Extracto
La mucina MUC4 y su socio de membrana del receptor ErbB2 oncogénico son potenciales socios que interactúan en el desarrollo del tumor pancreático humano. Sin embargo, la forma en que funcionan sigue siendo en gran parte desconocido. En este trabajo, que tuvo como objetivo identificar los mecanismos celulares y las vías de señalización intracelular bajo el control tanto de ErbB2 y MUC4 en una línea celular adenocarcinomatous pancreático humano. El uso de co-inmunoprecipitación y GST pull-down, se muestra que MUC4 y ErbB2 interactúan en la línea celular adenocarcinomatous pancreático humano Capan-2
a través de los dominios EGF
de MUC4. Se generaron clones de células estables en los que sea MUC4 o ErbB2 fueron derribados (KD) por un enfoque shRNA. a continuación, se estudiaron las propiedades biológicas de estas células
in vitro
y
in vivo
. Nuestros resultados muestran que las células ErbB2-KD son más apoptosis y menos proliferativa (disminución de la ciclina D1 y aumento de la expresión p27kip1) mientras que las propiedades de migración e invasoras no se alteraron. clones MUC4-KD eran menos proliferativa con una disminución de la expresión de ciclina D1, G1 del ciclo celular y la expresión de ErbB2 /ErbB3 alterado. Sus propiedades de migración, mientras que se redujeron las propiedades invasivas se incrementaron. Es importante destacar que la inhibición de la expresión de ErbB2 y MUC4 no perjudicó las mismas vías de señalización (inhibición de la expresión MUC4 afectó a la vía de JNK mientras que la de ErbB2 altera la vía MAPK). Por último, las células ErbB2-KD y KD-MUC4 mostraron retraso del crecimiento tumoral
in vivo
. Nuestros resultados muestran que ErbB2 y MUC4, que interactúan físicamente, activar diferentes vías de señalización intracelular que regulan las propiedades biológicas de Capan-2 células de cáncer de páncreas
Visto:. Jonckheere N, N Skrypek, Merlin J, Dessein AF, Dumont P, Leteurtre E, et al. (2012) La mucina MUC4 y su membrana socio ErbB2 Regular propiedades biológicas de las células humanas Capan-2 del cáncer pancreático
a través de diferentes vías de señalización
. PLoS ONE 7 (2): e32232. doi: 10.1371 /journal.pone.0032232
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 12 Agosto, 2011; Aceptado: 24 Enero 2012; Publicado: 29 de febrero 2012
Derechos de Autor © 2012 Jonckheere et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación: Dra. Nicolas Jonckheere es un beneficiario de una beca postdoctoral del Instituto Nacional del cáncer (INCA) y la Ligue Nationale contre le Cancer (LNCC). Nicolas Skrypek es un beneficiario de una beca de doctorado del Centro Hospitalario Regional Universitario (CHRU) de Lille /región Norte-Paso de Calais. Dr. Frédéric Frénois es un beneficiario de una beca postdoctoral de la Fundación para la Investigación Médica (FRM). Johann Merlin es el beneficiario de una beca de doctorado de la Universidad de Lille 2 y la región Norte-Paso de Calais. Este trabajo es apoyado por una beca de la Ligue Nationale contre le Cancer (Equipe Labellisée Liga de 2010, IVS). Isabelle Van Seuningen es el destinatario de un "Contrato Hospitalier de Recherche Translationnelle" /CHRT de 2010, AVIESAN. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en el mundo. La curva de supervivencia es extremadamente corto (6 meses) y la tasa de supervivencia a los 5 años es muy baja (3%). Este resultado dramático está relacionado con la falta de herramientas terapéuticas y marcadores de diagnóstico precoz que hace que el cáncer de páncreas el cáncer más mortal. En el momento del diagnóstico, más de 80% de los PDAC son ya metastásico o localmente avanzado y sólo alrededor del 10-15% de los pacientes se consideran elegibles para la resección quirúrgica. carcinogénesis pancreática sigue una progresión metaplasia /displasia /cáncer con PDAC desarrollo a partir de precursores de lesión ductal pancreático llamadas neoplasia intraepitelial (PanIN-1A /1B /-2 /-3) en el que histológico, citológico y alteraciones genéticas se acumulan [1], [2 ]. Identificación de nuevas dianas moleculares, especialmente aquellos con alteraciones en la expresión a principios de PanIN, y descifrar los mecanismos moleculares que subyacen a la enfermedad, sin duda, permitirá el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para detener /ralentizar la progresión del tumor.
En este contexto , la unida a la membrana mucina MUC4, que se expresa ya en PanIN-1A mientras que no se expresa en el páncreas sano, y su socio de membrana la ErbB2 receptor oncogénico que se sobreexpresa frecuentemente en el cáncer de páncreas, así como en PanINs, representan dianas terapéuticas prometedoras [3], [4], [5], [6].
El gen codifica una gran MUC4 apomucina (930 kDa) compuesto por dos subunidades MUC4α y MUC4β [7], [8] , [9], [10]. MUC4α es la subunidad extracelular que ofrece una región típica hiperglucosilado. MUC4β es la subunidad trans-membrana que contiene tres dominios similares al EGF (EGF3, EGF1 y EGF2 situados de C-terminal a N-terminal) que se conservan en los seres humanos y roedores [4], [11]. La evidencia experimental con homólogos de rata de Muc4 y ErbB2 sugiere que los dominios similares a EGF juegan un papel en las interacciones receptor-ligando y son un regulador en la señalización relacionada con el crecimiento, la motilidad o la diferenciación de la célula [4], [12]. A partir de estos datos, Carraway y colaboradores han propuesto Muc4 como un modulador de la balanza proliferación /diferenciación [13], pero en este momento, tal mecanismo propuesto no ha sido validado para MUC4 humano.
codifica el oncogén neu ErbB2 /tipo HER2 I transmembrana del receptor de factor de crecimiento que pertenece al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR /ErbB1) de la familia que comprende ErbB3 y ErbB4. La proteína ErbB2 consiste en un dominio extracelular, un dominio transmembrana y un dominio tirosina quinasa intracelular. ErbB2 no tiene ligando conocido y se describe como un co-receptor que hetero-dimeriza con los otros receptores ErbB [14]. ErbB2 se sobreexpresa frecuentemente en cánceres, incluyendo el PDAC, donde se amplifica con frecuencia ErbB2.
Los estudios en células humanas siguen siendo escasos y hasta el momento sugieren un posible papel de MUC4 en las propiedades biológicas de las células de cáncer de páncreas [15], [ ,,,0],dieciséis]. En cuanto a ErbB2, sólo un estudio reciente en otro modelo de células de cáncer de páncreas se ha demostrado que ErbB2 puede estar implicado en las propiedades de las células de cáncer de páncreas [17]. Trabajos anteriores en colon y células pulmonares mostraron que MUC4 y ErbB2 pueden actuar como un complejo funcional y transducir señales intracelularmente [18], [19]. Sin embargo, no queda claro si MUC4 y ErbB2 activan la misma vía (s) de señalización.
En el presente trabajo, se realizó para identificar las vías de señalización intracelular bajo el control de cualquiera de ErbB2 o MUC4 en el mismo modelo celular de cáncer de páncreas para poner a prueba esta hipótesis. Se demuestra que MUC4 humana y ErbB2 interactúan físicamente en las células de cáncer de páncreas y que la inhibición de la expresión de cada uno de los socios de la membrana no se vean modificadas las mismas vías de señalización (inhibición de la expresión MUC4 afecta a la vía de JNK mientras que la de ErbB2 altera la vía MAPK). Se observaron diferentes efectos en las propiedades biológicas de células de cáncer pancreático, lo que sugiere actividades independientes de estas dos proteínas con un papel en el crecimiento del tumor de páncreas de ErbB2, mientras que MUC4 parece estar implicado en el crecimiento y la diseminación tumoral.
Materiales Métodos y
Establecimiento de ErbB2 y MUC4 KD líneas celulares
La línea celular de cáncer pancreático Capan-2 (ATCC, HTB-80) se cultivó como se ha descrito anteriormente [20]. Se obtuvieron células ErbB2-KD después de la transfección estable de células Capan-2 con pGeneClip ™ puromicina vector de codificación ErbB2 ShRNA (SA Biosciences ™). La transfección estable de 1 g de ScaI plásmido digerido se realizó con Effectene® (Qiagen, Courtaboeuf, Francia) siguiendo el protocolo del fabricante. El vector vacío se utilizó para elevar los clones de control de llamadas para no Targeting (NT). La selección se realizó usando puromycine (0,1 g /ml, InvivoGen, Limoges, Francia) y los clones se aislaron mediante dilución en serie limitada. MUC4-derribado células (KD) se obtuvieron por la infección retroviral de Capan-2 células con pRetroSuper plásmido (SA Biosciences ™) que contiene una secuencia de dirección MUC4 (5'-AAGTGGAACGAATCGATTCTGTTCAAGAGACAGAATCGATTCGTTCCACTT-3 '). El vector vacío se utilizó para elevar control de los clones llamados
Mock
. La selección se realizó usando G418 /geneticina (300 mg /ml, Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia) y los clones fueron aislados mediante dilución límite en serie.
Western blotting
citosólicos, extractos celulares y nucleares totales se prepararon como se describe en Van Seuningen
et al.
[21] y Jonckheere
et al.
[22], respectivamente y se mantuvo a -80 ° C hasta su uso. El contenido de proteína (2 l de extractos nucleares) se midió en placas de 96 pocillos usando el método del ácido bicinconínico como se describe en el manual de instrucciones del fabricante (Pierce). Western Blot se llevó a cabo en la membrana de nitrocelulosa (0,2 m, Schleicher y Schuell) tal como se describe anteriormente [23]. Membranas se probaron con anticuerpos contra ErbB-2 (clon Ab-1, dilución 1/500), p27kip1 (dilución 1/500) de Lab Vision Neomarker, EE.UU.; fosfo-p42 /44MAPK (Thr202 /Tyr204) (clon 20G11, dilución 1/500), p42 /44MAPK (I37F5 clon, dilución 1/500), fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (# 9251, dilución 1 /500), SAPK /JNK (56G8 clon, 1/500), fosfo-p38MAPK (Thr180 /Tyr182) (D3F9 clon, 1/1000), p38MAPK (# 9212, dilución 1/1000), FAK (# 3285, dilución 1 /1000), fosfo-Akt (Ser473) (D9E clon, 1/1000), Akt (clon C67E7, dilución 1/1000), la ciclina D1 (clon DCS6, dilución 1/500), EGFR (# 2232, dilución 1 /500), todos de Cell Signaling Technology, EE.UU.; ErbB-3 (clon C-17, 1/500), ErbB-4 (clon C-18, dilución 1/500), la MMP-2 (clon H-76, dilución 1/500), MMP9 (clon 6-6b, la dilución 1/500), Bcl-xL (clon H-5, dilución 1/500), Bax (clon N-20, dilución 1/500), MUC4 (8G7, dilución 1/500) todos de Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.; MUC1 (M8, generoso regalo del Dr. D. Swallow, Londres), o β-actina (A5441, dilución 1/5000) de Sigma, Francia. Los anticuerpos se diluyeron en Tris-solución salina tamponada que contiene 5% (w /v) de leche en polvo no grasa y Tween-20 (TBS-T), a excepción de MUC4 y β-actina y se incubaron durante la noche a 4 ° C antes del procesamiento con la inmunotinción. anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Sigma) se utilizaron y las bandas inmunorreactivas se visualizaron usando el sustrato quimioluminiscente West Pico (Perbio, Brebières, Francia). Quimio-luminiscencia fue visualizado utilizando un aparato LAS4000 (Fujifilm) y los resultados se integraron usando gel Software® analista (Claravision). Los datos presentados son representativos de tres experimentos independientes.
Co-inmunoprecipitación de la MUC4-ErbB2 complejo
150 g de Capan-2 extracto celular se incubaron durante la noche con 1,5 g de anticuerpo anti-ErbB2 (policlonal de conejo, Ab-1, Thermo Scientific). La proteína A se une covalentemente a perlas reticuladas 4% de agarosa (Sigma, Francia), equilibrada con tampón de unión 1 x (Tris-HCl 200 mM pH 7,5 que contiene NaCl 1 M, EDTA 20 mM, y 2% de NP40 (v /v)) y se añadió a la mezcla de lisado-anticuerpo y se incubaron en una plataforma giratoria durante 2 horas a 4 ° C. Las perlas se lavaron tres veces con tampón de unión 1 ×. IgG de conejo (Millipore) se utilizaron como un control negativo. perlas lavadas se mezclaron con 2 x tampón de carga SDS gel antes de la electroforesis en un 2% (w /v) en gel de agarosa e inmunotransferencia como se ha descrito antes [23].
Construcción de la GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2 proteínas de fusión
el ADNc que codifica el MUC4
EGF3 + 1 + 2 secuencia fue amplificado por PCR utilizando una versión epítopo de etiquetado bandera de la subunidad MUC4β [16] llama MUC4F2-CF2 como el plantilla y F_EGF3 (5'-CGCGGATCCGCCTGTGAGGAGCCG-3 ') y R_EGF1 (5'-TCCCCCGGG TCAGAAGCAGCGGCTGTC-3') como cebadores. El producto de PCR que codifica MUC4
EGF3 + 1 + 2 fue digerido por
BamHI
y
SmaI
e insertado en pGEX-4T1 (GE Lifesciences). El pGEX-4T1-GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2 y luego construcción se transfectó en B834pLysS
E. coli gratis (Novagen) usando electroporación y
E. coli
se cultivó en medio Luria Bertani (Invitrogen) a una DO
600 de 0,8. GST-MUC4 expresión de la proteína
EGF3 + 1 + 2 fusión entonces se indujo mediante la adición de 1 mM de isopropylthiogalactopyranosyl (Ambion) a 15 ° C durante la noche. Las células se recogieron por centrifugación a 3800 × g a 4 ° C, se resuspendieron en 60 ml de tampón de lisis (1 × PBS, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, 1% (v /v) de Triton X /100) y se lisaron por sonicación (Branson Sonifier 250). Después de la centrifugación (20 000 x g, 90 min, 4 ° C), el sobrenadante se recuperó, y GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2 se separó a partir del lisado de células enteras usando perlas de glutatión agarosa (Qiagen). Después de lavar perlas con tampón de lisis, GST-MUC4
EGF3 + 1 + proteína de fusión 2 se eluyó mediante 40 mM de glutatión reducido en un 8,0 tampón de 50 mM Tris-HCl pH que contiene NaCl 150 mM, 0,1% (v /v) Triton X /100 y 1 mM de DTT. pureza de proteína se determinó por tinción con azul de Coomassie después de una SDS-PAGE 12%. La proteína purificada se dializa frente a tampón de unión 1X y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
GST pull-down
El GST-MUC4
EGF3 + 1 + 2 se cargó en perlas de glutatión equilibradas (Qiagen,) tal como se describe por el fabricante. Después de una noche de unión a 4 ° C en presencia de la proteína ErbB2 humana recombinante (5 g, R & amp; D systems, Lille, Francia), las perlas de glutatión se lavaron 3 veces con tampón de unión 1 ×. Las perlas lavadas se mezclaron con 2 x tampón de carga SDS y se hirvieron en 100 ° C durante 5 min. El sobrenadante se cargó en una SDS-PAGE 6% y se transfirió sobre una membrana de PVDF. Blot Western ErbB2 se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente.
ligando ensayo de proximidad
In situ
ensayos ligando de proximidad se realizaron con Duolink II Starter Kit Red (Olink, Uppsala, Suecia ) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, 2,5 x 10
5 células fueron sembradas en una diapositiva Permanox cámara (Nunc, Brumath, Francia) y se incubaron 72 h para alcanzar el 70-80% de confluencia. Las células se fijaron 20 min con (v /v) de paraformaldehído al 4% a TA antes de una etapa de bloqueo con la solución de bloqueo durante 30 min a 37 ° C. Se diluyeron anticuerpos primarios contra MUC4 (8G7) y ErbB2 (C-18) a 1/50 en 1 × PBS pH 7,4 y se incubaron durante 90 min a TA. sonda PLA PLUS anti-conejo y menos anti-ratón se diluyeron en 1/5 en diluyente de anticuerpo, y se incubaron con las células 1 h a 37 ° C después de dos etapas de lavado. La ligación y amplificación se realizaron entonces a 37 ° C con el fin de visualizar el complejo. Los portaobjetos se monta con Duolink II Medio de montaje que contiene DAPI. Coloraciones se visualizaron con un Zeiss LSM 710 microscopio confocal (Zeiss, Jena, Alemania), las imágenes fueron capturados y analizados con el software de navegación eficiente Zeiss (Zeiss, Jena, Alemania).
La microscopía confocal
La microscopía confocal se llevó a cabo como se describe anteriormente [24]. anticuerpos MUC4 (8G7, Santa Cruz) y ErbB2 (C-18, Santa Cruz) se utilizaron en la dilución 1/50 en 1 x D-PBS + Mg
2 ++ Ca
2 + (Invitrogen) que contiene 0.2% (w /v) de saponina y 2% (v /v) de suero de cabra. AlexaFluor® 594 de cabra anti-ratón y AlexaFluor® 488 de cabra anti-conejo (Invitrogen) anticuerpos secundarios se utilizaron respectivamente para detectar MUC4 y expresión ErbB2.
ensayos de migración y la invasión
migración celular y la invasión propiedades de los diferentes clones se evaluó a través de las cámaras 24, respectivamente, así el control de Boyden (8 micras poros) y las cámaras recubiertas con matriz Matrigel® (BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, 10% (v /v) de suero bovino fetal se utilizó como quimioatrayente en la cámara inferior. 5 × 10
4 células se sembraron en la cámara superior y se incubaron durante 48 h. Después de la tinción con DiffQuick (Médiane Diagnóstico, Plaisir, Francia), las células en la superficie inferior se contaron utilizando un microscopio óptico a 100 × magnificación. Ocho campos de visión al azar fueron contados y el experimento se repitió cuatro veces.
Citometría de Flujo
Las células se cultivaron durante 24 h antes de ser cosechadas por tripsinización, y luego se resuspendieron en 1 x PBS. Las células se fijaron mediante la adición de 1 ml de 70% (v /v) de etanol e incubación en hielo durante 30 min. Después, las células se lavaron con 1 x PBS, se trató durante 5 minutos con RNasa A (100 mg.ml
-1) y finalmente se tiñeron con yoduro de propidio (50 mg.ml
-1, Sigma) durante 30 min. análisis de las células se llevó a cabo en un Beckman Coulter EPICS XL3-MCL (Villepinte, Francia) utilizando el software Wincycle (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, USA).
xenoinjertos subcutáneos
subcutánea (SC) xenoinjertos (6 × 10
6 células en 150 l de RPMI 1640) de Capan-2 clones fueron inyectados con 150 ml de Matrigel® (ref 354262, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Francia) en entre seria inmunodeficiencia combinada (SCID) los ratones que fueron criados y mantenidos en condiciones libres de patógenos (6 ratones /tipo de célula). el desarrollo del tumor fue seguida periódicamente. El volumen del tumor (mm
3) se determinó mediante el cálculo de V = W
2 × L /2 en la que W corresponde a la anchura (en mm) y L a la longitud del tumor (en mm). Los ratones se sacrificaron 55 días después de la inoculación. Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con la normativa y aprobados por el Cuidado de Animales (Comité Ethique la experimentación Animale Nord Pas-de-Calais, número de permiso /Protocolo: AF042008). Para cada tumor SC, el tejido se fijó en formalina antes de la inclusión en parafina. Los ratones que presentan características de dolor (pérdida de peso, caquexia, piloerección) o portadores de tumores llegando a 1 cm
3 fueron sacrificados.
La inmunohistoquímica
SC tejidos xenoinjertados fueron fijadas en 10% (w /v) tamponada de formaldehído, se incluyeron en parafina, se cortaron en 4 espesor micras y se aplica en portaobjetos SuperFrost® (Menzel-Glaser, Braunschweig, Alemania). Las láminas fueron teñidas con hematoxilina-eosina-azafrán-Astra azul. Manual de inmunohistoquímica (IHC) se llevó a cabo como se describe en Van der Sluis
et al
[25] y IHC automático con un sistema automatizado immunostainer (ES, Ventana Medical System, Estrasburgo, Francia) como en Mariette
et al
[26]. Los anticuerpos se utilizaron como sigue:. Dilución 1:200 de anti-ErbB2 (DAKO), 1:100 de anti-MUC4 8G7 (Santa Cruz Biotechnology) y 1:50 de anti-MUC1 M8
microarrays de ADN el análisis
análisis del transcriptoma comparativos se llevaron a cabo en cuatro MUC4-KD y cuatro clones celulares ErbB2-KD. Fueron comparados con un grupo de cuatro Mock y cuatro clones celulares NT, respectivamente. ARN de calidad se comprueba mediante el Agilent 2100 Bioanalyser (Agilent Technologies, Massy, Francia). cRNA muestras fueron sintetizados usando el kit de baja ARN de entrada fluorescentes lineales de amplificación (Agilent). La hibridación de Cy3 y Cy5 cRNA marcado se realizó en el 44 K pangenomic 60 microarray mer oligonucleótido humano (Agilent) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Microarrays fueron escaneados utilizando el escáner y G2505C Características Software de Extracción de Agilent (v10.5). Los datos se procesaron con el software GeneSpring (v10) para la normalización, el filtrado, y el análisis estadístico. Los genes regulados positivamente o downregulated (doble cambio & gt; 5) con significación estadística (P & lt; 0,05) fueron ordenados usando asintótica cómputo valor de p. Todos los datos son compatibles con MIAME. Los datos en bruto se ha depositado en la Expresión Génica Omnibus (GEO, número de acceso: GSE31322).
QRT-PCR
Total ARN a partir de células de cáncer de páncreas se prepararon utilizando el kit NucleoSpin® RNA II ( Macherey Nagel) siguiendo el protocolo del fabricante. ADNc se prepararon como se describe anteriormente [27]. PCR se realizó usando el kit de SsoFast ™ Evagreen Supermix siguiendo el protocolo del fabricante usando el sistema de PCR en tiempo real CFX96 (Biorad). Primer información se da en la Tabla S1.
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism software 4.0 (GraphPad software Inc., La Jolla, EE.UU.). Los datos se presentan como media ± SEM. Las diferencias en la media de dos muestras fueron analizadas por el estudiante de
t
prueba o un modo de prueba de ANOVA con la comparación seleccionada utilizando el test post hoc HSD de Tukey con diferencias de menos de 0,05 consideró significativo y fueron marcados con un *. ** Indica p & lt; 0,01, *** indica p & lt; 0,001. Las diferencias de contingencia se analizaron mediante la prueba de Chi cuadrado.
Resultados
MUC4 y ErbB2 interactúan físicamente en las células del cáncer pancreático Capan-2
La inmunoprecipitación de Capan-2 con el extracto celular anticuerpo anti-ErbB2 se llevó a cabo antes de inmunotransferencia con anticuerpo anti-MUC4. MUC4 inmunotinción indica que MUC4 co-inmunoprecipitó con ErbB2 en Capan-2 células (Figura 1A, carril 1). La especificidad de la interacción se evaluó mediante IgG de conejo irrelevantes que no mostraron ninguna banda inmunoprecipitada (carril 2). Con el fin de mostrar una interacción física directa entre MUC4 y ErbB2, se llevó a cabo un ensayo de primera GST pull-down. Para ello, hicimos una GST-MUC4
proteína EGF3 + 1 + 2 de fusión que contiene los tres dominios similares a EGF de MUC4. Después hemos preparado dos columnas de afinidad, ya sea teniendo la GST-MUC4
EGF3 proteína de fusión + 1 + 2 o la GST sola en la que se cargó ErbB2 humana recombinante. Después de cromatografía de afinidad, de inmunotransferencia anti-ErbB2 mostró una banda específica ErbB2 para la columna de perlas de glutatión que lleva el GST-MUC4
EGF3 + + 2 proteína de fusión 1 (Figura 1B, carril 1). No se observaron bandas para la GST glutatión cojinete columna solo (carril 2).
(A) Co-inmunoprecipitación de 150 g de Capan-2 extracto celular con un anticuerpo anti-ErbB2 (carril 1) o IgG de conejo ( carril 2). Capan-2 extracto celular solo (carril 3). (B) inmunotransferencia ErbB2 de GST pull-down de la proteína ErbB2 humana recombinante con GST-MUC4 perlas
EGF3 + 1 + 2 de glutatión (carril 1) o perlas de glutatión GST (carril 2). ErbB2 recombinante solo (carril 3). (C)
In situ
ensayo de ligando de proximidad en Capan-2 células. MUC4 y ErbB2 complejos (puntos rojos) se indican por una flecha. Los núcleos se tiñeron utilizando DAPI. experimento de control se llevó a cabo en ausencia de anticuerpo primario. (D) la detección de inmunofluorescencia de MUC4 (rojo) y ErbB2 (verde) mediante microscopía confocal mostró co-localización de las dos proteínas (amarillo). (E) La expresión de ErbB2 en MUC4 y dos clones representativos de células MUC4-KD y KD-ErbB2 y sus respectivos controles (Mock y NT) por Western Blot.
La interacción entre MUC4 y ErbB2 era entonces confirmado utilizando otro enfoque que es el
In situ
ensayos de ligamiento por proximidad (PLA). Los resultados indican que MUC4 y ErbB2 forman un complejo endógeno en Capan-2 células (puntos rojos, flechas, Figura 1C). Finalmente, los estudios de microscopía confocal confirmaron la co-localización de MUC4 y ErbB2 en Capan-2 células (Figura 1D). En conjunto, estos resultados indican que MUC4 y ErbB2 interactúan físicamente en Capan-2 células del cáncer pancreático
a través de
MUC4
EGF3 + 1 + 2 región que contiene los tres dominios similares a EGF. a continuación, se realizó para identificar los mecanismos celulares y las vías de señalización intracelular bajo el control de ambos socios.
Generación y caracterización de clones celulares estables ErbB2-KD y KD-MUC4
Los cinco ErbB2- KD y siete clones celulares MUC4-KD, respectivamente, mostraron una inhibición casi total o total de ErbB2 y MUC4 expresión en comparación con el control de los clones (Figura 1E). El análisis de transferencia Western de otra mucina unido a la membrana que es importante en el cáncer, MUC1, indica que la inhibición de MUC4 deteriorado dramáticamente la de MUC1 mientras que la inhibición de ErbB2 no tuvo ningún efecto (Figura S1). Cuando nos fijamos en la expresión de los otros tres miembros de la familia de receptores ErbB, la inhibición de MUC4 o expresión de ErbB2 dio lugar a una fuerte disminución de ErbB2 y ErbB3 (MUC4-KD) y de ErbB3 (ErbB2-KD), respectivamente, mientras que no se No se detectó efecto de ErbB1 y ErbB4 (Figura S1).
Papel de ErbB2 y MUC4 sobre la proliferación celular y la apoptosis
células MUC4-KD mostró una disminución de la proliferación de las 48 horas que se mantuvo a 72 h y se convirtió significativa a las 96 h (44% menos que las células Mock, p & lt; 0,05). células ErbB2-KD también eran menos proliferativa con una disminución significativa de 27% a las 96 h (p & lt; 0,05) (Figura 2A). Se observó una detención del ciclo celular fuerte en la fase G1 (54,5% ± 0,13) en las células MUC4-KD cuando se compara con células Mock (37,4% ± 7,2, *, p = 0,016) (Figura 2B). Por otra parte, la fase G2M fue mucho más corto en las células MUC4-KD (20,9% ± 4,7) en comparación con células de control Mock (39,6% ± 6,7, **, p = 0,0035) (en general *, p = 0,0102). En las células ErbB2-KD, una tendencia a la detención del ciclo celular en G1 también ocurrió que permaneció estadísticamente no significativa (p = 0,119) (Figura 2B). Con el fin de identificar los mecanismos responsables de esta alteración en la proliferación, expresión de marcadores del ciclo celular se evaluó mediante Western Blot (Figura 2C). Claramente, disminución de la proliferación en las células MUC4-KD estaba asociada con la represión de la ciclina D1. En las células ErbB2-KD, disminución de la proliferación se asoció tanto con el aumento de expresión de p27
Kip1 inhibidor del ciclo celular y la disminución de la ciclina D1 (Figura 2D), lo que sugiere un arresto celular en el control de la proliferación G1 /S.
(a) el crecimiento celular se evaluó mediante el recuento de células a las 24, 48, 72 y 96 h para Capan-2 MUC4-KD o ErbB2-KD y sus respectivos controles (Mock y NT). * = P & lt; 0,05 usando estudiante
t-test
. (B) Los perfiles de distribución del ciclo celular de MUC4-KD, ErbB2-KD y sus clones de control (Mock y NT) por citometría de flujo tras la incubación con ioduro de propidio. Los valores se expresan como la media de tres experimentos independientes. * = P & lt; 0,05 mediante la prueba de Chi cuadrado. ns = no significativo. (C) Efecto de MUC4 o el silenciamiento de ErbB2 se analizó el ciclo celular marcador de ciclina D1 y p27
Kip1 por Western blot. β-actina se midió como el control interno. (D) Las bandas se cuantificaron por densitometría. Se muestran los histogramas de la relación (ciclina D1 o p27
Kip1 /β-actina). (E)% de la población subG1 de MUC4-KD, ErbB2-KD y controles (Mock y NT, respectivamente) se determinó mediante citometría de flujo tras la incubación con iodure de propidio (* = p & lt; 0,05). (F) Western blot se llevó a cabo para la caspasa 3 escindida, Bcl
XL y Bax en MUC4-KD, ErbB2-KD y sus respectivos controles (Mock y NT). β-actina se evaluó como un control interno. (G) propiedades de migración de MUC4-KD, ErbB2-KD y control de los clones (Mock y NT) fueron evaluados utilizando cámaras de Boyden. Los resultados se expresan como número medio de células por campo migratorio visión (*** = P & lt; 0,001, ns = no significativo). (H)% de la invasión (células células invasoras /migratorias) se determinó utilizando cámaras de Boyden recubiertas con Matrigel®.
Para evaluar si la inhibición MUC4 o ErbB2 también podría afectar a la apoptosis, la medición de la población de células apoptóticas ( subG1 células) por citometría de flujo se llevó a cabo (Figura 2E). Los resultados indicaron un aumento significativo de la población subG1 (13,33% ± 2,1) en las células ErbB2-KD en comparación con clones de control NT (6,2% ± 0,4) (*, p = 0,017). En las células MUC4-KD, no se observaron diferencias en la población de células subG1 en comparación con clones de control (Mock ns, p = 0,19). La expresión de marcadores de apoptosis por inmunotransferencia indicó que Bax y Bcl
XL no fueron alterados en las células MUC4-KD y KD-ErbB2 mientras que se observó aumento de la caspasa-3 escinde en las células ErbB2-KD (Figura 2F).
papel de MUC4 y ErbB2 en la migración celular /invasión /adherencia
Para evaluar el papel de MUC4 y ErbB2 en la migración celular /invasión, los experimentos se llevaron a cabo en cámaras de Boyden sin o con recubrimiento Matrigel®, respectivamente . Los resultados indicaron que se observó un menor número significativo de células migratorias en las células MUC4-KD (37,8 ± 1,5) en comparación con las células Mock (60,1 ± 3,3) (p≤0.001) mientras que no se encontraron diferencias significativas en las células ErbB2-KD (53,5 ± 8,8) en comparación con los clones de NT de control (56,2 ± 6,3) (Figura 2G). Cuando medimos la invasividad, las células MUC4-KD aparecieron significativamente más invasiva (41,8% ± 1,5, n = 7) que las células que expresan MUC4 (mock) (19,5% ± 1,5, n = 5) (p = 0,029) (Figura 2H). clones ErbB2-KD, por otro lado, fueron ligeramente menos invasiva (9,4% ± 1,15) que las células que expresan ErbB2 (NT, 14,14% ± 2,1), pero esta disminución no fue significativa (p = 0,09). La capacidad de las células ErbB2-KD KD-MUC4 y adherirse en Matrigel® (hecha de dos componentes de la matriz de páncreas extracelular de colágeno IV y laminina) o colágeno I también se evaluó pero no se encontraron diferencias significativas para cualquiera de las células (no se muestra) .
Papel de ErbB2 y MUC4 en la señalización intracelular
El impacto de ErbB2 o MUC4 en las principales vías de señalización intracelular fue estudiada por Western blot para: (MAPK p42 /44, p38 y JNK ), Akt, y quinasa de Adhesión focal (FAK) (Figura 3 y Figura S2). La fosforilación de p42 MAPK /p44 fue totalmente abolida en células ErbB2-KD en comparación con el control de los clones NT, lo que indica una inhibición completa de esta vía posterior al silenciamiento ErbB2. En las células MUC4-KD en comparación con los clones simulados, p42 constitutiva /MAPK p44 disminuyó mientras que p42 fosforilada /44 aumentó sugiere una activación de la vía MAPK vinculado a la supresión MUC4.
(A) análisis de transferencia Western se llevaron a cabo en extracto citosólico de MUC4-KD, ErbB2-KD y controles (Mock y NT, respectivamente) para la expresión de ambas formas fosforiladas y constitutivas de p42 /p44, JNK y p38 MAPK. β-actina se utilizó como control interno. Se presentan dos clones representativos. (B) Las bandas se cuantificaron por densitometría. Se muestran los histogramas de la relación (forma fosforilada /constitutivo) de p42 /p44, JNK y p38 MAPK quinasas.
Cuando nos fijamos en la vía de JNK, se observó una represión total de la fosforilación de JNK en MUC4 -kd clones en comparación con los controles Mock lo que sugiere que la expresión MUC4 drásticamente los impactos actividad de la vía de JNK. No se observó ningún efecto sobre la vía de JNK en los clones ErbB2-KD. vía de p38 MAPK no parece ser alterado significativamente después de cualquiera de ErbB2 o el silenciamiento MUC4 (Figura 3). Del mismo modo, Akt y FAK vías no se modificaron significativamente (Figura S2).
En conjunto, estos resultados muestran que la pérdida de MUC4 y ErbB2 deteriora dramáticamente JNK y p42 /44 MAPK vías de señalización, respectivamente.
efecto de ErbB2 y MUC4 en las propiedades de tumores
in vivo
Para confirmar
in vitro
datos de MUC4 y ErbB2 efectos sobre las propiedades de células tumorales, los estudios de xenoinjertos SC se llevaron a cabo . Los resultados indican que el volumen del tumor fue significativamente menor en los ratones xenoinjertados con M4-2-1 o M4-2-10 clones en día 22 (Figura 4A) en el que la ausencia de MUC4 se confirmó por IHC (Figura 4B). Reducción de la expresión de ErbB2 mostró previamente
in vitro fotos: por Western Blot también fue confirmado
in vivo en tumores
MUC4-KD por IHC (Figura 4B).