Extracto
El interruptor de transcriptómica descrito recientemente a un programa de la mitosis en el cáncer de próstata resistente a la castración ( CRPC) sugiere que las proteínas de la mitosis pueden ser racionalmente dirigidos en esta fase letal de la enfermedad. En este estudio, hemos demostrado la regulación positiva de la fase de la mitosis a nivel de proteínas en nuestra cohorte de 51 casos CRPC clínicos y encontramos aberraciones centrosomales también se producen preferentemente en CRPC comparación con el cáncer de próstata sensible a las hormonas no se trata, Gleason alta calidad (
P Hotel & lt; 0,0001). Se llevó a cabo perfiles de expresión de muestras CRPC resistentes a la quimioterapia (n = 25), y los resultados se compararon con los datos de CRPC sin quimioterapia previa primaria (n = 10) y los casos de cáncer de próstata sensibles a las hormonas (n = 108). Nuestros resultados mostraron enriquecimiento de genes de fase mitosis y las vías, con la progresión tanto a la enfermedad resistente a la castración y resistentes a la quimioterapia. El kinesin centrómero asociada mitótico (MCAK) fue identificado como un objetivo de la fase de la mitosis novela en el cáncer de próstata que se sobreexpresa en varios CRPC expresión de genes de conjuntos de datos. Encontramos la expresión de genes concordantes de MCAK entre nuestros padres y pares de xenoinjertos CRPC murinos y el aumento de la expresión de proteínas MCAK con la progresión clínica de cáncer de próstata en un estadio de la enfermedad resistente a la castración. Desmontables de MCAK detenido el crecimiento de células de cáncer de próstata que sugiere su utilidad como una posible diana terapéutica
Visto:. Sircar K, Huang H, L Hu, Liu Y, Dhillon J, Cogdell D, et al. (2012) La mitosis fase de enriquecimiento con Identificación de mitótico Centrómero asociada Kinesin como diana terapéutica en cáncer de próstata resistente a la castración. PLoS ONE 7 (2): e31259. doi: 10.1371 /journal.pone.0031259
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 10 de julio de 2011; Aceptado: January 4, 2012; Publicado: 17 Febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Sircar et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este papel con el apoyo de los fondos institucionales de MD Anderson Cancer Center (KS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de próstata es la segunda causa principal de. mortalidad específica por cáncer en los Estados Unidos [1], con la mayoría de las muertes se producen después de fracaso de la terapia de privación de andrógenos cuando el tumor crece a medida que el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC), matar al paciente en un plazo medio de 18 meses. quimioterapia basada en docetaxel se ha establecido como el estándar de cuidado en CRPC, con una pequeña pero definida beneficio en la supervivencia [2], [3]. La identificación de objetivos para esta fase resistente a la castración y la quimioterapia resistente a la terminal de la enfermedad tanto, representa una necesidad insatisfecha en el cáncer de próstata [4], [5].
Un importante avance reciente en este campo fue la demostración de que el andrógeno receptor activa un programa transcripcional fase distinta en la mitosis CRPC pero no en el cáncer de próstata sensible a las hormonas (HSPC) [6], lo que explica en parte el éxito relativo de docetaxel, un agente quimioterapéutico anti-mitótico utiliza para tratar CRPC. Estos resultados también sugieren que otras proteínas de fase mitosis pueden ser objetivos potenciales para las terapias de tratamiento de esta etapa de la enfermedad.
Hemos tratado de validar primero la regulación al alza del programa transcripcional de fase mitosis a nivel de proteínas en CRPC usando clínica HSPC casos de alto grado y CRPC. A continuación comparó los perfiles de transcriptómica de muestras CRPC localizadas que eran resistentes a la quimioterapia con tumores sin quimioterapia previa CRPC y los cánceres de próstata sensibles a las hormonas. Pathway análisis de los datos de nuestros especímenes en casa y bases de datos disponibles públicamente identificados enriquecimiento de los genes relacionados con la mitosis ya que la enfermedad progresó a la vez una fase resistente a la castración y resistentes a la quimioterapia. La quinesina mitótica centrómero-asociado (MCAK), cuya expresión génica fue aumentada en varios conjuntos de datos resistentes a la quimioterapia CRPC, fue seleccionado para la validación clínica y funcional. expresión de la proteína MCAK se asoció con la progresión clínica del cáncer de próstata, y su caída detenido el crecimiento de células de cáncer de próstata.
Resultados
CRPC tumores muestran la expresión de proteínas de fase de la mitosis aumentada y aberraciones centrosomales compararon con de alto grado HSPC
para validar el interruptor transcriptómica putativo a un programa de fase mitosis en CRPC a nivel de proteínas, se utilizó fosfohistona H3 inmunotinción nuclear como un marcador de fase mitosis, como las histonas son fosforilados en el extremo de profase y sus picos de fosforilación en metafase [7]. Hemos examinado cuantitativamente secciones de tejido de microarrays de HSPC y CRPC con el sistema de análisis de imágenes Ariol. Nuestras matrices tisulares incluyen 557 núcleos y & gt; 250.000 núcleos de 75 casos clínicos. Nuestros resultados mostraron regulación al alza significativa de fosfohistona H3 en el carcinoma de próstata resistente a la castración en comparación con HSPC (Figuras 1G-1I y en la Tabla S2). Estos resultados proporcionan evidencia de que las proteínas de fase de la mitosis están regulados por incremento en CRPC. Es importante destacar que los tumores sensibles a las hormonas de alto grado con grados de Gleason de 4/5 también mostraron significativamente menor expresión fosfohistona H3 que los tumores resistentes a la castración de los adenocarcinoma o carcinoma de células pequeñas histologías (P & lt; 0,0001) (Figuras 1G-1J y en la Tabla S2) . Teniendo en cuenta los muy diferentes perfiles de transcripción y comportamiento clínico mucho más agresiva de alta Gleason-grado (grado de Gleason 4/5) cáncer de próstata en comparación con un bajo grado de Gleason (Gleason 3) el cáncer de próstata, nuestros datos pone de relieve el carácter distintivo de CRPC de todo histológico subtipos de HSPC
hematoxilina y eosina (H & amp; e). teñidas secciones que muestran resistente a la castración adenocarcinoma (A), el carcinoma de células pequeñas resistente a la castración (B), y el carcinoma de próstata de alto grado sensible a hormonas ( DO). adenocarcinoma resistente a la castración inmunotiñó con la tubulina gamma (D) y p-histona H3 (G). carcinoma de células pequeñas resistente a la castración inmunotiñó con la tubulina gamma (E) y p-histona H3 (H). carcinoma de próstata de alto grado sensible a hormonas inmunotiñó con la tubulina gamma (F) y p-histona H3 (I). Los asteriscos indican un aumento significativamente el etiquetado para el p-histona H3 marcador de fase de la mitosis (J) y el marcador centrosómicas gamma-tubulina (K) en el carcinoma de próstata resistente a la castración en comparación con el carcinoma de próstata de alto grado sensible a las hormonas.
en el estudio de la fase de la mitosis, que también examinó la abundancia centrosoma, ya que los centrosomas son actores clave en la división celular. Gamma tubulina, un nucleador de los microtúbulos y el marcador de amplificación centrosoma, mostró un aumento significativamente etiquetado citoplásmico en la enfermedad resistente a la castración en comparación con HSPC (P & lt; 0,0001) y HSPC (P = 0,008) de alto grado (Figuras 1D-1F y 1K y Tabla S3). Este resultado está en consonancia con la conocida función de la amplificación del centrosoma y la inestabilidad genética en la progresión de otros tipos de cáncer [8], [9], [10], [11].
Regulación al alza del aparato mitótico de CRPC tumores con la progresión de la resistencia a la castración y la resistencia a la quimioterapia
macrodissected células tumorales que eran resistentes a la castración y resistente a la quimioterapia a partir de muestras quirúrgicas congeladas no metastásicos localizados de 20 pacientes únicos y cinco xenoinjertos derivados de los mismos (Tabla S1). perfilado Transcriptomic de ARN total se realizó en las muestras tumorales y las cinco muestras benignas de la próstata que se usaron para normalizar los datos de expresión. Nuestra matriz de datos en bruto se sometió a GEO (GSE 33277). Como nuestros datos se derivaron de los tumores resistentes a la quimioterapia resistentes a la castración y docetaxel terminales, comparamos el perfil de expresión de ARNm de estas muestras a la de las muestras de las primeras etapas de la progresión del cáncer de próstata. Específicamente, comparamos nuestros datos con los datos de expresión de genes derivados de público sin tratar HSPC (GSE 21032, n = 108) y sin quimioterapia previa CRPC (GSE 6811, n = 10). Tales metanálisis son un reto dadas las numerosas variables que pueden afectar a la intensidad de la señal de hibridación. Para una comparación más fiable, hemos elegido específicamente los conjuntos de datos de no metastásico muestras CRPC localizadas, HSPC y sin quimioterapia previa que se había normalizado a los datos de muestras de próstata benigna agrupadas, o donde se proporcionaron datos de expresión génica de muestras benignas de la próstata que permitieron dicha normalización . Como era de esperar, encontramos la sobreexpresión de los genes de la fase de la mitosis y vías en relación con las muestras no tratadas HSPC del conjunto de datos Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21032). Estos resultados están de acuerdo con los informes anteriores [6] pero el uso de conjuntos de datos y metodologías independientes.
La Universidad de Tokio conjunto de datos (GSE 6811) es uno de los muy pocos que incluye muestras sin quimioterapia previa CRPC. Importancia del análisis de microarrays (SAM) comparando el grupo de quimioterapia previa CRPC con nuestro grupo resistente a la quimioterapia CRPC identificó dos conjuntos de genes informativos que consistían en 2.490 y 2.121 upregulated genes regulados negativamente en el grupo de resistentes a la quimioterapia. Pathway análisis de estos dos conjuntos de genes a cabo utilizando Ingenuity Pathway Analysis demostró que varias vías de regulación del ciclo celular fueron significativamente enriquecido en el conjunto de genes upregulated (Figura 2A). En particular, el grupo de quimioterapia resistente exhibió sobreexpresión significativa de la vía de la mitosis que se trate (Figura 2B), en comparación con el grupo de quimioterapia previa (Figura S1). Además, se superponen análisis de estos dos conjuntos de genes, según la evaluación de un modelo de distribución hipergeométrica (Figura 2C) utilizando mitosis fase (fase M) genes obtenidos de la base de datos MSigDB (http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb /index.jsp), mostró un solapamiento significativo únicamente con los genes que se upregulated en el grupo de resistentes a la quimioterapia (n = 27;
P
= 5,0 × 10
-7). Los genes regulados negativamente en el grupo de resistentes a la quimioterapia no se solapaban de forma significativa con los genes de la fase M (n = 9;
P = 0,416
). Esta observación fue apoyada por el análisis conjunto de genes de enriquecimiento (GSEA; http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp, Versión 3.7), que mostró que el conjunto de genes en fase M fue significativamente enriquecido en la quimioterapia resistente grupo a una tasa de falso descubrimiento (FDR), de & lt; 10% (Figura 2D). Estos análisis sugieren que los genes y las vías de la mitosis asociados pueden estar implicados en la mediación de resistencia a la quimioterapia
.
(A) del ciclo celular vías de regulación son upregulated significativamente en el grupo CRPC resistentes a la quimioterapia (TX) en comparación con la quimioterapia CRPC -naïve grupo. (B) Ingenuity Pathway Analysis. (IPA) del conjunto de genes regulada por incremento demuestra que la vía canónica de las funciones mitóticas de quinasa polo-como se asoció significativamente con el grupo resistente a la quimioterapia CRPC (
P
= 0,004). El
P
valor se calcula mediante la prueba exacta de Fisher. Los genes que están regulados al alza en el grupo de resistentes a la quimioterapia CRPC y están implicadas en esta vía están codificados por color en rojo. Los otros genes que se incluyen en esta vía, pero no están en el conjunto de genes upregulated se indican en blanco. (Véase el texto para la identificación de genes upreguated fijado en detalles). (C) La superposición significativa del gen regulada por incremento establecido en los tumores resistentes a la quimioterapia CRPC con la fase M (n = 27,
P
= 5.00e-7) en comparación con el conjunto de genes regulados a la baja (n = 9,
P = 0,416
). (D) GSEA indicó que la fase M se enriqueció significativamente en el grupo de resistentes a la quimioterapia CRPC en el FDR. & Lt; 10%
mitótico-centrómero asocia quinesina se asocia con la progresión de la resistencia a la terapia, mientras que su silenciamiento inhibe el crecimiento de células de cáncer de próstata
el examen de los reguladores mitóticos alteradas específicamente en nuestros datos transcriptomic nos llevó a identificar los genes que codifican para la familia kinesin mitótica de las proteínas motoras como se upregulated en las muestras resistentes a la quimioterapia CRPC. Estos mitótico kinesins también se upregulated en otros dos grandes conjuntos de datos resistentes a la quimioterapia CRPC de la Universidad de Michigan (GDS 1439) y el Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21032). Elegimos el mitótico kinesin centrómero-asociado (MCAK) como un objetivo en el cáncer de próstata, ya que era nueva y había marcado la sobreexpresión del gen MCAK (
P
= 1,55 × 10
-15) en localizada CRPC del conjunto de datos MD Anderson Cancer Center, en comparación con la hormona casos sensibles de cáncer de próstata (n = 108) del conjunto de datos Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21032). MCAK también se reguló con la progresión metastásica al CRPC dentro de la cohorte del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (
P = 3,73
× 10
-10) (Figura S2). Por otra parte, encontramos la expresión concordantes de MCAK tanto en nuestros tumores CRPC de padres humanos y murinos xenoinjertos derivados de dichos tumores (
r = 0,428
) como se muestra en la Figura S3. posteriormente Se midió la expresión de proteínas MCAK por análisis inmunohistoquímico de microarrays de tejidos de la hormona sensible independiente (n = 38) y (n = 51) de los casos resistente a la castración. Encontramos MCAK tinción citoplasmática que se asoció significativamente con la progresión clínica de la enfermedad resistente a la castración (P & lt; 0,0001). (Figuras 3A-D y la Tabla S4)
secciones MCAK-inmunotinción de adenocarcinoma resistente a la castración (A) , carcinoma resistente a la castración de células pequeñas (B), y carcinoma de próstata sensible a las hormonas (C). D) aumentó significativamente el etiquetado para la mitótico proteína centrómero asociada con la progresión de MCAK CRPC, indicado por asteriscos.
Para determinar los efectos de derribar MCAK en HSPC y CRPC, hemos utilizado dos conjuntos distintos de pequeños ARN de interferencia (siRNA) específico para MCAK para silenciar su expresión en LNCaP sensible a hormonas y líneas celulares de cáncer de próstata C4-2B sin quimioterapia previa resistentes a la castración. Ambas líneas celulares CRPC y HSPC mostraron expresión de la proteína intrínseca MCAK abundante y ambos mostraron inhibición del crecimiento después de 3 días de MCAK caída con la primera siRNA (si-MCAK#1) como se evaluó mediante un ensayo MTT (Figura 4A-D) (C4-2B : 3 d, P = 5,45 × 10
-7; 4 d, P = 4,85 × 10
-10; 5 d, P = 3,78 × 10
-8; LNCaP: 3 d, P = 1,43 × 10
-3, 4 d, P = 3,86 × 10
-5; 5 d, P = 1,48 × 10
-5). Similares resultados de la segunda serie de siRNA (si-MCAK#2) se muestran en la figura S4.
A) Western blot confirma desmontables de MCAK por si-MCAK 1 #. lisados de células enteras de células LNCaP transfectadas con si-control (C) o si-MCAK#1 (M) se recogieron en diferentes puntos de tiempo después de la transfección, tal como se indica. Tubulina se utilizó como control de carga. B) Ensayo de crecimiento de las células MTT. células LNCaP fueron tratadas igual que en A), y después de un 24-h de la transfección, 4.000 células se sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (n = 10 para cada grupo) y el ensayo de MTT se realizó en un 24 h intervalo. C) Western blot confirma desmontables de MCAK con si-MCAK#1. lisados de células enteras a partir de células transfectadas con C4-2B si-control (C) o si-MCAK#1 (M) se recogieron en diferentes puntos de tiempo después de la transfección, tal como se indica. Tubulina se utilizó como control de carga. D) Ensayo de crecimiento de las células MTT. células C4-2B fueron transfectadas con el control de Si y Si-MCAK#1, respectivamente. Después de un 24-h de la transfección, se sembraron 4.000 células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se incubaron durante diferentes períodos de tiempo, como se indica, seguido por el ensayo de MTT (n = 10 para cada grupo).
Discusión
en este estudio, se han ampliado los resultados de Wang et al [6] mediante la validación, a nivel de proteínas, el interruptor de transcriptómica a un programa de la mitosis en un conjunto independiente de muestras clínicas y CRPC mostrando que las diferencias entre resistentes a la castración y de la hormona sin tratar cánceres de próstata sensibles se mantienen incluso cuando se comparan los cánceres de próstata de grado alto de Gleason. Este es un hallazgo importante dados los diferentes programas de transcriptómica observados en los cánceres de próstata con notas bajas y altas Gleason [12] que reflejan su comportamiento clínico difieren dramáticamente. También hemos demostrado aberraciones centrosomales ocurrir preferentemente en CRPC, de acuerdo con la división celular anormal que se observa en otros cánceres avanzados. Estos resultados apoyan el concepto de que CRPC es biológicamente diferentes y no simplemente una extensión de la hormona de alto grado del cáncer de próstata sensible, a pesar de sus similitudes histológicas y la propensión a la agresividad clínica.
Mediante la comparación de los perfiles de transcriptómica de muestras quirúrgicas CRPC que estaban sin quimioterapia previa con nuestros datos CRPC resistentes a la quimioterapia, se encontró enriquecimiento de proteínas de fase mitótica y caminos en los tumores resistentes a la quimioterapia. Entre los genes relacionados con la mitosis, seleccionamos la familia quinesina mitótica de las proteínas motoras para estudiar en particular adicional MCAK, que no ha sido estudiado previamente en el cáncer de próstata. mitótico kinesins se sabe que juegan un papel crucial en la regulación del aparato del huso mitótico durante la división celular. Están involucrados en la proliferación celular y están regulados por Aurora-B quinasa [13]. La progresión de pulmón, cerebro, y el cáncer de colon [14] [15] ha sido asociado con la expresión aumentada de quinesina, mientras que su inhibición se ha traducido en la detención del ciclo celular en la fase de la mitosis [16], [17]. Mitótico kinesin-centrómero asociado es abundante en los centrosomas, despolimeriza los microtúbulos, y media la transición de metafase a prometaphase [18], entre otras funciones esenciales relacionadas con la segregación cromosómica adecuada [19] durante la división celular. La sobreexpresión de kinesins mitóticas, que se postulan para trabajar al contrarrestar el efecto de estabilización de microtúbulos de la quimioterapia basada en taxano, se ha relacionado con docetaxel resistencia en cáncer de mama [20], y MCAK sobreexpresión se ha relacionado causalmente con la resistencia a paclitaxel [21].
Orientación mitótico kinesins está surgiendo de este modo como una modalidad de tratamiento atractiva en los cánceres que son refractarios a la quimioterapia basada en taxanos que actúan sobre el huso mitótico, ya que la inhibición de kinesin motor proteínas no se dirige directamente a los microtúbulos. Por otra parte, kinesins mitóticas no se expresan por las neuronas [22] y son sustratos pobres para la bomba de eflujo de P-glicoproteína [23], que resultan en la neurotoxicidad y a múltiples fármacos resistencia limitante de la dosis de docetaxel. Por lo tanto, la inhibición de la quinesina mitótica es la hipótesis de inducir la detención del ciclo celular-mitosis específico que puede complementar protocolos quimioterapéuticos actuales con menos efectos secundarios [18].
Diferentes kinesins mitóticas sirven funciones específicas, y el papel de estas proteínas en cáncer de próstata sólo se ha explorado con respecto al elemento más bien establecido de esta familia, kinesin proteína husillo (KIF11 /Eg5), cuyo silenciamiento se ha demostrado que inhibe el crecimiento de líneas LNCaP y células PC3
in vitro
y
in vivo
[24], [25]. ensayos clínicos de fase temprana en pacientes CRPC utilizando la primera generación de inhibidores de Eg5, ispinesib, han tenido un éxito limitado [26] [27]. Sin embargo, los inhibidores de Eg5 de nueva generación se ha informado que exhiben una mayor eficacia
in vitro
[28], y un tercer ensayo clínico está actualmente reclutando pacientes a partir de una variedad de tumores malignos, incluyendo el cáncer de próstata resistente a la castración (# NCT01065025) .
En resumen, hemos demostrado el enriquecimiento de las vías de la fase de la mitosis y proteínas como el cáncer de próstata progresa tanto a un estado resistente a la castración y resistentes a la quimioterapia. Se examinó el papel de MCAK por primera vez en el cáncer de próstata y demostramos que la expresión de MCAK se correlaciona con la progresión clínica de la enfermedad. Por otra parte, hemos demostrado la inhibición del crecimiento en líneas celulares de próstata resistentes a la castración MCAK silenciados. En conjunto, nuestros resultados sugieren que MCAK es una proteína funcionalmente importante en el cáncer de próstata terminal. Los estudios de seguimiento basado en el presente informe debe incluir el uso de inhibidores sintéticos dirigidos contra MCAK (por ejemplo, la patente#7.294.640, Merck) en modelos preclínicos y en futuros ensayos clínicos de cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Ética declaración
se obtuvieron sensible a las hormonas y las muestras de tejido de cáncer de próstata resistentes a la castración con la aprobación de la de las juntas de revisión institucional de la Universidad de Texas MD Anderson Centro del cáncer (Houston, Texas) y la Universidad McGill (Montreal, QC, Canadá). Las muestras de tejido utilizadas para desarrollar MDA PCa 79, MDA PCa 117-9, MDA PCa 124, MDA PCa 130, MDA PCa 149-1, 180-30 y MDA CaP xenoinjertos se obtuvieron a partir de muestras tumorales de muestras quirúrgicas (Cistoprostatectomía, la prostatectomía radical o exenteración pélvica) de un cáncer de próstata resistente a la castración primaria progresiva. escrito el consentimiento informado se había obtenido de los pacientes antes de la adquisición de muestras, y las muestras fueron procesadas de acuerdo con un protocolo aprobado por el MD Anderson junta de revisión institucional, incluyendo la aprobación del comité de cuidado y uso de animales. Los números de protocolo de laboratorio que cubrían el uso de estas muestras son MDACC LAB 03-0336 y 09-0213 LAB.
muestras de tejido de pacientes
tejidos molecularmente perfilados fueron derivadas a partir de muestras tumorales congeladas MD Anderson de pacientes con la castración y el cáncer de próstata resistente a la quimioterapia (n = 20) y de los controles de tejido benigna de próstata (n = 5). Las muestras resistentes a la quimioterapia resistentes a la castración se tomaron de cistoprostatectomías de salvamento o exenteraciones pélvicos. También se evaluaron los xenoinjertos murinos derivados de cinco de estos 20 tumores que muestran una histología de adenocarcinoma. Los datos clínicos de las muestras genómicamente perfilados se incluyen en la Tabla S1. Cuatro microarrays de tejidos se utilizan para validar los datos genómicos y consistieron en muestras incluidas en parafina fijadas con formalina de 58 pacientes con HSPC y 51 pacientes con CRPC.
perfiles de expresión de ARNm y el análisis del tumor
expresión evaluó a través de un kit de todo el genoma humano microarray de ADN de Agilent (prod#G4112F) de acuerdo con el protocolo del fabricante y como se ha descrito anteriormente [29]. Nuestros datos CRPC se normalizó a los valores medios de expresión de genes a partir de cinco muestras benignas de la próstata para encontrar los genes upregulated o downregulated utilizando un valor de tasas de registro & gt; 0,3 como punto de corte para los genes informativos presentes en más de dos tercios de los casos. Comparamos nuestra expresión de datos de perfiles de la Universidad de Michigan (GDS 1439), Universidad de Tokio (GSE 6811), y el Memorial Sloan Kettering Cancer Center (GSE 21032) conjuntos de datos. Para estos conjuntos de datos, la normalización se llevó a cabo en contra de sus controles internos (muestras benignas).
El análisis inmunohistoquímico
Estándar 3,3 'diaminobencidina (DAB) Análisis inmunohistoquímico de microarrays de tejidos se realizaron con un Dako AutoStainer Plus (Dako) usando un anticuerpo de ratón MCAK monoclonal anti-humano (Abgent AT2621a) a una dilución de 1:50, un anticuerpo fosfo-histoneH3 (Santa Cruz SC-8656) a una dilución 1:100, y un anticuerpo gamma-tubulina (Abcam AB27074) a una dilución 1:400, como se describe anteriormente [30]. La tinción para gamma-tubulina y MCAK se evaluó de forma manual mediante la asignación de un valor positivo por ciento a cada caso basado en el marcaje inmunohistoquímico agregado de todos los núcleos de tejido que pertenecen a ese caso.
imagen Análisis automatizado
La fosfohistona núcleos H3-positivos fueron evaluados cuantitativamente utilizando el análisis automatizado de imágenes con el software Ariol de Applied Imaging (Genetix Ltd.). A, algoritmo de cuantificación nuclear automatizado hechos a medida utilizando el software Ariol se preparó basándose en las variaciones de color de la mancha marrón en las células DAB-positivas frente al fondo negativo hematoxilina nuclear para conseguir un porcentaje de positivos por área preseleccionada de la representación en cada diapositiva .
cultivo de células
células
C4-2B depositado en el MD Anderson se desarrollaron después de paso en serie de células LNCaP en huéspedes castrados cuando las células ya no eran sensibles a la manipulación de andrógenos en los animales (PMID: 8168083 ). células LNCaP se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Ambas líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10% a 37 ° C con una atmósfera de 5% de CO
2.
estudios de xenoinjertos
Las muestras de tejido utilizadas para desarrollar el MDA PCa 79, MDA PCa 117-9, MDA PCa 124, MDA PCa 130, 149-1 y MDA CaP xenoinjertos fueron tejidos residuales de la resección quirúrgica (cistoprostatectomía o exenteración pélvica) del CRPC primaria progresiva. piezas tumorales pequeñas se implantaron en bolsillos subcutáneos de los ratones CB17 SCID de 6 a 8 semanas de edad machos (Charles River Laboratories). Los tumores desarrollados dentro de los 6 meses y se mantuvieron en los ratones, ya que las células no podrían cultivarse
in vitro
. Los métodos de paso y de procesamiento de tumor utilizados fueron los mismos que los reportados previamente (PMID: 18618013).
transfección SiRNA
El LNCaP o células C4-2B se sembraron en una placa de 6 pocillos a una densidad de 5 × 10
4 células /pocillo y se cultivaron en medio RPMI1640 suplementado con 10% FBS bajo condiciones de cultivo de tejidos normales. Después de 20 a 24 h de incubación, siRNA transfección se realizó utilizando LipofectamineRNAiMax reactivo de Invitrogen (Invitrogen, cat#56532) siguiendo el protocolo del fabricante. Dos conjuntos de si-MCAK siRNA se utilizaron para los experimentos. si-MCAK#1 fue adquirido de Ambion (Ambion, cat#4390824) y la si-MCAK#2 fue adquirido de Dharmacon (Chicago, IL, EE.UU., cat#L-004955-00). El control negativo universal#1 siRNA de Sigma (cat#SIC-001) se utilizó como control. La concentración final de la siRNA fue 50 nM.
análisis de transferencia de Western
anticuerpo monoclonal
MCAK se obtuvo de Abgent (cat#AT2621a) y ambos β-actina (cat#sc-1616) y β-tubulina (cat#sc-9104) fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Western Blot se realizó como se describe [31]. Brevemente, los extractos de células que contienen 30 g de proteína se resolvieron por electroforesis SDS-PAGE 10%, se transfirieron a membranas de Hybond ECL de nitrocelulosa (Amersham Pharmacia Biotech) o membranas de fluoruro de polivinilideno (Cat#IPVH20200) de Millipore (Millipore Corporation, cat.#IPVH20200) , bloqueado en 5% de leche sin grasa en 1 x Tris-solución salina tamponada con más 0,05% de tween-20 (pH 8,0) y se sondaron con anticuerpos primarios a concentraciones de 1:1000 para MCAK y 1:2500 para β-actina o β-tubulina. Los anticuerpos secundarios se usaron a concentraciones de 1:10,000. Las proteínas se visualizaron utilizando el SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Prod#34708) o SuperSignal West Femto máxima sensibilidad Substrato (Prod#34096) de Pierce (Pierce Chemical, Rockford, IL, EE.UU.).
Ensayos de proliferación celular
la proliferación celular se determinó mediante un ensayo MTT de absorbancia. Las células transfectadas ya sea con el control de siRNA (si-control) o MCAK siRNA (si-MCAK) se trataron con tripsina de los platos en 24 h después de la transfección y 4.000 células en 200 l de medio completo se sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos ( n = 10). Se dejó que las células se unieran durante 24 h en medio completo, y el ensayo de MTT se realizó a intervalos de 24 horas posteriormente. Después de un 2,5 h de incubación con 50 uM de reactivo MTT en condiciones de cultivo celular normales, los pocillos se vaciaron por aspiración al vacío, y 200 l de DMSO se añadieron a cada pocillo. La absorbancia se midió a 590 nm con un lector de microplacas. (MRX; Laboratorio Danatech)
El análisis estadístico
Los datos se expresan como la media +/- S. D. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando
t-test
y la suma de rangos de Wilcoxon test de Student. Las diferencias en los medios fueron evaluados utilizando una de dos colas
t-test
, suponiendo varianzas desiguales. Un value≤0.05 P fue considerado estadísticamente significativo.
Apoyo a la Información
Figura S1. vías
Mitosis no están asociados con el gen downregulated establecido en la enfermedad resistente a la quimioterapia CRPC. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) del conjunto de genes regulados a la baja muestra que la vía canónica de las funciones mitóticas de quinasa polo-como no se asoció significativamente con el grupo resistente a la quimioterapia CRPC (
P
= 0,16). El
P
valor se calcula mediante la prueba exacta de Fisher. Los genes que están regulados a la baja en el grupo de resistentes a la quimioterapia CRPC y están implicadas en esta vía están codificados por color en verde. Los otros genes que se incluyen en esta vía, pero no están incluidos en el conjunto de genes regulados a la baja se indican en blanco | doi:. 10.1371 /journal.pone.0031259.s001 gratis (TIF)
figura S2. El aumento de los niveles de transcripción
MCAK con progresión a CRPC. (A) muestra la regulación positiva MCAK transcriptómica en CRPC localizada (
P
= 1,55 × 10
-15) y (B) metastásico CRPC (
P = 3,73
× 10
- 10) en comparación con HSPC
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031259.s002 gratis (TIF)
Figura S3.
La concordancia de la expresión génica entre MCAK xenoinjertos de ratón (CRPC MDA-79, MDA-117, MDA-130, MDA-149) y sus correspondientes tumores de padres humanos (
r = 0,428
).
doi: 10.1371 /journal.pone.0031259.s003 gratis (TIF)
figura S4.
la inhibición del crecimiento de células LNCaP y C4-2B por si-MCAK#2. A) Western blot confirma desmontables de MCAK por si-MCAK#2. lisados de células enteras de células LNCaP transfectadas con si-control (C) o si-MCAK#2 (M) se recogieron en diferentes puntos de tiempo después de la transfección, tal como se indica. La actina se utilizó como control de carga. B) MTT ensayos de crecimiento celular. células LNCaP fueron tratadas igual que en A), y después de un 24 h de la transfección, se sembraron 4.000 células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (n = 6 para cada grupo) y seguido por el ensayo de MTT. C) Western blot confirma desmontables de MCAK con si-MCAK#2. lisados de células enteras a partir de células transfectadas con C4-2B si-control (C) o si-MCAK#2 (M) se recogieron en diferentes puntos de tiempo después de la transfección, tal como se indica. La actina se utilizó como control de carga. * Indica las bandas no específicas. D) los ensayos de crecimiento celular MTT. C4-2B células fueron transfectadas con el control de Si y Si-MCAK#2, respectivamente. Después de un 24 h de la transfección, se sembraron 4.000 células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos y se incubaron durante diferentes períodos de tiempo, como se indica, seguido por el ensayo de MTT (n = 5 para cada grupo)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031259.s004 gratis (TIF)
Tabla S1.
Abreviaturas: CXPX - Cistoprostatectomía; PE - exenteración pélvica; RTU - resección transuretral; TAB - bloqueo total de andrógenos (Lupron + Casodex); LHRH - Lupron; ORCH - orquiectomía bilateral; XRT - radioterapia. * Un pequeño componente de carcinoma de células fue perfilado de un pequeño tumor mixto histología de células /adenocarcinoma
doi:. 10.1371 /journal.pone.0031259.s005 gratis (DOC) sobre Table S2.