Extracto
actividad desregulada de factores de transcripción (TFS) de la familia Sp /KLF, como Sp1, SP3 y SP4, y el consiguiente exceso de expresión de genes regulados-Sp se producen con frecuencia en los cánceres humanos. Esto proporciona el fundamento para el desarrollo de inhibidores de Sp TFS como la terapéutica del cáncer. Mitramicina A (MTM-A) es un policétido natural que se une secuencias de ADN ricas en GC, inhibe la actividad de la SP TFS y exhibe una potente actividad antitumoral en sistemas experimentales. Sin embargo, el uso clínico de MTM-A está limitada por la grave toxicidad del compuesto. Aquí, se estudiaron dos análogos de MTM-A, que habían sido generados mediante ingeniería genética de la A MTM-ruta biosintética, y evaluamos su actividad en el cáncer de próstata humano en cultivos de células y modelos de ratón. Los compuestos, llamados MTM-SDK y MTM-SK, fueron muy eficaces
in vitro
inhibición de la proliferación de las células de cáncer de próstata y la transcripción de genes regulados-Sp mediante el bloqueo de la unión de proteínas SP para los promotores de genes Cuando se administra a ratones , ambos compuestos fueron bien tolerados con las dosis máximas toleradas de MTM-SDK y MTM-SK, respectivamente, de 4 y 32 veces mayores que las MTM-A. Después de la administración sistémica, ambos compuestos se eliminan rápidamente del torrente sanguíneo, pero mantienen los niveles en plasma por encima de la concentraciones activas requeridas
in vitro
para la inhibición de la actividad de TF Sp y la proliferación celular. Consistentemente, MTM-SDK y MTM-SK inhibió la transcripción de genes regulados-Sp en xenoinjertos tumorales de próstata y exhiben una potente actividad antitumoral en modelos de xenoinjertos de tumores subcutáneos y metastásicos sin o con mínima toxicidad. Tomados en conjunto, estos datos indican que MTM-SDK y MTM-SK poseen significativamente mejores propiedades farmacológicas y toxicológicas en comparación con MTM-A y representan fármacos prometedores para el tratamiento de cáncer de próstata avanzado
Visto:. Malek A, Núñez LE , Magistri M, L Brambilla, Jovic S, Carbone GM, et al. (2012) La modulación de la actividad de factores de transcripción Sp por mitramicina Análogos como una nueva estrategia para el tratamiento del cáncer de próstata metastásico. PLoS ONE 7 (4): e35130. doi: 10.1371 /journal.pone.0035130
Editor: Leo T.O. Lee, de la Universidad de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 7 Octubre de 2011; Aceptado: March 13, 2012; Publicado: 19 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Malek et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Ticinese per la Ricerca sul Cancro, Fundación Nacional de Ciencia de Suiza y de la Liga suiza cáncer a CVC y GMC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los co-autores de FM y LEN son empleados y FM es un accionista de EntreChem SL, la empresa titular de la licencia de los compuestos descritos en el manuscrito. Todos los demás autores tienen que declarar que no tienen intereses en competencia exist.This no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
iniciación y progresión del tumor son mediada por múltiples vías de señalización y los beneficios terapéuticos alcanzables por la orientación vías individuales puede ser limitado [1]. Orientación de los sitios de convergencia de diversas cascadas de regulación puede representar una estrategia más prometedora para el tratamiento del cáncer. Los factores de transcripción (TFS) son particularmente atractivos a este respecto, ya que son puntos nodales en las vías de señalización y están desreguladas con frecuencia en los cánceres humanos [1], [2]. expresión o actividad de los miembros de la familia Sp /KLF de TFS aberrante, como Sp1, SP3 y SP4, se produce en muchos cánceres humanos [3] Sp TFS se unen a elementos de ADN ricas en GC (GC-box) en promotores de genes, interactuar con componentes de la maquinaria transcripcional basal, cooperar con otros TFS y son los efectores de múltiples vías de señalización [3]. Varios estudios han demostrado que la SP TFS tienen un papel importante en la patogénesis de los cánceres humanos son prometedores y dianas terapéuticas [3], [4], [5],.
Mithramycin A (MTM-A) es un producto natural poliquétido aromático policíclico producida por diversos
Streptomyces
especies [14]. MTM-A se une preferentemente a secuencias ricas en GC en el ADN, bloques competitivos los elementos de unión de la SP TFS y otras proteínas de unión GC-GC-rica en genes promotores e inhibe la transcripción de Sp genes regulados [15], [16], [ ,,,0],17], [18], [19]. La inhibición de Sp genes regulados es el principal determinante de la actividad biológica de MTM-A en sistemas experimentales [20], [21]. El uso clínico de MTM-A sin embargo, es limitado debido a la toxicidad del compuesto [22]. Genéticamente ingeniería de la A-MTM ruta biosintética ha dado la oportunidad de generar nuevos análogos de MTM-A, que podría poseer propiedades mejoradas farmacológicos y toxicológicos [23], [24], [25], [26]. Recientemente, dos compuestos, llamados MTM-SDK y MTM-SK, se obtuvieron utilizando el enfoque de ingeniería metabólica [27], [28]. MTM-SDK y MTM-SK mostraron mayor capacidad de bloquear la unión a ADN y captación celular en comparación con MTM-A SP1. Esto condujo a una mayor actividad biológica como inhibidores de la transcripción Sp regulada de genes y la proliferación de células cancerosas tanto in vitro como in vivo [27], [29]. Por lo tanto, estos nuevos análogos de MTM-A pueden ser útiles para el tratamiento de los cánceres con la actividad anormal de TFS Sp.
En este estudio, se evaluó la actividad de los análogos de MTM-A MTM-SDK y MTM-SK en modelos experimentales de cáncer de próstata humano. El cáncer de próstata es el cáncer más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres en los países occidentales [30]. El tratamiento convencional del cáncer de próstata incluyen la cirugía, la radioterapia y la privación de andrógenos [31]. A pesar del aumento gradual en la supervivencia y la calidad de vida libre de enfermedad, la diseminación metastásica sigue siendo la principal causa de muerte en pacientes con cáncer de próstata [31]. cáncer de próstata avanzado a menudo es resistente al tratamiento hormonal y la quimioterapia sistémica tiene una eficacia limitada [31], [32]. La terapia paliativa sigue siendo la principal opción para muchos de estos pacientes. Por lo tanto, los nuevos enfoques terapéuticos deben implementarse para administrar el cáncer de próstata metastásico. El estado de Sp TFS en el cáncer de próstata ha sido poco investigado hasta la fecha. Sin embargo, encontramos evidencia que apoya un papel para la actividad desregulada de Sp TFS en la iniciación y progresión del cáncer de próstata. Muchos genes reportados estar involucrado en la tumorigénesis de próstata están regulados por factores de SP (ver Métodos S1; Tabla S1, S2 y sus referencias). Los compuestos que interfieren con SP TFS por diferentes mecanismos tienen una actividad relevante en diversos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de próstata [7], [8], [9], [10], [11], [33], [34], [35] , [36], [37], [38]. Estas consideraciones, junto con la bioinformática análisis de las publicaciones de expresión génica de datos, nos llevó a formular la hipótesis de que la SP TFS podrían ser objetivos relevantes en los tumores de próstata y que los nuevos análogos de MTM-A con propiedades farmacológicas mejoradas podrían ser útiles para el tratamiento de esta enfermedad.
Materiales y Métodos
PC3 cáncer de próstata humano
Los compuestos y las líneas celulares
, DU145, LNCaP células 22Rv1 y se mantuvieron en RPMI 1640 [39]. fibroblastos humanos normales se mantuvieron en DMEM [27]. MTM-A, MTM-SK (EC-7072) y MTM-SDK (EC-7073) se prepararon como se describe anteriormente [27]. Las soluciones madre de los compuestos (10 mM) se prepararon en solución salina estéril o DMSO y se diluyeron en solución salina estéril inmediatamente antes de su uso [29]. Para la expresión de genes y la inmunoprecipitación de la cromatina células (chip) se trataron con 100 nM de MTM-SDK y MTM-SK o vehículo durante 24 h.
ARN y proteínas análisis
ARN total de células cultivadas y los tejidos tumorales fue aislado y transcripción inversa como se describe [27], [29]. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR (qRT-PCR) se realizó utilizando el Sistema de ABI PRISM 7000HT de detección de secuencias y SYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems) como se describe [29]. cebadores de PCR se muestran en la Tabla S3.
GAPDH
y
B2M
se utilizaron como controles internos. Expresión de datos se expresaron como un porcentaje de la expresión de genes de control como se describe [29]. Punto final de RT-PCR se realizó como se describió anteriormente usando el sistema de un solo paso superíndice RT-PCR (Invitrogen) y los cebadores específicos de genes [27]. Los lisados celulares se prepararon a partir de control y las células y proteínas tratados con fármaco separadas en geles de SDS-poliacrilamida. La inmunotransferencia se realizó como se describió anteriormente [27], [40].
inmunoprecipitación de cromatina (CHIP)
Las células se recogieron, entrecruzado con formaldehído y procesado siguiendo un protocolo del kit EZ-chip modificado (Upstate Biotechnology) como se describe [41]. La cromatina se inmunoprecipitó con un anticuerpo para Sp1 y la IgG normal de ratón como control negativo. DNA-proteína enlaces cruzados se invirtieron y el ADN se purificó a partir de lisados de células totales (input) y las fracciones inmunoprecipitadas. qPCR se realizó como se ha indicado anteriormente. Los cebadores para el análisis de chip de la C-MYC y promotor de VEGF se muestran en la Tabla S3. La cantidad de ADN unido se calcula en referencia a una curva estándar y se expresó como porcentaje de ADN de entrada [41].
in vitro
inhibición del crecimiento celular
La viabilidad celular fue se determina usando el ensayo colorimétrico MTT como se describe [27]. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron con vehículo o compuestos durante 24 y 72 h. Cada tratamiento se realizó por triplicado y los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Animales y modelos de xenoinjertos
ratones desnudos atímicos macho (Balb c nu /nu, de 6-8 semanas de edad) fueron adquiridos de los Laboratorios Harlan. Los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos con el alimento y el agua suministrada
ad libitum Opiniones y su estado de salud general se controló diariamente. Todos los protocolos con animales de laboratorio se llevaron a cabo de conformidad con las directrices institucionales y en cumplimiento de las leyes y políticas nacionales e internacionales. Los procedimientos experimentales y los protocolos de los estudios han sido revisados y aprobados por la Autoridad Veterinaria de Suiza Cantonal (vehículo no. 05/2011). Para establecer xenoinjertos tumorales subcutáneos, células PC3 (2 × 10
6 células) se inocularon en el costado de los ratones. Para el modelo de xenoinjerto metastásico, las células PC3 (0,6 × 10
6) se inyectaron dos veces en la vena de la cola con un intervalo de 24 h entre las inyecciones.
Toxicidad
Healthy CD-1 ratones proporcionada por el Animalario de la Universidad de Oviedo fueron tratados con inyecciones únicas o repetidas IV de MTM-SK, MTM-SDK y MTM-A. Cada grupo consistía en 4 ratones. Para dosis repetidas, las drogas fueron administradas por inyecciones IV cada dos o tres días para un total de 10 inyecciones. El peso corporal, las muertes, los cambios en el comportamiento, la motilidad, la alimentación y los hábitos de consumo, y cualquier otro signo de toxicidad local o sistémica se registraron diariamente.
Farmacocinética
Healthy CD-1 ratones fueron inyectados IV con MTM-SK (18 mg /Kg) y MTM-SDK (2 mg /Kg). La sangre se recogió en cinco puntos de tiempo entre 5 y 120 min. En cada punto de tiempo se analizaron 3 ratones por grupo. Las muestras de plasma se diluyeron con 4 volúmenes de acetonitrilo, se agita vorticialmente y se centrifugaron para eliminar cualquier precipitado insoluble. a continuación, el sobrenadante se utilizó para medir MTM-SDK y MTM-SK por LC-MS. Los niveles plasmáticos fueron evaluados después de la administración intraperitoneal (IP) y la inyección IV de MTM-SK (18 mg /Kg) también por HPLC-UV.
análisis
La expresión génica en xenoinjertos de tumores
Para evaluar los efectos en la transcripción en los tejidos tumorales, los ratones con tumores subcutáneos fueron tratados con solución salina MTM-SDK (1,2 mg /kg) y MTM-SK (8 mg /kg) o por inyección IV. Los animales fueron sacrificados después de 1, 3 y 7 días después de la inyección. Los tumores se recogieron y se congelaron inmediatamente para el aislamiento de ARN. QRT-PCR se realizó como se ha descrito anteriormente. En cada punto de tiempo se analizaron 4 ratones en cada grupo experimental y QRT-PCR realizaron por triplicado para cada muestra.
actividad antitumoral
Ratones con tumores subcutáneos fueron tratados con compuestos o vehículo. Cada grupo experimental consistía en 10 ratones. Las drogas se prepararon en solución salina estéril y se les da por inyecciones IP cada 3 días. Los ratones control recibieron la inyección IP de solución salina estéril. El tamaño del tumor se midió con un calibre dos veces a la semana. Los datos representan la media ± SD de 10 ratones por grupo.
actividad antimetastásica
Para evaluar la capacidad de los compuestos para bloquear el crecimiento de tumor metastático, los ratones recibieron inyecciones de la cola de la vena de las células tumorales para establecer la metástasis pulmonar. A continuación, los ratones fueron tratados con MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM-SK (8 mg /kg) o solución salina estéril dado por inyecciones IP cada 3 días comenzando dos semanas después de la inyección en la vena caudal de las células tumorales. Dos grupos de ratones no tratados (
n = 3 por grupo
) fueron sacrificados después de 1 y 2 semanas de la inyección para confirmar la implantación y el crecimiento de las células metastásicas. Control y ratones tratados con el fármaco (
n = 3 por grupo
) se sacrificaron entonces después de 1 y 2 semanas desde el inicio del tratamiento. Los tejidos pulmonares se recogieron para su análisis qPCR y el análisis histológico después de H & amp; E tinción. Las metástasis pulmonares se cuantificaron utilizando un método basado qPCR descrito previamente [42]. El ADN genómico extraído de tejidos de los pulmones congelados se amplificó con grupos de cebadores para único, conservadas y regiones especies específicas del genoma humano y de ratón. PCR se realizó usando SYBRGreen qPCR Master Mix [42]. El porcentaje de células humanas en los tejidos pulmonares se determinó en las reacciones por triplicado emparejado para cada animal usando la curva estándar de muestras humano /ratón mixtos como se describe [42]. Los datos son la media ± SD de 3 ratones por punto experimental.
El análisis estadístico
Todos los datos se expresan como media ± desviación estándar. La IC50 se calcularon utilizando SigmaPlot. Se analizaron las diferencias entre los grupos experimentales de significación estadística utilizando desapareado T-test de dos colas utilizando GraphPad Prism 4.0 del software. P values≤0.05 fueron considerados estadísticamente significativos.
Resultados
MTM-SDK y MTM-SK inhibir la expresión de genes regulados Sp en células de cáncer de próstata
El análisis de la literatura actual mostraron que muchos genes sobreexpresados en el cáncer de próstata primario y metastásico están regulados por Sp TFS y son objetivos potenciales de los análogos de MTM-a (ver Métodos S1, Tabla S1, S2 y sus referencias). La aplicación de la bioinformática se acerca al acceso público de expresión génica de datos hemos encontrado que los genes con sitios de unión previsto para Sp TFS en sus promotores eran frecuentemente desregulados en los tumores de próstata, tanto en las etapas tempranas y avanzadas de la enfermedad, a pesar de la falta de pruebas directas de la sobre-expresión de TFS sp en estos tumores (Fig. S1). Además, hemos encontrado que muchos genes regulados por MTM-SDK en una línea celular de cáncer de ovario y los supuestos objetivos de Sp TFS se sobre-representados entre los genes regulados hasta en los tumores de próstata primarios y metastásicos (Fig. S1). Por lo tanto, se evaluó el impacto de los nuevos análogos de MTM-A en la transcripción de genes regulados-Sp en células de cáncer de próstata. Hemos seleccionado los genes que se sabe están sobreexpresados en tumores de próstata y que participan en diversos aspectos de la tumorigénesis de próstata como la proliferación celular, la apoptosis y la angiogénesis (Tabla S1). células PC3 de cáncer de próstata fueron tratados con 100 nM de MTM-SDK, MTM-SK o vehículo durante 24 h y los efectos sobre la expresión génica se evaluaron mediante qRT-PCR. Esta dosis se ha elegido sobre la base de nuestro trabajo previo en las células de cáncer de ovario [27]. Además, se verificó que 24 h de tratamiento con dosis ≤100 nM era citotóxico mínimamente (≤30% de reducción en la viabilidad celular; Fig. S2). En estas condiciones, el tratamiento con MTM-SDK reduce el nivel de ARNm de
C-MYC
,
hTERT
,
VEGFA
,
C-SRC
,
CCDN1
,
CCNE1
,
XIAP
,
MCL 1 Opiniones y
BIRC5 fotos: por ≥75% (fig. 1A). Como se muestra en las células del cáncer de ovario [27], MTM-SK fue ligeramente menos eficaz que el MTM-SDK. El nivel de
C-MYC
,
hTERT
,
VEGFA
,
C-SRC
y
CCDN
1 mRNA se redujo en MTM-SK células tratadas en un 50-75% en comparación con las células control, mientras que
XIAP
,
CCNE1
,
MCL 1 Opiniones y
BIRC5
eran mínimamente o no afectados.
células PC3 fueron tratados con 100 nM de MTM-SDK, MTM-SK o vehículo (DMSO) durante 24 h. A) La expresión génica se midió mediante qRT-PCR. Los datos se normalizaron a
B2M
nivel de ARN y se presentan como porcentaje de expresión en comparación con células tratadas con vehículo (control). Los datos representan la media ± DE de 3 experimentos independientes. B) La unión de Sp1 a los promotores de
C-MYC
y
VEGF
en control y células tratadas con fármaco se determinó por chip usando un anticuerpo específico anti-SP1. ADN en las fracciones de entrada y inmunoprecipitadas se cuantificó mediante qPCR con cebadores que abarcan el sitio de unión Sp en los promotores de genes. Los datos (media ± SD) de 3 experimentos independientes se expresan como porcentaje de ADN de entrada en fracciones immunoprecipated. *, P & lt; 0,01; **, P & lt; 0,001. C) Nivel de Sp1, Sp3 y mRNA Sp4 se determinó por RT-PCR en células PC3 se incubaron con 100 nM de MTM-SDK, MTM-SK o vehículo para 24 y 48 h. GAPDH se utilizó como control. D) el nivel de proteína de SP1, c-Myc, XIAP, y la ciclina D1 se determinó por inmunotransferencia en células PC3 se incubaron con 100 nM de MTM-SDK, MTM-SK o vehículo durante 24 y 48 h.
MTM-a y sus análogos se unen a elementos de ADN ricas en GC y evitan la unión de proteínas de unión en GC como la TFS Sp a los promotores de genes. Para determinar si los efectos sobre la transcripción se debieron a la inhibición de la unión Sp, que mide la unión de Sp1 a la
C-MYC
y
VEGFA
promotor en el control de drogas y las células tratadas por inmunoprecipitación de la cromatina . MTM-SDK y MTM-SK redujeron significativamente la unión de SP1 a la
C-MYC
y
VEGFA
promotor (Fig. 1B). MTM-SDK fue más eficaz que el MTM-SK, de acuerdo con los datos de expresión génica. Como las proteínas Sp pueden controlar su propia transcripción [3], se evaluó si MTM-SDK y MTM-SK afectaron su expresión. Sp1, Sp3 y Sp4 se expresan en células PC3 y el tratamiento con los análogos de MTM-A redujo el nivel de mRNA de SP1, SP4 y SP3 en un grado inferior (Fig. 1C). Una vez más, MTM-SDK fue más eficaz MTM-SK. Los niveles de proteína de objetivos SP1 y SP, como c-Myc, también se redujeron después del tratamiento con MTM-SDK- y MTM-SK de acuerdo con los datos de mRNA (Fig. 1D).
MTM-SDK y MTM- SK inhibir la proliferación de células de cáncer de próstata
La inhibición de Sp TFS se ha demostrado que afectan a la proliferación y supervivencia de las células cancerosas. Se examinaron los efectos antiproliferativos de MTM-SDK y MTM-SK en un panel de líneas celulares de cáncer de próstata andrógeno-dependientes que representan (AD) y los tumores de próstata independientes de andrógenos (AI). células LNCaP son receptor de andrógenos (AR) positivo y dependen de la señalización de AR. 22Rv1 son AR positivo, pero la IA. PC3 y DU145 son AR negativo y AI. El crecimiento de todas las líneas celulares ensayadas, independientemente de su estado de AR, fue fuertemente inhibida por ambos compuestos, con MTM-SDK ser más eficaz que MTM-SK (Fig. 2). El IC
50 valores son reportados en la figura 2. Además, el crecimiento de células de cáncer de próstata fue inhibida por ≥50% en ≤100 nM de ambos fármacos. En particular, los fármacos no tuvieron efecto a estas dosis en fibroblastos humanos normales (Fig. 2). La viabilidad de los fibroblastos normales se vio afectada ligeramente sólo a dosis más altas (~20-30% de inhibición a 500 nm). Esta diferencia de sensibilidad entre las células normales y cancerosas estuvo en línea con nuestros datos anteriores que muestran que los fibroblastos normales eran más resistentes que las células de cáncer de ovario a la inducción de la apoptosis cuando se expone a MTM-SDK [27].
El cáncer de próstata células (DU145, 22Rv1, PC3 y LNCaP) y cultivos primarios de fibroblastos humanos normales (NHF) se incubaron con los compuestos durante 72 h. La viabilidad celular se midió por el ensayo MTT colorimétrico. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de las muestras por triplicado de 3 experimentos independientes. IC
50 para cada tipo de célula se reportan en el panel inferior.
Toxicidad de MTM-SDK y MTM-SK
La toxicidad sistémica es una importante limitación para el uso clínico de MTM-A. Por lo tanto, se evaluó la dosis a las que MTM-SDK y MTM-SK podría administrarse de forma segura a los ratones a la administración tanto aguda como crónica. Las dosis máxima tolerada (DMT) de MTM-SDK y MTM-SK después de una única inyección IV fueron 4 mg /kg y 32 mg /kg, respectivamente (Tabla 1). El MTD de MTM-SK para el tratamiento repetido fue de 8 y 18 mg /kg mediante el q2d × 10 y 10 × Q3D horario, respectivamente. El MTD de MTM-SDK fue de 1,2 mg /kg y 1,8 mg /kg, respectivamente, cuando se da con la q2d × 10 y 10 × Q3D horario. Hemos probado para la comparación MTM-A y encontramos que los MTDs fueron de 1 mg /kg y 0,5 mg /kg para dosis únicas y repetidas (q2d × 10) administración, respectivamente. Si continúa la escalada de dosis de ambos MTM-SK de MTM-SDK y el tratamiento repetido dieron lugar a la pérdida progresiva de peso corporal y otros signos de toxicidad crónica grave, incluyendo disminución de la movilidad, la conjuntivitis y la neuropatía periférica. En conclusión, las dosis muy altas de MTM-SK de MTM-SDK en comparación con MTM-A se podrían administrar con seguridad tanto como únicas y repetidas inyecciones a los ratones sin signos de toxicidad.
Farmacocinética de MTM-SDK y MTM-SK
los niveles sanguíneos de MTM-SK y MTM-SDK se midieron después de las inyecciones individuales IV a la dosis de 18 y 2 mg /kg (Fig. 3). Ambos compuestos se eliminan rápidamente de la circulación sanguínea con cinética global similares. Después de 5 min niveles plasmáticos fueron unos 20 y 0,7 M de MTM-SK y MTM-SDK, respectivamente. Después de 1 h los niveles de MTM-SK y MTM-SDK había aproximadamente 1 y 0,1 mM, respectivamente. Por lo tanto, los niveles plasmáticos de ambos compuestos eran iguales o superiores a la concentración requerida
in vitro
para la inhibición del crecimiento celular y la supresión de la transcripción dependiente de Sp1. A continuación, se comparó la farmacocinética de MTM-SK siguientes IV única e inyecciones IP. Al lado del pico inicial visto con la inyección IV, la cinética siguientes IV y administración de propiedad intelectual eran bastante similares, alcanzando los niveles del fármaco en el plasma comparables a los 15-30 minutos y el mantenimiento de niveles similares durante el período de 2 h del análisis (Fig. S3 ).
Los ratones (n = 3 /grupo) recibieron una única inyección IV de MTM-SK (a) o MTM-SDK (B) y los niveles plasmáticos se determinaron por LC-MS. Las dosis de MTM-SK y MTM-SDK eran 18 mg /kg y 2 mg /kg, respectivamente.
MTM-SDK y MTM-SK inhibir la expresión de genes en xenoinjertos de tumores de próstata humana
para determinar si los análogos de MTM-a fueron capaces de interferir con la actividad de la SP TFS en vivo tras la administración sistémica, los ratones portadores de xenoinjertos de tumores PC3 se trataron con una sola inyección IV de MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM SK (8 mg /kg) o solución salina. Los tumores se extirparon a los 1, 3 y 7 días después de la inyección y los niveles de ARN de genes regulados Sp seleccionados fueron medidos mediante qRT-PCR. La expresión de
C-MYC
,
hTERT
,
VEGFA
,
C-SRC
,
CCDN1
,
CCNE1
,
XIAP
,
MCL 1 Opiniones y
BIRC5
se redujo significativamente tanto por MTM-SDK y MTM-SK a las 24 h (Fig. 4). Sin embargo, hubo una diferencia entre los dos compuestos en la cinética de recuperación de la inhibición de la transcripción. El efecto de MTM-SDK duró más tiempo. La mayoría de los genes todavía fueron reprimidos por 30 a 50% después de 3 días. Incluso después de 7 días
VEGFA
,
C-SRC
y
XIAP
todavía eran significativamente las reguladas. El efecto de MTM-SK se invirtió más rápidamente con la mayoría de los genes de volver a controlar los niveles de un radio de 3 ó 7 días. Por lo tanto, los dos fármacos fueron eficaces en la reducción de la transcripción de genes SP-regulada cuando se administra sistémicamente a ratones, lo que confirma la acumulación de concentraciones de fármaco activo en el tejido tumoral. Además, el efecto de MTM-SDK fue más pronunciado y persistente en comparación con MTM-SK, consistente con
vitro
datos sobre la unión Sp1 y la expresión génica.
Los ratones (n = 4 /grupo en ) con tumores subcutáneos fueron tratados con una sola inyección IV de MTM-SDK, MTM-SK o solución salina estéril. Las dosis de MTM-SK y MTM-SDK fueron 8 mg /kg y 1,2 mg /kg, respectivamente. Los tumores se cosecharon 1, 3 y 7 días después de la inyección de drogas. La expresión génica se evaluó mediante qRT-PCR. Los datos representan la media ± SD de la transcripción a nivel normalizado a B2M RNA y se presentan como porcentaje de expresión en comparación con los ratones de control que recibieron solución salina estéril. *, P & lt; 0,01; **, P & lt;. 0.001
MTM-SDK y MTM-SK inhiben el crecimiento de xenoinjertos de tumores de próstata
Se examinó la actividad antitumoral de MTM-SDK y MTM-SK utilizando xenoinjertos de tumores subcutáneos de células de cáncer de próstata PC3. células PC3 son AI, altamente tumorigénico y metastásico. Por lo tanto, estas células representan un buen modelo de cáncer de próstata resistente a la castración avanzada. Los ratones que llevan xenoinjertos de tumores PC3 recibieron MTM-SDK (0,6, 1,2 y 1,8 mg /kg, Q3D × 10) y MTM-SK (4, 8 y 12 mg /kg,) cada 3 días por inyecciones IP. Se eligió la administración IP, ya que se utiliza comúnmente para tratamientos prolongados con compuestos contra el cáncer. Por otra parte, IV e IP inyecciones fueron casi equivalentes en términos de niveles de plasma y la farmacocinética. Las dosis y pauta de administración también se basaron en los datos farmacodinámicos y MTD descritas anteriormente. El tratamiento se dio por terminado cuando los ratones en los grupos de control tuvieron que ser sacrificados debido a la carga tumoral excesiva. los ratones tratados con las drogas fueron seguidos durante otra semana después del final del tratamiento. El tratamiento con MTM-SDK y MTM-SK redujo el crecimiento del tumor (Fig. 5A-B). La diferencia entre los ratones tratados y no tratados fue estadísticamente significativa en todas las dosis probadas. Después de la interrupción del tratamiento, el crecimiento de los tumores subcutáneos se reanuda lentamente con una cinética ligeramente más rápido en el caso de las dosis más bajas de MTM-SK. Esto está de acuerdo con los datos farmacodinámicos, lo que indica una recuperación más rápida de la expresión génica después del tratamiento MTM-SK. Curiosamente, sin embargo, el nuevo crecimiento mínimo tumor se observó en los ratones tratados con la dosis más alta de MTM-SK. El tratamiento con MTM-SDK y MTM-SK resultó en una ligera pérdida de peso corporal, que se correlaciona con el nivel de dosis, pero no estadísticamente significativa (Fig. 5C-D). No se observaron signos de toxicidad aguda o irritación local en el lugar de la inyección durante el tratamiento. Dos ratones tratados con la dosis más alta de MTM-SDK (1,8 mg /kg) mostraron signos de toxicidad (por ejemplo, disminución de la movilidad, la neuropatía periférica) después de múltiples inyecciones. Estos ratones fueron retirados del tratamiento y no se incluyeron en la evaluación de la actividad antitumoral. Desde la misma dosis se administró de manera segura a ratones con no tumorales, la toxicidad observada a esta dosis podría ser debido a la presencia del tumor o las diferencias en ratones de la cepa o el sexo.
Los ratones con tumores subcutáneos fueron tratados con las dosis indicadas de MTM-SDK, MTM-SK o solución salina estéril (control) dadas por inyecciones IP dos veces a la semana durante cinco semanas (Q3D × 10). El volumen del tumor (A) y el peso corporal (B) se midieron dos veces a la semana. Los resultados se expresan como media ± SD del volumen del tumor en cada grupo. Las flechas indican inicio y final del tratamiento. **, P & lt;. 0.001
MTM-SDK y MTM-SK inhiben el crecimiento del cáncer de próstata metastásico
Estábamos interesados en determinar si el tratamiento con los análogos de MTM-A fue también efectiva en un modelo de metástasis de cáncer de próstata. Con este fin, se utilizó un modelo de metástasis de pulmón experimental para estudiar los efectos del tratamiento sobre las células cancerosas humanas diseminadas en ratones inmunodeficientes. Se inyectaron células PC3 en la vena de la cola de los ratones y el crecimiento de la metástasis pulmonar fue supervisado por qPCR en un período de 4 semanas [42]. Un grupo de ratones de control no tratados fue sacrificado después de la primera y segunda semana de la inyección de las células tumorales. En este momento, los pulmones contenían 0,015 y 0,135% de las células humanas, respectivamente, lo que confirma la implantación y proliferación de las células inyectadas humanos con cáncer (Fig. 6A). A partir de entonces, los ratones recibieron cada 3 días inyecciones ip de MTM-SDK (1,2 mg /kg), MTM-SK (8 mg /kg) o vehículo. Grupos de ratones control y tratados con fármaco se sacrificaron dos días después de la segunda y cuarta inyección y sus pulmones examinados para la presencia de metástasis. En este momento, los ratones de control contenían 2,08% y 5,94%, respectivamente, de células de cáncer humano de conformidad con la expansión de los focos metastásicos en el pulmón (Fig. 6A). En cambio, los ratones tratados con MTM-SDK tenía 0,14% y 0,09% y los tratados con MTM-SK tenía 0,43% y el 0,42% de las células de cáncer humano después de la segunda y cuarta inyección, respectivamente. Así, el crecimiento de las células metastásicas humanos difundidos fue casi completamente suprimido por el tratamiento. Los datos qPCR se confirmaron por examen histológico de secciones de pulmón tomadas al final del experimento (Fig. 6B). nódulos metastásicos múltiples se detectaron en el pulmón de los ratones de control, mientras que no hubo metástasis detectable mediante examen microscópico de secciones en serie de pulmones de los animales tratados con el fármaco.
Los ratones recibieron PC3 por inyección IV en la vena de la cola y luego a partir de 3 semanas más tarde recibieron inyecciones IP de MTM-SDK, MTM-SK o solución salina estéril dos veces a la semana durante dos semanas. Las dosis de MTM-SK y MTM-SDK fueron 8 mg /kg y 1,2 mg /kg, respectivamente. A) Evaluación de qPCR de metástasis de pulmón. Los ratones de control fueron sacrificados 1 y 2 semanas antes del tratamiento y después de eso ratones control y tratados con fármaco se sacrificaron al final de la primera y segunda semana de tratamiento. Los resultados se presentan como media ± SD del porcentaje de células humanas en relación con el total de células de ratón en el pulmón (n = 3). Las flechas indican el momento de inyecciones de medicamentos. B) Evaluación microscópica de la metástasis de pulmón. El tejido pulmonar se recogió de ratones control y tratados con fármaco al final del experimento y se tiñeron con H & amp; E para el examen histológico. secciones representativos se muestran (× 20). **, P & lt;. 0.001
Discusión
Sp familia factores de transcripción controlan muchos procesos celulares esenciales para el desarrollo de los tumores humanos [3]. Diversas estrategias se han explorado en los últimos años para interferir con la actividad de Sp TFS incluyendo compuestos naturales y pequeños RNAs de interferencia. derivados del ácido aureólicos, como MTM-A, son inhibidores eficaces de Sp TFS [15], [18], [19], [20]. Estos compuestos se unen al ADN rico en GC y evitar la interacción de los TFs con secuencias ricas en GC en los promotores de genes. Además, desde TFS Sp controlar su propia transcripción, MTM-A reduce el nivel de proteínas SP, reforzando así el efecto sobre la actividad transcripcional [21], [34]. Varios factores pueden influir en las propiedades farmacológicas y toxicológicas de los antibióticos aureólicos: afinidad por secuencias ricas en GC, la cinética de asociación /disociación a ADN, la capacidad para competir con las proteínas SP para la unión a ADN y la captación celular [17], [20], [ ,,,0],27], [43].