Extracto
Antecedentes
quimioterapia basada en platino es una estrategia estándar para cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), mientras que la quimiorresistencia sigue siendo un gran reto terapéutico en la práctica clínica actual. Nuestro presente estudio tuvo como objetivo determinar si la inhibición de la ruta de NF-kB /miR-21 /PTEN podría aumentar la sensibilidad de NSCLC al cisplatino.
Métodos
La expresión de miR-21 en tejidos de NSCLC se determinó utilizando hibridación in situ. A continuación, se determinó el efecto de miR-21 en la sensibilidad de las células A549 a cisplatino in vitro. Ya sea que el miR-21 PTEN expresión regulada se evaluó mediante el ensayo de luciferasa. Por otra parte, si NF-kappa B dirigido sus elementos de unión en el promotor del gen miR-21 se determinó mediante el ensayo de la luciferasa y la ChIP. Por último, se midió la viabilidad celular y la apoptosis en tratamiento con cisplatino cuando NF-kB se inhibió.
Resultados
Se observó un nivel elevado de miR-21 en los tejidos del pulmón NSCLC y se relaciona con una corto tiempo de supervivencia. Exógena de miR-21 promueve la supervivencia celular cuando están expuestos a cisplatino, mientras que la inhibición de miR-21 podría revertir este proceso. Los niveles de ARN y de proteínas de PTEN se redujo significativamente por exógenos miR-21, y la región 3 'no traducida de PTEN ha demostrado ser un objetivo de miR-21. La expresión de miR-21 estaba regulada por NF-kB se una a su elemento en el promotor, un hallazgo que fue verificada por el ensayo de luciferasa y chip. Por lo tanto, la inhibición de NF-kB por silenciamiento de ARN protege las células contra el cisplatino a través de la disminución de la expresión de miR-21.
Conclusión
La modulación de la vía /PTEN NF-kB /MIR-21 mostró en el CPNM que la inhibición de esta vía puede aumentar la sensibilidad a cisplatino
Visto:. Yang Z, fang S, Di Y, Ying W, Tan Y, W Gu (2015) la modulación de NF-kB /miR-21 /PTEN Camino sensibiliza células no pequeñas de cáncer de pulmón que cisplatino. PLoS ONE 10 (3): e0121547. doi: 10.1371 /journal.pone.0121547
Editor Académico: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Francia |
Recibido: 14 Octubre, 2014; Aceptado: February 2, 2015; Publicado: 23 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado financieramente por el Programa del Departamento de Salud de Jiangsu (H201341). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), que comprende el carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma indiferenciado de células grandes, es el tipo más común de cáncer de pulmón [1,2]. La genética juega un papel esencial en el mecanismo fisiopatológico de NSCLC [3,4], y que conduce a la no sensibilidad de NSCLC a la quimioterapia basada en platino [5], lo que resulta en el CPNM siendo la causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo [ ,,,0],1]. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevos objetivos de medicamentos basados en la genética molecular
.
Los microARN (miARN) han sido implicados como moduladores clave de múltiples genes diana a través de la maquinaria de interferencia de ARN endógeno [6]. Contribuyen a la biología del cáncer mediante la alteración de la expresión de sus genes diana [7]. miR-21 es un tipo de miARN que funciona como un potente modulador del comportamiento de células tumorales y la transformación maligna [8]. Se ha encontrado para aumentar el crecimiento celular en el cáncer de hígado y ha demostrado propiedades anti-apoptóticas en glioblastoma [9]. En CPNM, miR-21 también juega un papel fundamental en la proliferación celular, la invasión y la apoptosis [10]. Estudios previos han demostrado que el miR-21 regula la expresión de fosfatasa y tensina homólogo (
PTEN
) a través de la orientación directa de su región 3 'no traducida (3'UTR) [8].
PTEN
, un gen supresor de tumor, juega un papel esencial en la regulación del ciclo celular, la apoptosis y la formación de muchos tipos de tumores sólidos, incluyendo NSCLC [10]. Se regula negativamente los niveles intracelulares de fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato (PI3K) en las células y funciona como un supresor de tumores, regulando negativamente la vía de señalización Akt [11]. En condiciones normales, la expresión y la activación de
PTEN
está estrechamente controlada, mientras que las expresiones de miRNAs se dysregulated en el CPNM. La alteración de
miR-21 /PTEN
fue encontrado en pacientes con CPNM con resistencia a gefitinib [12].
Dado el papel esencial de la vía de miR-21 /PTEN en el CPNM, sigue habiendo una pregunta respecto a por qué la expresión de
miR-21
se incrementa en el CPNM. Se realizó una búsqueda bioinformática (http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi) y encontramos cuatro elementos de unión de NF-kB en el promotor de la
miR-21
gen. Además, un grupo de investigación demostró que el daño del ADN inducido
miR-21
upregulation y promovió la invasión de células de cáncer de mama de una manera NF-KB dependiente de [13]. Por lo tanto, se asumió que el NF-kappa B se incrementó el nivel de
miR-21
, lo que redujo
PTEN
expresión post-transcripcionalmente para promover la supervivencia celular bajo tratamiento con cisplatino en el CPNM; Por lo tanto, la inhibición de la ruta de NF-kB /miR-21 /PTEN podría ser una diana terapéutica potencial para el NSCLC.
Métodos
microarrays de tejidos
microarrays de tejidos (TMA) fue preparado a partir de tejidos derivados de 34 pacientes con NSCLC y 10 pacientes sin CPNM entre enero de 1999 y agosto de 2007. el estudio se realizó de conformidad con la Declaración de Helsinki (1989) y fue aprobado por el Comité de Ética local (primer hospital de Nanjing, Nanjing Universidad de Medicina, Nanjing, china). escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente. El área representativa fue cuidadosamente seleccionado a partir de una sección de hematoxilina y eosina teñidas (HE), y luego un núcleo de tejido 1,5 mm se obtuvo a partir de los bloques de parafina correspondientes. A partir de entonces, el material embebido en parafina se cortó en secciones de 5 micras y se coloca en un portaobjetos, seguido de tinción con HE o hibridación in situ (ISH). Las secciones se observan bajo un microscopio óptico (Olympus, Japón). CPNM fue diagnosticada por dos patólogos independientes según la Unión Internacional para el sistema de clasificación de Control del Cáncer (UICC), 7ª edición. La intensidad de la tinción se puntuó como sigue: 0, sin tinción de las células; 1, tinción débil; y 2, una fuerte tinción. El porcentaje de células teñidas se clasificó usando una escala de 3 grados: 0, no hay células positivas; 1, y lt; 50% de células positivas; y 2, & gt;. 50% de células positivas
ISH
ISH de
miR-21
se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante (MK10013, Boster, China). En pocas palabras, después de la desparafinación de los portaobjetos en xileno y etanol, los portaobjetos se incubaron con 3% de H
2O
2 durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se digirió con pepsina durante 10 min a 37 ° C. Después de enjuagar en agua, los portaobjetos se fijaron con 1% PFA en DEPC (Generay, China) para 10 min. a continuación, las secciones se lavaron en agua tres veces y se incubaron con tampón de prehibridación durante 4 horas a 42 ° C y el tampón de hibridación durante la noche a 42 ° C con una sonda de miR-21 (5'-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3 '). Los portaobjetos se lavaron como sigue: 2 x SSC durante 5 min a 37 ° C, dos veces; 0,5 x SSC durante 15 minutos a 37 ° C, una vez; y 0,2 x SSC durante 15 minutos a 37 ° C, una vez. El tejido se incubó en tampón de bloqueo a 37 ° C durante 30 min y luego se incubó con el complejo estreptavidina-biotina (SABC). Después de lavar tres veces con PBS, los portaobjetos se incubaron con conjugado de polímero peroxidasa de rábano picante para una 30 minutos adicionales a temperatura ambiente. Posteriormente, se tiñeron con 3,3-diaminobencidina y contraste con hematoxilina (Sigma-Aldrich, EE.UU.).
Cultivo de células
HEK293 células y las células A549 se cultivaron y se mantuvieron en Dulbecco modificado Eagle medio (DMEM, Invitrogen, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS, Gibco, EE.UU.), penicilina 100 U /ml y estreptomicina 100 g /ml (Gibco).
Construcción del plásmido y lentivirus recombinante
el humano
NF-kB
fragmento (p65) gen amplificado por PCR se clonó en pcDNA3 y la inserción fue confirmada por secuenciación. A continuación, el plásmido pcDNA-NF-kB fue digerido por EcoRI /XbaI. Los productos digeridos se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa. El
NF-kB
fragmento del gen se purificó mediante extracción en gel y posteriormente se clonó en pLVX-RIEA-ZsGreen1. Una construcción de shRNA orientación NF-kB también se clonó en pLVX-RIEA-ZsGreen1. lentivirus recombinantes Lenti-shNF-kB y Lenti-NF-kB se produjeron y se valorarán de acuerdo con un informe anterior [14]. El marco de lectura abierto entero de
PTEN
con o sin el
miR-21
secuencia de dirección en el 3'UTR se clonó en el vector pcCS2 con una etiqueta Myc para construir pcCS2-PTEN-3 'UTR y pcCS2-PTEN, respectivamente
La transfección de
miR-21
imita. e inhibidor
Los 2'-O-Me-FAM-oligonucleótidos modificados se sintetizaron químicamente y se purificó por cromatografía líquida de alta resolución (GenePharma, china). La 2'-O-Me-miR-21 mímica se compone de ARN dúplex con la siguiente secuencia: 5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3 '; las secuencias de 2'-O-Me-miR-21 y el inhibidor de oligonucleótidos-me revueltos-2'-O fueron los siguientes: 5'-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3 '; y 5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 '. Las células se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de 5 x 10
4 células por pocillo y se cultivaron hasta 80% de confluencia. Los miméticos de miR-21 o inhibidores de miR-21 a una concentración de 50 nM cada uno se transfectó en las células utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE.UU.) por incubación en medios Opti-MEM I (Invitrogen) durante 4 h. Las células después se transfirieron a medio de cultivo fresco. Después de la incubación durante 24 h, el medio de cultivo se reemplazó y las imágenes fluorescentes se adquirieron para monitorear la eficiencia de transfección. Después de 48 h, las células se recogieron para su análisis.
-PCR en tiempo real
El ARN total fue aislado de las células usando el reactivo Trizol (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para
miR-21
QRT-PCR, el ARN total fue transcrito invertir utilizando un cebador-miARN específico y el kit miScript transcripción inversa (Qiagen, Alemania). Tallo-bucle QRT-PCR se realizó con la PCR Master Mix verde SYBR (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Expresión relativa se evaluó por el método comparativo Ct y se normalizó a la expresión de U6 ARN pequeño nuclear. la transcripción para la detección de
PTEN
, inversa se llevó a cabo utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena (Promega, EE.UU.) siguiendo las recomendaciones del fabricante. QRT-PCR se realizó utilizando el Kit QuantiFast SYBR Green PCR (Qiagen). El
GAPDH
nivel de ARNm se empleó como control interno. Todas las muestras se analizaron por triplicado en tres experimentos independientes. Las reacciones en ausencia de ADNc se utilizaron como control sin plantilla y no-RT controles también fueron establecidos para evitar la contaminación de ADN genómico. La cuantificación relativa de la expresión de ARNm se determinó utilizando el método comparativo Ct.
Western Blot
Las células se homogeneizaron en tampón RIPA (Cell Signaling-Tech., EE.UU.). Las concentraciones de proteína se determinaron usando un kit BCA (Beyotime, China). Cantidades iguales de proteína fueron separadas en SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de PVDF de 0,45 m (Bio-Rad, Estados Unidos). Las membranas se bloquearon en 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en solución salina tamponada con Tris con Tween 20 tampón (TBST) durante 2 h y después se incubaron durante la noche a 4 ° C con los siguientes anticuerpos primarios: anti-PTEN (1: 1000, . Tech señalamiento celular), anti-Akt total (1: 1000, Abcam), anti-fósforo Akt Ser473 (1: 1000, Abcam) y anti-GAPDH (1: 1000, Tech señalamiento celular), que sirvió. un control de carga. A continuación, las membranas se lavaron tres veces con TBST y se incubaron con anticuerpo secundario de rábano picante conjugada con peroxidasa (IgG de cabra anti-conejo (1: 5000) o de cabra anti-IgG de ratón (1:. 5000); Tech Cell-señalización) para 2 h a temperatura ambiente. Las transferencias se desarrollaron utilizando un kit de quimioluminiscencia (Millipore, EE.UU.) y se expusieron a película de rayos X. Las bandas en la película fueron escaneados y analizados utilizando Image J.
luciferasa vector de la construcción
El humano
PTEN
3'UTR que contiene la secuencia de semillas de la
MIR -21
sitios de unión se amplificó por PCR y se clonó en el vector PMIR-INFORME (Ambion, EE.UU.) entre los sitios HindIII y SpeI para desarrollar el vector de luciferasa PMIR-PTEN-3'-UTR. secuencias de semillas fueron mutados por la superposición de extensión PCR. El fragmento de PTEN-3'-UTR mutado se clonó en el vector PMIR-INFORME para desarrollar el vector-3'-UTR PMIR-PTEN-mut. Una serie de reportero construye con el mismo extremo 3 'pero diferente 5' terminal del promotor de miR-21 se amplificaron por PCR. Todos los productos de PCR se clonaron en el plásmido pGL4-Minimal (Promega) para generar pGL4-miR-21. El sitio mutante se introdujo en el plásmido por PCR de extensión solapante. El producto de PCR fue clonado subsiguiente para generar pGL4-mut-miR-21. Todas las construcciones fueron confirmadas por secuenciación del ADN.
La actividad de luciferasa
Las células a una densidad de 2 × 10
5 por pocillo fueron sembradas en placas de 24 pocillos y cultivadas durante la noche. Para el ensayo de
miR-21
, las células se cotransfectaron con 0,8 g de PMIR-PTEN-3'-UTR o PMIR-PTEN-mut-3'-UTR, 50 nM de miR-21 mímica o inhibidor o revueltos oligonucleótido junto con 50 ng de vector pRL-TK como un control interno usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Para el ensayo de promotor, las células se co-transfectaron con 1 g de pcNF-kB o pcDNA, 20 ng de un plásmido indicador de luciferasa y 10 ng del plásmido indicador de luciferasa de Renilla (Promega). Veinticuatro horas después de la transfección, se recogieron las células, y se determinó la actividad de luciferasa usando un ensayo de indicador de luciferasa dual (Promega, EE.UU.). Los resultados se expresaron como la actividad de luciferasa relativa como se informó anteriormente [15]. Todos los experimentos se repitieron tres veces por triplicado.
chip de ensayo
El chip de ensayo se realizó utilizando el kit Magna chip A /G (Millipore) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Brevemente, las células A549 fueron reticulado con 1% de formaldehído (Sigma-Aldrich) durante 10 min y se inactivó por la glicina. Las células se recogieron reticulados en PBS frío y se sonicaron durante seis a 15 s pulsos a intervalos de 50 s para reducir el tamaño total de ADN a 200-1000 pb. La cromatina cortado y perlas magnéticas se inmunoprecipitaron con anti-NF-kappa B (ab7970; Abcam, EE.UU.) o IgG normal de conejo durante la noche a 4 ° C en un rotador. complejo bola-anticuerpo-cromatina magnéticas se lavaron una vez con un tampón bajo en sal, seguido secuencialmente por alto contenido de sal, tampones LiCl y TE. Los complejos de la cromatina se eluyeron y se incubaron a 62 ° C durante 2 h. Las muestras de ADN se recuperaron utilizando columnas de centrifugación. Para las muestras de chips, PCR en tiempo real se llevó a cabo utilizando el método de SYBR como se describe anteriormente.
3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) ensayo
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5000 células por pocillo. Después de 24 h, las células fueron transfectadas con 100 nM de miR-21 mímica, el miR-21 o inhibidor oligonucleótido revueltos. Para los experimentos de combinación con el miR-21 mímica y pcDNA-PTEN, las células se cotransfectaron con pcDNA-PTEN (0,2 g). El medio se reemplazó con medio completo fresco con o sin cisplatino (5 mM) a las 24 h post-transfección de acuerdo con un informe anterior [16]. Después de un adicional de 24 h, 20 l de 5 mg /ml de MTT (dimetil tiazolilo tetrazolio difenilo; Sigma-Aldrich) se añadió en cada pocillo y se incubaron durante 4 h en un incubador humidificado. El sobrenadante se descartó y se añadieron 200 l de DMSO a cada pocillo para disolver el formazan. La densidad óptica (DO) se midió a 490 nm. La viabilidad de las células sin ningún tratamiento se definió como 100%, y la viabilidad de otros grupos se calculó por separado de la de las células simuladas.
Estadísticas
Las variables continuas se presentan como la media ± SD y determinó mediante análisis de la varianza (ANOVA) seguido de un post-hoc
t-test
usando el software SPSS 13.0. La asociación entre la tasa de supervivencia y
miR-21
expresión se determinó mediante análisis de regresión logística múltiple que incluye los siguientes factores: edad, sexo, fumador e histología. Se utilizó el análisis de Kaplan-Meier para evaluar la tasa de supervivencia libre de eventos y la permeabilidad primaria. La significación estadística se definió como un
P
valor inferior a 0,05.
Resultados
miR-21
se sobreexpresa en los tejidos del pulmón NSCLC
los tejidos pulmonares procedentes de 34 pacientes con NSCLC y 10 pacientes sin CPNM se utiliza para hacer el TMA. Las características clínicas de los sujetos se muestran en la Tabla 1. La expresión de
miR-21
se detectó mediante ISH. La intensidad de
miR-21
tinción fue significativamente mayor en las células NSCLC. La puntuación fue significativamente mayor en los pacientes con NSCLC (Figura 1A y B;.
P Hotel & lt; 0,05). Por otra parte, el tiempo de supervivencia se redujo en los pacientes con NSCLC que tenían un alto nivel de
miR-21
en comparación con aquellos que tenían un bajo nivel de
miR-21 gratis (figura 1C;.
P
. & lt; 0,05)
(a) ISH se utilizó para detectar el miR-21 en un TMA con CPNM 34 y 10 muestras pulmonares normales. Panel izquierdo era ISH y el panel de la derecha era tinción HE. (B) La puntuación de intensidad de la tinción fue mayor en los pacientes con CPNM en comparación con sujetos normales. (C) El tiempo de supervivencia de los pacientes con alto nivel de miR-21 era más corto que quien con bajo nivel de miR-21. *
P Hotel & lt; 0,05 diferencia tan significativa
miR-21
modula la supervivencia de las células A549
La
miR-21
imita fueron utilizados para representar exógeno
miR-21
, y el
miR-21
inhibidor se utilizó para inhibir endógena de
miR-21
. El nivel de
miR-21 Hoteles en las células A549 se detectó mediante PCR en tiempo real (Fig. 2B). A continuación, se utilizó el ensayo de MTT para evaluar la viabilidad celular de las células A549 cuando se expone a tratamiento con cisplatino. Como se muestra en la Fig. 2C, la viabilidad celular fue significativamente mayor en las células tratadas por
miR-21
imita comparación con el grupo control. La inhibición de
miR-21 fotos: por su inhibidor disminución de la viabilidad celular en comparación con el grupo control.
Las células en el control, miR-21 imita y miR-21 inhibidor fueron transfectadas con 100 nM revueltos oligonucleótido, miR-21 mímica y el inhibidor de miR-21, respectivamente. (A) eje de tiempo del experimento. El oligonucleótido revueltos, miR-21 o el inhibidor de la mímica se le dio 4 h antes del tratamiento con cisplatino (5 M). Y 48h después del tratamiento con cisplatino, se recogieron las células para su posterior análisis. (B) La expresión del ARNm de PTEN estaba inversamente relacionada con el miR-21. (C) miR-21 imita aumentó la viabilidad celular, mientras que el miR-21 inhibidor disminuye cuando las células expuestas al tratamiento con cisplatino. (D) de Western Blot de PTEN, Akt total (t-Akt) y fósforo Akt Ser473. (E) Representación gráfica de PTEN, t-Akt y Akt-fósforo. miR-21 disminuyó la expresión de PTEN y el aumento de la proporción de fósforo-Akt. * En comparación con el grupo control, en comparación con el#de miR-21 grupo sinóptico.
P
. & Lt; 0,05 diferencia tan significativa
miR-21
regula
PTEN
expresión mediante la unión a su 3'-UTR
una búsqueda bioinformática demostrado que
PTEN
, un gen supresor de tumores, era un objetivo potencial para
miR-21
porque había una supuesta
miR-21
secuencia de semillas -vinculante dentro de la 3'UTR de
PTEN
mRNA (Fig. 3A). Se midió el ARNm (Fig. 2B) y los niveles de proteína de PTEN (Fig. 2D) en las células A549 con un nivel alto o bajo de miR-21. Una correlación inversa entre el
miR-21
expresión y
se detectó expresión de ARNm de PTEN
.
Akt
está aguas abajo de
PTEN
, y también afectó a la activación de
Akt gratis (Fig. 2D y E). En comparación con el grupo control,
miR-21
imita la disminución de la actividad luciferasa, mientras que el
miR-21
inhibidor mostró un aumento significativo en la actividad de luciferasa relativa. Cuando la secuencia de semillas de la
miR-21
sitios de unión fue mutado, el efecto de
miR-21
sobre la actividad de la luciferasa no se detectó (Fig. 3B). A continuación, el marco de lectura abierto de
PTEN
con o sin el
miR-21
secuencia de dirección en el 3'UTR se clonó en pcCS2. El
Myc
nivel, lo que representó exógeno
PTEN
, se redujo en el
miR-21
imita en las células transfectadas con pcCS2-PTEN-UTR 3 ', mientras que no hubo una reducción significativa en
Myc
expresión por
miR-21
imita en las células transfectadas con pcCS2-PTEN (Fig. 3C y D). Estos resultados implican que
miR-21
regulan la expresión de
PTEN Hoteles en células A549 a través de la orientación de la secuencia de la UTR 3 'PTEN.
(A) Construcción de 3 'UTR y mutado 3'UTR de PTEN en el vector PMIR-REPORT. (B) En las células transfectadas con PMIR-INFORME-PTEN-3'UTR, la actividad luciferasa se incrementó el miR-21 y miR-disminuyó en un 21 inhibidor. En las células transfectadas con PMIR-INFORME-PTEN-mut-3'UTR, la actividad luciferasa se mantuvo sin diferencias significativas entre los tres grupos. (C) El marco de lectura abierto de PTEN con o sin 3'UTR se clonó en pCS2 vector. Una etiqueta Myc se une a PTEN para distinguir el PTEN endógeno o exógeno. (D) Representación gráfica de Myc mostró que la sobreexpresión de miR-21 reduce Myc expresión de miR-21, mientras que aumentó su inhibidor de la expresión. Mientras que el PTEN 3'UTR fue eliminado, la expresión de PTEN no fue influenciado por el miR-21. * En comparación con el grupo control, en comparación con el#de miR-21 grupo sinóptico.
P
. & Lt; 0,05 diferencia tan significativa
NF-kB regula la expresión de miR-21 a través de la unión de su promotor
Teniendo en cuenta el papel de los
miR-21
en CPNM, que tuvo como objetivo investigar el mecanismo de la sobreexpresión de
miR-21
en NSCLC. El análisis de la bioinformática sugirió cuatro posibles elementos de unión de NF-kB en la región promotora de la
miR-21
gen (Fig. 4A). El chip de ensayo en tiempo real mostró que el nivel de anticuerpos NF-kB de unión a la
miR-21
promotor fue más que la de la IgG (Figura 4C,
P
. & Lt; 0,05) , lo que indica que NF-kB podría unirse directamente a los cuatro elementos de la región promotora del
miR-21
gen. A continuación, se subclonó diferentes longitudes de los
miR-21
promotor y su mutación en pGL4 y cotransfected las construcciones con Renilla con o sin pcNF-kB en las células A549. Como se muestra en la Fig. 4B, pcNF-B aumentó significativamente la actividad de la luciferasa en comparación con pcDNA. Cuando se ha eliminado o mutado el primer elemento de unión (-2837), no hubo reducción en la actividad de luciferasa en comparación con el promotor de longitud completa. Cuando se ha eliminado o mutado el segundo elemento (-1211), hubo una reducción significativa en la actividad luciferasa. Cuando se ha eliminado o mutado el tercer elemento, no hubo una reducción significativa en la actividad de luciferasa en comparación a cuando se retiró el segundo elemento. Sin embargo, cuando las secuencias de unión de NF-kappa B fueron borrados o mutados, hay también una reducción significativa en la actividad de luciferasa en comparación a cuando se ha eliminado o mutado el segundo elemento. Estos resultados indicaron que el segundo y cuarto elementos de unión pueden contribuir a la regulación de los
miR-21
de transcripción NF-kB.
(A) La longitud total de miR-21 tiene cuatro NF -κB elementos vinculantes. Diferentes longitudes de miR-21 promotor se clonaron a pGL4 vectorial. Los cuatro elementos se mutaron individualmente y los promotores mutados se clonaron también a pGL4 vector. (B) La actividad de la luciferasa relativa en las células A549 cotransfectadas con pcNF-kB y la presentación de informes pGL4 vectorial. (C) chip de ensayo en tiempo real mostró que el anticuerpo se une NF-kB más ADN que la IgG normal. Primer 1-4 significa el cebador contenía los cuatro elementos de unión a NF-kB de aguas arriba a aguas abajo. *
P
. & Lt; 0,05 diferencia tan significativa
La ruta de NF-kB /miR-21 /PTEN modula la sensibilidad de las células A549 a cisplatino
La nivel de
miR-21
fue inducida por la sobreexpresión de NF-kB y inhibida por Lenti-shNF-kB, lo que disminuyó la expresión de NF-kB (Fig. 5A).
PTEN
expresión se correlacionó inversamente con la expresión de NF-kB (Fig. 5A). La viabilidad celular de las células A549 se incrementó significativamente por Lenti-NF-kappa B cuando se expone a tratamiento con cisplatino (Fig. 5B). En las células transfectadas con pcCS2-PTEN para sobreexpresar
PTEN
, los efectos de la sobreexpresión de NF-kappa B o
miR-21
sobre la viabilidad celular de las células A549 se inhibió (Fig. 5C) .
(A) ARNm expresiones de NF-kB, miR-21 y PTEN en las células transducidas con Lenti-control, Lenti-NF-kB y Lenti-shNF-kB. El nivel de miR-21 se incrementó significativamente, mientras que el PTEN se redujo en las células transducidas con Lenti-NF-B en comparación con el vector de control. El nivel de miR-21 se redujo significativamente, mientras que el PTEN se redujo en las células transducidas con Lenti-NF-kB. viabilidad (B) de la célula se incrementó en Lenti-NF-kB, mientras que disminuyó en Lenti-shNF-kB. (C) La sobreexpresión de PTEN restaura la sensibilidad de las células A549 con el tratamiento con cisplatino en comparación con la sobreexpresión de NF-kB o miR-21. * En comparación con el grupo de control,#comparación con el grupo Lenti-NF-kB.
P
. & Lt; 0,05 diferencia tan significativa
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado que
miR-21 se reguló en
pacientes con CPNM, lo que indica un mal pronóstico. Adicionalmente, se encontró que
miR-21
induce la resistencia de la línea de células de NSCLC al cisplatino a través de la orientación de la 3'UTR de
PTEN
para disminuir su expresión post-transcripcional. Por otra parte, el NF-kappa B se transloca al núcleo y se une a sus elementos específicos en el
miR-21
promotor del gen para inducir
miR-21
expresión. Por último, la modulación de la vía /miR-21 /PTEN NF-kappa B aumentó la sensibilidad de las células de NSCLC al tratamiento con cisplatino. Nuestros datos podrían proporcionar nuevos conocimientos sobre el mecanismo fisiopatológico de NSCLC y sugiere una diana terapéutica novedosa para el NSCLC.
miR-21
se ha encontrado que se sobreexpresa en muchos tipos de tumores sólidos, incluyendo cáncer de hígado, cáncer de próstata y el cáncer colorrectal. En nuestro estudio, se extrajeron los tejidos de pacientes con NSCLC y sujetos de control para llevar a cabo TMA. El resultado ISH detectó un mayor nivel de
miR-21
en pacientes con NSCLC en comparación con los sujetos control. Por otra parte, el alto nivel de
miR-21
indica un mal pronóstico para los pacientes con NSCLC. Esto es apoyado por muchos estudios anteriores. En el Markou et al. estudio, se recogieron 48 muestras de tejido de NSCLC fresco congelado para detectar
miR-21
expresión mediante PCR en tiempo real, y se encontró que
miR-21
se reguló en 16 de 29 ( 55,2%) pacientes con recaída y 15 de 23 (65,2%) pacientes fallecidos [17]. Además, en los no fumadores, el aumento de la expresión aberrante de
fue encontrado miR-21
para contribuir a la carcinogénesis pulmonar [18]. Dos metanálisis resumieron los datos de diferentes estudios y concluyeron que la sobreexpresión de
miR-21
era un factor pronóstico independiente para el NSCLC [19], sobre todo en personas de Asia [20].
Para entender el efecto de
miR-21
en CPNM,
se utilizaron el miR-21
imita y su inhibidor, respectivamente, para mejorar e inhibir su función biológica en la línea celular de NSCLC A549. Se encontró que exógena
miR-21
promueve la supervivencia celular cuando están expuestos a tratamiento con cisplatino, mientras que
miR-21
inhibición condujo a la función opuesta. Estos resultados fueron validados por un estudio, que mostró que la elevación de
miR-21
aumenta la resistencia de las células A549 de platino, mientras que la reducción
miR-21
disminución de esta resistencia [21]. Sobre la base de las conclusiones anteriores,
miR-21
podría ser una diana terapéutica potencial para el NSCLC. El mecanismo subyacente de la resistencia a cisplatino del NSCLC es complicado, y
miR-21
también tiene múltiples objetivos en función del análisis de la bioinformática. Para explorar el efecto de que el CPNM antes de que avance más en la fase de aplicación clínica, dos cuestiones esenciales persisten:. Cómo afecta el resultado del CPNM, y la forma en que se regula positivamente en el CPNM
estudios
Bioinformática sugieren un objetivo el sitio de
miR-21 Hoteles en el 3'UTR de
PTEN
ARNm. I es un gen supresor de tumores en todas partes, y sus resultados de desregulación en muchos tumores sólidos. En CPNM, I ha sido implicado como un factor clave en la patogénesis y el crecimiento tumoral [22].
PTEN
pérdida ha sido reconocida como el mecanismo de resistencia a gefitinib en NSCLC [23]. Orientados supresión de
PTEN
conduce al desarrollo de NSCLC [24]. Por lo tanto, se supuso que
miR-21
, que inhibe
PTEN fotos: por la orientación de su 3'UTR, afectaría el proceso patológico NSCLC. Inicialmente se identificó una relación inversa entre
miR-21
y
PTEN Hoteles en células A549. a continuación, hemos clonado el 3'UTR de
PTEN
en el reportero PMIR-INFORME luciferasa y encontramos que
miR-21 se redujo significativamente
imita la actividad luciferasa cuando se cotransfectaron con PMIR-INFORME-PTEN-3 ' UTR, mientras que no se observó ningún cambio en la actividad luciferasa cuando
miR-21 imita
se cotransfectaron con PMIR-INFORME-PTEN sin la 3'UTR. Estudios anteriores también han apoyado este hallazgo [25,26]
Por un lado,
miR-21
regula la expresión de
PTEN
.; Por otra parte, se regula por otros factores. Algunos miRNAs tienen sus propios promotores, mientras que otros comparten un promotor con otros miRNAs para el gen miRNA situado en el intrón del gen de host. Ya sea miRNAs tienen sus propios promotores o compartir promotores, su expresión puede ser regulada por ciertos factores de transcripción, incluyendo p53 y NF-kappa B, que se dirigen a sus promotores. Hay cuatro elementos de unión de NF-kB en el
miR-21
promotor del gen [27]. Por lo tanto, es posible que
miR-21
podría ser regulada por NF-KB de orientación de sus elementos de unión. Nuestro chip de ensayo confirmó que NF-kB podría unirse directamente a los cuatro elementos en el promotor de la
miR-21
gen. Sin embargo, sólo los elementos situados en -1211 y -404 del
miR-21
promotor del gen tenían una función biológica de acuerdo con el ensayo de actividad de luciferasa. Nuestros datos fueron parcialmente apoyado por los de otros estudios. En las células de cáncer de próstata, el interferón inducida por
miR-21
expresión requiere NF-kB contratación /p65 a la
miR-21
promotor [27]. En el de mama humano MDA-MB-231 y las líneas de células tumorales HCT116 de colon, el NF-kappa B también se encontró que se unen a la
miR-21
promotor del gen [28]. En CPNM, el NF-kappa B fue identificado por primera vez para regular la expresión de
miR-21
uniéndose a sus elementos en el
de miR-21 promotor del gen
.