todo con CC y
CDC20
,
NUSAP1
, y
CDKN3
también se asociaron con CIN2 /3. La sensibilidad y la especificidad de
CDKN3
y
NUSAP1
para detectar CIN2 + fue de aproximadamente 90%. Las proteínas codificadas por los 6 genes regulados por incremento fueron mostrados en CC mediante técnicas de inmunohistoquímica. La asociación de estos marcadores con la supervivencia fue investigada en 42 pacientes CC seguimiento durante al menos 42 meses. Sólo
CDKN3
se asoció con la supervivencia pobre y fue independiente del estadio clínico (HR = 5,9; IC del 95% = 1,4-23,8, p = 0,01).
CDKN3
y
NUSAP1
pueden ser objetivos potenciales para el desarrollo de métodos de detección. Sin embargo, se necesitan más estudios con muestras más amplias para definir la sensibilidad y especificidad óptima. La inhibición de la mitosis es una estrategia conocida para combatir cánceres. Por lo tanto,
CDKN3
puede ser no sólo un marcador de selección y supervivencia, sino una posible diana terapéutica en el CC. Sin embargo, si se trata de indispensable para el crecimiento del tumor queda por demostrar
Visto:. Espinosa AM, Alfaro A, Romano-E Basaure, Guardado-Estrada M, Palma Í, Serralde C, et al. (2013) La mitosis es una fuente de posibles marcadores para la detección y la supervivencia y dianas terapéuticas en el cáncer cervical. PLoS ONE 8 (2): e55975. doi: 10.1371 /journal.pone.0055975
Editor: Michael Scheurer, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Agosto, 2012; Aceptado: January 4, 2013; Publicado: 6 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Espinosa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT, www.conacyt.mx), conceden números 8135 /A1, 24341 (JB) y 80680 (SK), y la Universidad Nacional de México (www.unam.mx ), otorgar SDI.PTID.05.2 número (JB). AME, AA e IMM fueron beneficiarios de una beca del CONACYT. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el virus del papiloma humano (VPH) es el principal factor causal para el desarrollo de cáncer cervical invasivo (CC), y el VPH se encuentra en casi el 100% de estos tumores [1], [2]. Resultados de CC de la progresión de la neoplasia intraepitelial cervical preinvasivas (CIN), que se clasifica en leve histológicamente (CIN 1), moderada (NIC 2) o (3 CIN) displasia severa. CC se produce principalmente a partir NIC3 y CIN2, pero rara vez de CIN 1; las tasas de progresión estimados de estas lesiones a CC son 12%, 5% y 1%, respectivamente [3]. Actualmente, hay vacunas en el mercado que previenen la infección por los tipos oncogénicos de VPH 16 y 18, que están asociados con el 65-70% de los CC en todo el mundo [4]. Estas vacunas tienen una eficacia muy alta para la prevención de la infección y el desarrollo de neoplasias intraepiteliales cervicales de alto grado (CIN2 /CIN3) [5], [6]. Sin embargo, las mujeres vacunadas todavía tienen que asistir a programas de detección precoz de CC ya que estas vacunas sólo protegen contra ciertos tipos de virus, y aún no se sabe cuánto tiempo la protección inmune contra los restos de virus diana [7], [8]. En muchos países las vacunas preventivas para el VPH 16 y 18 se han incorporado en el programa nacional de vacunación, para las niñas de 9 a 12 años de edad [9], [10]. Sin embargo, debido a que el pico de incidencia de CC se produce en las mujeres de 45-50 años de edad, el efecto de estos programas de vacunación preventiva en la reducción de la prevalencia de CC no se conocerá durante 30 años. Por lo tanto, es necesario mejorar los procedimientos de detección y tratamiento CC. Debido a que cada año se reportan 530 000 nuevos casos de CC y 275 CC 000 muertes en todo el mundo, la incidencia de la tasa de mortalidad es aproximadamente del 50% [11], [12].
Durante muchos años, el Papanicolaou (Pap) prueba ha sido el procedimiento de selección más importante para la detección precoz de CC, y su aplicación masiva en los países desarrollados ha disminuido la incidencia de CC en más de un 50% en los últimos 40 años [13]. Las mujeres con citologías anormales están referidas a una colposcopia para confirmar, descartar, o aclarar el diagnóstico con un estudio histopatológico. Sin embargo, la sensibilidad media de la citología para la detección de las lesiones CIN es 50 a 60%; aunque la especificidad es muy alta, aproximadamente el 90% [14]. Dado que el VPH es indispensable para el desarrollo de CC, varios procedimientos para detectar el genoma de HPV han sido incorporados en la detección CC. En comparación con la citología convencional, las pruebas de ADN HPV tiene mayor sensibilidad pero menor especificidad para la detección de lesiones CIN2 o superior (CIN2 +). La alta sensibilidad y un alto valor predictivo negativo (VPN) de las pruebas de ADN del VPH para la detección de lesiones CIN2 + sugieren que podría ser utilizado para ampliar los intervalos de cribado. Sin embargo, la baja especificidad de las pruebas de ADN de VPH se incrementaría el número de pruebas de seguimiento y referencias de colposcopia, lo que aumentaría el costo de revisión [15]. Por lo tanto, la necesidad de desarrollar nuevos métodos para la detección precoz de CC con una alta sensibilidad y especificidad es clara. Los marcadores tumorales múltiples asociados con CIN2 + se han identificado, en especial
CDKN2A
,
TOP2A
, y
MCM2
. Sin embargo, no se han propuesto estos marcadores para la detección, pero para el diagnóstico, pronóstico o tratamiento clínico [11], [16].
cáncer cervical invasivo se trata actualmente con cirugía, quimioterapia, radioterapia o una combinación de estas terapias, dependiendo de la etapa clínica de la enfermedad. El éxito de estas terapias convencionales y la supervivencia del paciente disminuye a medida que la enfermedad progresa a etapas más avanzadas [17]. De hecho, el porcentaje de mujeres que sobreviven 5 años disminuye de 93% para el estadio IA y el 15% para el estadio IVB (www.cancer.org). A diferencia de otros tipos de cáncer, para la que se han desarrollado varios fármacos moleculares específicos [18], no hay terapias moleculares dirigidas específicas para CC. La mayoría de los fármacos contra objetivos específicos en el cáncer se dirigen hacia proteínas mutadas, especialmente proteínas quinasas [19]; sin embargo, algunos medicamentos se dirigen a las proteínas normales que se sobreexpresan, tales como HER2 /neu en cáncer de mama [20], [21]. El primer paso en el desarrollo de un fármaco molecular específico es la identificación de dianas moleculares universales que están presentes en los pacientes con CC y ausente en las mujeres sanas.
El objetivo de este estudio fue identificar y caracterizar los objetivos celulares presentes en la mayoría de los países candidatos y ausente de tejido cervical normal que difieren suficientemente entre los 2 grupos que deben considerarse ya sea como posibles marcadores para la detección, con una sensibilidad y especificidad cerca de 100%, o como potenciales dianas terapéuticas.
Métodos
Declaración de Ética
el protocolo de estudio fue aprobado por los comités científicos y la ética del hospital general de México (número de autorización DIC /03/311/04/051) y se llevó a cabo de conformidad con los principios éticos descritos en 1964 Declaración de Helsinki. Consentimiento informado, se obtuvo de todos los participantes antes de su inclusión en el estudio.
Los sujetos, muestras, y Diseño Experimental
Los sujetos del estudio incluyeron 69 pacientes con cáncer de cuello uterino invasivo (CC) diagnosticado en el Departamento de Oncología, 29 pacientes con NIC de bajo grado (CIN 1), 21 pacientes con CIN de alto grado (CIN2 y CIN3), y 25 mujeres con epitelio cervical normal evaluado en el Departamento de Obstetricia y Ginecología en el hospital general de México En la ciudad de México. Las muestras de CC son un subconjunto seleccionado de entre un total de 462 pacientes con CC que fueron reclutados de forma secuencial a partir de noviembre de 2003 y julio de 2007, lo que representó aproximadamente el 80% de los pacientes con diagnóstico reciente de CC durante este período debido a los criterios de inclusión restrictivas (sin previa tratamiento, caso de incidente, nacido en México con ascendencia mexicana para 2 generaciones). Los criterios de selección para el subconjunto CC se basan en la disponibilidad de una biopsia de tumor fresco para la extracción de ARN con células tumorales más de 70% en el análisis morfológico (ver más abajo), la mayoría de FIGO etapas I /II, y el tipo viral. Este subconjunto incluye 47 muestras positivas para HPV16 y 22 muestras positivas para otros tipos de virus, incluyendo HPV18, 31, 33, 45, 51, 58, y 59. Entre ellos, 54 muestras eran de carcinomas de células escamosas, 14 muestras eran de adenocarcinomas, y 1 de la muestra fue de un carcinoma adenoescamoso. La edad media de los pacientes con cáncer fue de 48 años (rango, 23-78 años; Tabla S1). Todos los pacientes recibieron evaluaciones clínicas completas. Los tumores de los pacientes CC se organizaron de acuerdo con el último protocolo revisado internacional para el cáncer ginecológico [22]. Uno o dos biopsias, llevadas a cabo bajo el examen de colposcopia, se tomaron de los tumores. Una biopsia se dividió en 2 partes iguales, 1 parte se fijó en formol tamponado para el análisis morfológico y la otra parte, junto con la segunda biopsia, fue instantánea congelada en hielo seco y almacenados a -80 ° C hasta su análisis. Todos los pacientes CC fueron remitidos para cirugía, radiación, quimioterapia o una combinación de estos tratamientos de acuerdo con las directrices de la Sociedad Americana del Cáncer (ver más abajo). Control de muestras cervicales se obtuvieron de pacientes sometidas a histerectomía por miomatosis en el Servicio de Ginecología del Hospital General de México. Ellos fueron diagnosticados previamente con un cuello uterino normal por citología y colposcopia. Inmediatamente después de recibir un fragmento de cuello uterino de la sala de operaciones, los epitelios exocervical y endocervicales se diseccionaron bajo un microscopio estereoscópico para evitar que las células del estroma. Los tejidos se congelaron luego en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Para la detección y tipificación de HPV, una raspadura del endocérvix y exocérvix se recogió con un citocepillo de los pacientes y los controles, las células se suspendieron en un vial con tampón de extracción, y luego se almacenaron a -20 ° C hasta su análisis. Análisis de la expresión génica global (8.638 genes) se llevó a cabo en los ARN extraídos de 43 biopsias tumorales recientes positivos para VPH 16 y de 12 muestras de epitelio cervical normal utilizando el microarray HG-Focus. la expresión génica global fue validado en 24 muestras, incluyendo 19 CC y 5 controles epitelio cervical, por un segundo microarrays rendimiento alto (HG-ST1.0). Los 23 genes que mostraron el mayor desregulación fueron validados por PCR en tiempo real (QRT-PCR) en 44 muestras de CC y 25 de control de HPV16-positivas. Los 6 genes expresados diferencialmente más (
CCNB2
,
CDC20
,
PRC1
,
SYCP2
,
NUSAP1
, y
CDKN3
) se exploró adicionalmente en 29 neoplasias de bajo grado intraepitelial cervical (CIN1) y 21 CIN de alto grado (CIN2 /3) para investigar si podían diferenciar CC y CIN2 /3 (CIN2 +) de CIN 1 y los controles. La inmunohistoquímica (IH) se realizó durante 10 proteínas seleccionadas en 26 muestras de CC y 10 muestras de control. La asociación de 9 marcadores con la supervivencia fue investigado por el análisis de supervivencia de 42 pacientes con CC HPV16-positivas que fueron seguidos durante al menos 42 meses.
El aislamiento de ADN y ARN
ADN se purificó a partir raspaduras de cuello uterino y algunos especímenes de biopsia utilizando el ADN genómico PureLink Kit (Invitrogen, Grand Island NY) y se mantiene a -20 ° C hasta su análisis. ARN total fue aislado de un medio de la biopsia dividido usando el reactivo TRIzol (Invitrogen), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La calidad del ARN se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa, como se demuestra por la presencia de ARN ribosómico intacto, con la banda 28s dos veces tan intensa como la banda de 18 años.
Detección y HPV Typing
la detección del VPH se realizó mediante PCR utilizando cebadores universales situados en el VPH
L1
gen
MY09
/
MY11
,
GP5
+ /
6 +
, y
L1C1
como se describe anteriormente [23] - [25]. El
HBB
gen se utilizó como control interno para evaluar la calidad del ADN. Los tipos de HPV fueron identificados por secuenciación de los bandas amplificadas en las muestras positivas utilizando un método de ciclo de secuenciación fluorescente (Kit BigDye Terminator Ready Reaction, Applied Biosystems, Foster City, CA). El análisis de secuencia se realizó usando un analizador genético ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems). Cada secuencia de las muestras de VPH positivos se analizó con la herramienta de secuencia FASTA similitud [26]. La identidad porcentual promedio de estas secuencias a los tipos de VPH fue del 98,7% (rango, 91-100%).
perfiles de expresión génica y análisis de datos
El perfil de expresión génica de 43 CC positivos para HPV16 y 12 controles sanos epitelios cervicales se examinó mediante el Human gene Focus (Enfoque HG) de microarrays de oligonucleótidos (MA) (Affymetrix, Santa Clara, CA). Esta matriz contiene 8.794 conjuntos de sondas correspondientes a 8.638 genes humanos caracterizados en la base de datos de referencia de genes. preparación de ARN total (10 g), la síntesis de cRNA marcado, la hibridación, escaneado, y análisis de imágenes se realizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante (Affymetrix GeneChip Expresión manuales de ensayo). Para evaluar la calidad de los experimentos, se utilizaron los siguientes parámetros: aumento de la expresión de los controles de poli-A exógenas (Lys & lt; Phe & lt; Thr & lt; Dap), la presencia de oligo B2 utiliza para hacer alineaciones de la red, de fondo con un intervalo aceptable de 20 a 100, equivalente de ruido en todas las muestras, el porcentaje de presente llama mayor que 50%, una relación 3 '/5' de un gen constitutivo (GAPDH o β-actina) de menos de 3, y aumento de la expresión de los controles de hibridación (BioB & lt ; bioc & lt; & lt BIOD; CRE). Sólo se analizaron los MAs con los controles de calidad óptimos. Además, algunas muestras se realizaron por duplicado para evaluar la reproducibilidad del experimento, que fue superior a 99%.
valores de intensidad de MA se normalizaron utilizando el algoritmo robusto multichip media (RMA) utilizando software FlexArray [27]. Los valores de intensidad normalizados fueron referidos como unidades de intensidad (IU). Los genes expresados de forma diferente entre los tumores y controles se identificaron utilizando el algoritmo de análisis de la importancia microarrays (SAM versión 3.0, http://www.stat.stanford.edu/~tibs/SAM) usando los valores de corte de un pliegue del cambio ( FC) de ≥1.5, una tasa general falso descubrimiento (FDR), de 1%, y un local FDR de & lt; 10% [28]. Sin supervisión agrupación jerárquica y el análisis de componentes principales (PCA) se realizaron utilizando el software dChip (versión 1.6, www.dCHIP.org) y el lenguaje R en la plataforma de Java, respectivamente.
Validación del Mundial de la Expresión Génica por un segundo alto rendimiento microarrays (HG-ST1.0)
el perfil de expresión de genes de 24 muestras exploradas con el microarray HG-Focus, incluyendo 19 CC y 5 controles epitelio cervical, también se examinó utilizando el gen humano 1.0 ST microarrays de oligonucleótidos ( Affymetrix, Santa Clara, CA). Esta matriz contiene 33.297 conjuntos de sondas que corresponden a aproximadamente 20.741 genes de la base de datos de referencia gen humano de acuerdo con la UCSC Genome Browser Asamblea Mar. de 2006 NCBI 36 /hg18, disponible en http://genome.ucsc.edu/. preparación de ARN total (300 ng), la síntesis de ADN marcado, la hibridación, escaneado, y análisis de imágenes se realizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante (Affymetrix GeneChip Expresión manuales de ensayo). Para evaluar la calidad de los experimentos, se utilizaron los siguientes parámetros: la expresión de los controles exógenos poli-A, la presencia de oligo B2 utiliza para hacer alineaciones de la red, y el área bajo la curva (AUC) valores por encima de 0,8. Sólo se analizaron los microarrays con los controles de calidad óptimos. Microarrays se normalizaron utilizando el algoritmo de RMA en la consola de expresión Affymetrix. Los valores de intensidad normalizados fueron referidos como unidades de intensidad (IU). Las intensidades normalizadas (log
2 valores) de los 8.370 genes que fueron examinados en ambos microarrays (HG ST1 y HG Focus) se compararon, y el nivel de correlación se evaluó con el coeficiente de correlación de Pearson.
Validación Expresión génica del Mundial por cuantitativa en tiempo real Retrotranscripción PCR (QRT-PCR)
la transcripción inversa del ARN total se ha realizado mediante la alta capacidad de cDNA Archivo kit (Applied Biosystems) en un volumen total de 20 mL. La mezcla incluye 2 g de ARN, 2 l de 10 x tampón RT, 0,8 l de mM dNTPs 100, 2 l de 10 cebadores × RT azar, 1 l de MultiScribe ™ transcriptasa inversa (5 U /l), y 1 l de inhibidor de RNasa (2 U /l). Las reacciones se incubaron a 37 ° C durante 120 min, y luego se almacenaron a -20 ° C. Se utilizó un conjunto de 23 genes para validar la expresión génica en 44 cc de HPV16-positivas y 25 muestras de control epitelio cervical sanos con QRT-PCR utilizando sondas TaqMan. Los genes incluidos son
CCNB2, CDC2, CDC20, CDKN2A, CDKN3, CKS2, MCM2, MKI67, NUSAP1, PCNA, PRC1, Rfc4 RRM2, SMC4, SYCP2, TOP2A, TYMS, ZWINT, CFD, EDN3, NDN, SLC18A2 , España y
WISP2
.
GAPDH
se utilizó como control interno. TaqMan ensayos de expresión de genes se utilizan (Tabla S2; Applied Biosystems). Siete genes también fueron explorados en 22 CC positivo para otros virus del papiloma humano (
CCNB2
,
CDC20
,
CDKN3
,
PRC1
,
SYCP2
,
NUSAP1
,
TYMS
), y el primer 6 de ellos, junto con
CDKN2A
,
PCNA
,
MKI67
genes, se exploraron más de 29 CIN de bajo grado y 21 CIN de alto grado. Los experimentos se realizaron por duplicado en un volumen final de 20 l, incluyendo 200 ng de cDNA plantilla, 10 l de 2 × TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems), 1 l de 20 × ensayo TaqMan Gene Expression, y 7 l de -RNasa libre de agua. El programa de ciclos se llevó a cabo en un Rotor-Gene (Corbett Research, Sydney, Australia), que se estableció como sigue: una etapa de activación PCR inicial a 50 ° C durante 2 min seguido de 95 ° C durante 10 min, luego 40 ciclos de punto de fusión de 95 ° C durante 15 s y recocido /extensión a 60 ° C durante 1 min. La mediana de las desviaciones estándar de Ct en los duplicados oscila entre 0,09 y 0,24 (media = 0,16) entre los 23 genes, lo que sugiere que las variaciones entre los duplicados eran muy pequeñas [29]. Medición de la expresión génica se basó en las curvas de calibración relativos construidas a partir de un 10 veces piscina diluido en serie de CC o normales ADNc epiteliales cervicales que van desde 500 hasta 0,05 ng. La primera curva se utilizó para calcular los valores de genes upregulated y de la segunda curva de los valores de genes downregulated. Las curvas para cada gen se pusieron a prueba en tres experimentos diferentes corrieron por duplicado y la media de los coeficientes de correlación (r) fueron superiores a 0,98. La expresión de los genes diana se normalizó en cada muestra de tumor y el control de la intensidad de la referencia interna (
GADPH
) usando un método descrito previamente [30]. Los valores de intensidad normalizados se miden en ng /mL. Una prueba de normalidad (Shapiro-Wilk) se llevó a cabo para comprobar si una distribución normal de los datos de expresión génica. La expresión factor de cambio se calculó dividiendo la intensidad normalizada media de muestras de tumores por la intensidad normalizada mediana de las muestras de control. La significación estadística entre las medianas de los tumores y los controles se calculó con la prueba de Mann-Whitney (MW) prueba no paramétrica. Las correlaciones entre los resultados y los datos MA QRT-PCR se realizaron usando
2 valores de registro y se mide mediante el coeficiente de correlación de Pearson.
La inmunohistoquímica
La expresión de la proteína de 10 genes se determinó en 26 CC y 10 muestras de control con IH. Dos microarrays de tejidos hechos en casa (TMA) fueron construidos, uno que contiene 14 CC HPV16-positivas y 5 controles y los otros 12 CC positivo para otros virus del papiloma humano y 5 controles. NUSAP1 se exploró sólo en muestras de la primera TMA. muestras cilíndricas de regiones representativas de los bloques de tejido incluido en parafina, previamente seleccionados por H & amp; E diapositivas manchadas, fueron tomadas con una aguja de perforación de biopsia (2 mm de diámetro), se transfirió a los bloques de parafina receptores en las posiciones de matriz definidas y recientemente incluidos en parafina. Todos los tejidos bloques de pacientes emparejados se obtuvieron del Departamento de Patología del hospital. Se cortaron secciones seriadas (4 m de espesor) de la TMA y el 10 portaobjetos se tiñeron con H & amp; E para confirmar el diagnóstico histopatológico. Las secciones se sumergieron en xileno para eliminar la parafina y después se rehidrataron en alcohol graduado (100%, 95%, 90%, 80% y 70% v /v en agua). Recuperación del epítopo se realizó por calentamiento de las diapositivas, y su introducción en Target Retrieval Solution, pH 6,0 (Dako, Carpinteria, CA) a 121 ° C durante 5 min en una olla a presión. actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada por incubación de los portaobjetos con peróxido de hidrógeno al 1% en PBS durante 10 min. Después, se añadió un bloqueador de fondo no específica y se incubó durante 10 min. Los anticuerpos primarios contra PCNA (SC-53407); p16 para CDKN2A (SC-71804); SCP-2 para SYCP2 (SC-20048), PRC1 (SC-56345); ciclina B2 para CCNB2 (SC-81241); CDKN3 (sc-475); y CDC2 para p34 (sc-70822), se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos contra CDC20 (cat. 34-1900), Ki-67 para MKI67 (cat. M7187) y NUSAP1 (cat. H00051203-B01) se obtuvieron de Invitrogen, Dako (Glostrup, Dinamarca), y Nova Biológica (Littleton, CO ), respectivamente. La dilución se utiliza para todos los anticuerpos fue 1:100, a excepción de CDC2, (01:50) y NUSAP1 (1:250), y el diluyente de anticuerpo utilizado fue de Dako. Se añadió un volumen total de 300 l a cada sección, y los portaobjetos se incubaron durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda. Los complejos antígeno-anticuerpo se detectaron mediante el método de peroxidasa de avidina-biotina, usando 3,3'-diaminobencidina-tetrahydrocloride como sustrato cromogénico (Cat KO679 LSAB + Sys /HRP;. Dako Cytomation-Carpinteria, CA), y se contratiñeron las secciones con hematoxilina. Los ensayos se realizaron por triplicado. Los anticuerpos para SYCP2, PRC1, CCNB2, CDKN3, CDC2, y CDC20 fueron probados en los tejidos se sabe que expresan estos antígenos. SYCP2 se puso a prueba en los testículos recién nacido; PRC1, CDC2, y CCNB2 se ensayaron en el cáncer de colon; y CDKN3 se probó en biopsias de cáncer de pulmón. Todos los tejidos se obtuvieron de los archivos del Departamento de Patología. El porcentaje de células teñidas se calculó a partir un análisis de 10 campos de alta potencia sucesivas de células neoplásicas. Se identificó la localización celular de la inmunorreacción, y la intensidad de la inmunorreacción se puntuó de 0 a 4, donde 0 indica ninguna tinción. señales reacción inmune se encontraron pocas veces en el estroma con todos los anticuerpos y no se anotó para el análisis. immunostained diapositivas fueron analizados y anotados por 2 patólogos, que fueron cegados a los resultados. raros casos con resultados discordantes sobre fueron reevaluados y obtuvo basan en la opinión de consenso.
Análisis de supervivencia de pacientes con cáncer de
De acuerdo con estadificación FIGO pacientes con cáncer de cuello uterino recibido tratamiento individualizado basado en las directrices de tratamiento para el cáncer de cuello de útero de la Sociedad Americana del cáncer (Ver Tabla 1). Después de completar el tratamiento, cada paciente fue clínicamente evaluados cada 3 o 6 meses por un oncólogo con experiencia. Los datos clínicos del estudio de seguimiento se obtuvo de los pacientes registros médicos. Además, un trabajador social realiza llamadas telefónicas y visitas domiciliarias a los pacientes cada 6 meses durante el estudio. Los pacientes registrados como vivos en el estudio fueron seguidos con éxito durante al menos 42 meses después del tratamiento. Censurados y los pacientes fallecidos fueron seguidos por el número de meses que se indican en la Tabla 1. Los casos designados como censurado que se refiere a aquellos pacientes que se perdieron durante el estudio en el periodo de seguimiento o fallecido por causas distintas al cáncer de cuello uterino. Se consideró que los pacientes pierden cuando no asistió a las citas médicas para el control de la enfermedad, no se encontraron en las visitas domiciliarias o no responder a las llamadas telefónicas. En esta cohorte, los pacientes registrados como fallecidos eran sólo aquellas mujeres que murieron por el tumor primario cáncer cervical como causa principal. La causa de la muerte de todos menos un paciente que murió durante el seguimiento fue confirmado por la historia clínica y el certificado de defunción. Sólo 42 de los 44 pacientes con CC HPV16-positivas explorado con QRT-PCR se incluyeron en el estudio de seguimiento. Cuatro casos fueron considerados censurados por la derecha y se registraron ocho muertes. El tiempo después de media de los 42 pacientes fue de 50,5 meses. La asociación de la FIGO y la expresión génica (
PRC1, CCNB2, CDC20, CDKN3, NUSAP1, SYCP-2, CDKN2A, PCNA, MKI67
) con la supervivencia se investigó mediante análisis de supervivencia. Con todo el conjunto de la muestra, 500 conjuntos de entrenamiento de 21 muestras al azar fueron creados para cada gen estudiado. Para categorizar los datos de expresión génica cuantificados por QRT-PCR, análisis ROC se realizó en cada conjunto de entrenamiento. Este análisis se realizó para establecer una línea de corte para la expresión génica que representa esos valores con la mayor sensibilidad y especificidad para diferenciar entre pacientes muertos y supervivientes. entonces el conjunto de toda la muestra se analizó con la media de corte, calculada a partir de los valores de los 500 conjuntos de formación. Las muestras con valores de expresión génica por encima de la línea de corte se establece en 1 y aquellos con valores por debajo de la línea de corte se ponen a 0. El tiempo de supervivencia global acumulada se calculó por el método de Kaplan-Meier y se analizó mediante la prueba de log-rank. Clasificación de la FIGO y la expresión de genes se incluyeron como covariables en un modelo de riesgos proporcionales de Cox.
Gene Ontología análisis de clasificación
La base de datos para anotación, y Visualización, y Integrado de Discovery (DAVID) funcional herramienta de anotación (http://david.abcc.ncifcrf.gov) [31], [32] y el ingenio Pathway Análisis (IPA; Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com) se utilizaron para clasificar los genes desregulados. Los genes se clasificaron mediante la agrupación anotación funcional teniendo en cuenta los procesos biológicos de ontología de genes. Clasificación rigurosidad se fijó en medio y nivel máximo.
anotación de genes y análisis de datos
La posición física de los genes fue asignada de acuerdo con la UCSC Genome Browser Asamblea Mar. de 2006 NCBI 36 /hg18, disponible en http://genome.ucsc.edu/. El análisis de datos se realizó utilizando Access 2010 (Microsoft Inc). Los datos en bruto MA es compatible con MIAME y se ha depositado en una base de datos compatible con MIAME (GEO, http://www.ncbi.nih.gov/geo/) bajo el número de GSE39001. El análisis característico (ROC) curva operativa del receptor se realizó y se utilizó el índice de Youden [33] para seleccionar los mejores puntos de corte para diferenciar tumores de los controles y CIN2 + de CIN1- utilizando los valores de expresión de determinados genes obtenidos mediante qRT-PCR. Para cada marcador, la sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) se calcularon según las fórmulas descritas anteriormente [34]. Todas las pruebas fueron de 2 caras, y los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis de datos se realizó utilizando Sigma Stat y SPSS ver. 17 software.
Resultados
Análisis de Expresión de 8.638 genes en el cáncer de cuello uterino
La cantidad de ARNm transcrito a partir de 8.638 genes se comparó entre las muestras 43 CC positivos para VPH 16 y 12 de la normalidad muestras epiteliales cervicales utilizando el microarray HG-Focus. Un total de 997 genes que son expresados diferencialmente entre los grupos de cáncer y de control; 600 fueron upregulated y 397 se downregulated (Tabla S3). Casi la mitad de los genes upregulated y downregulated tenía FCs en el intervalo de 1,5 a 2,0, y el número de genes en ambos grupos disminuyó linealmente (r = -0,8, p = 0,002) como el valor FC aumentado (Figura 1). El análisis de componentes principales (PCA; datos no mostrados) y la agrupación jerárquica no supervisada (panel A de la figura 2) llevaron a cabo con todos los 997 valores de expresión génica separa claramente las muestras de cáncer de entre el grupo control. Sin embargo, la expresión de muchos genes no era completamente uniforme entre las muestras de cáncer, especialmente en el grupo de genes upregulated (señales que se muestran en rojo en la figura 2A). Muchos de esos genes se upregulated en algunos tumores y downregulated en otros tumores. Esto estaba en contraste con la uniformidad de las señales de expresión en las muestras del grupo de control. Los genes a ensayar como marcadores para la detección o como potenciales dianas terapéuticas fueron seleccionados de acuerdo al rango Δ-score (una prueba t modificada, utilizados en SAM), FC o si fueron utilizados anteriormente como marcadores para el cáncer de cuello uterino. De los 997 genes asociados con las muestras de cáncer, 163 han sido señalados como marcadores para diferentes tipos de cáncer (IPA, Ingenuity Systems), incluyendo
MCM2
,
TOP2A
, y
CDKN2A
, que han sido utilizados como marcadores para el diagnóstico en el cáncer cervical [35]. Los 997 genes se enumeran en la disminución ordenada por Δ-score (Tabla S3). Se seleccionaron un total de 23 genes (18 upregulated y downregulated 5) para la validación de QRT-PCR (marcada en negrita en la Tabla S3 y en la Tabla 2; círculos coloreados de azul y naranja en la Figura 1). Todos los genes regulados negativamente (
CFD
,
NDN
,
WISP2
,
END3
, y
SLC18A2
) y 10 de los 18 upregulated genes (
PRC1
,
CKS2
,
TYMS
,
RFC4
,
RRM2
,
NUSAP1
,
MCM2
,
CCNB2
,
SMC4
, y
CDC2
) fueron seleccionados de acuerdo al rango Δ-score. Siete de los restantes genes regulados positivamente están en la lista de los 50 genes mejor clasificados, 2 de ellos son los genes que se han propuesto anteriormente como marcadores en CC (
CDKN2A
y
TOP2A
), 4 (
CDC20
,
CDKN3
,
ZWINT
, y
SYCP2
) fueron seleccionados con base en el valor FC, y
PCNA
(Tabla S3), junto con
MKI67
, que se ubicó en el lugar 139 °, se incluyeron debido a que estos marcadores se utilizan comúnmente para medir la proliferación celular. a. a. segundo. do. segundo.