Extracto
biomarcadores moleculares para determinar la eficacia de las terapias dirigidas en el tratamiento del cáncer han sido ampliamente adoptada en el cáncer colorrectal (CCR), pero los de predecir la sensibilidad de quimioterapia siguen estando mal definido. Hemos probado nuestra hipótesis de que la mutación KRAS puede ser un predictor de la sensibilidad oxaliplatino en CRC. KRAS fue derribado en las células CRC KRAS-mutante (DLD-1
G13D y SW480
G12V) por pequeños RNAs de interferencia (siRNA) y sobreexpresados en KRAS no mutado células CRC (Colo320DM) por KRAS-mutante vectores para generar células emparejadas CRC. Estas células CRC emparejados fueron probados por oxaliplatino, irinotecán y 5FU para determinar el cambio en la sensibilidad a los fármacos mediante el ensayo de MTT y citometría de flujo. Las razones de la alteración de sensibilidad se determinaron aún más por Western blot y reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR). En las células de CRC de tipo salvaje KRAS-(Colo320DM), la sobreexpresión del gen KRAS por vectores mutantes causó la reparación por escisión del grupo de complementación cruzada 1 regulación a la baja (ERCC1) en proteínas y los niveles de ARNm, y la sensibilidad mejorada oxaliplatino. Por el contrario, en las células CRC KRAS-mutante (DLD-1
G13D y SW480
G12V), KRAS derribado por KRAS-siRNA condujo a la regulación positiva de ERCC1 y el aumento de la resistencia a oxaliplatino. La sensibilidad de irinotecán y 5FU no había cambiado en las células de CRC pareadas. Para validar ERCC1 como predictor de la sensibilidad para el oxaliplatino, ERCC1 fue derribado por siRNA en células CRC-KRAS de tipo salvaje, que restauraron la sensibilidad oxaliplatino. Por el contrario, ERCC1 se sobreexpresa por vectores ERCC1 expresan en las células CRC KRAS-mutante, y causó la resistencia oxaliplatino. En general, nuestros resultados sugieren que la mutación KRAS es un predictor de la sensibilidad oxaliplatino en células de cáncer de colon mediante el mecanismo de regulación a la baja de ERCC1
Visto:. Lin YL, Liau JY, Yu SC, Ou DL, Lin LI, Tseng LH , et al. (2012) La mutación KRAS es un predictor de oxaliplatino sensibilidad en células de cáncer de colon. PLoS ONE 7 (11): e50701. doi: 10.1371 /journal.pone.0050701
Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 8 de Mayo, 2012; Aceptado: 25 Octubre 2012; Publicado: 28 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Lin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por una subvención del Departamento de Salud, Yuan Ejecutivo (DOH100-TD-C-111-001), Taipei, Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
biomarcadores para determinar la eficacia del tratamiento se han investigado en la era de la quimioterapia tradicional, pero sólo un número limitado de marcadores biológicos se ha encontrado hasta el momento. Ejemplos de ello son la reparación por escisión grupo cruzada complementación 1 expresión (ERCC1) para predecir la resistencia de oxaliplatino [1], y la expresión de la timidilato sintasa (TS) para determinar la sensibilidad 5FU [2]. Este concepto ha evolucionado y se ha vuelto más relevante mientras que el tratamiento ha avanzado hasta la era molecular dirigida. La mayoría de los agentes moleculares dirigidas tienen objetivos predefinidos, que facilitan la predicción de la eficacia del tratamiento o el pronóstico de las enfermedades. Buenos ejemplos son el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) mutación para predecir la eficacia de los inhibidores de la tirosina quinasa del EGFR (TKIs) en el adenocarcinoma de pulmón [3], así como la mutación KRAS para la predicción de la falta de respuesta de anticuerpo monoclonal EGFR en el cáncer colorrectal (CRC) [ ,,,0],4]. Aunque se han llevado a cabo extensos estudios para identificar nuevos factores predictivos de las vías de señalización conocidos o estudios basados en microarrays [5], [6], los biomarcadores para predecir la sensibilidad de quimioterapia siguen siendo poco definido.
(A) KRAS-derribado DLD-1
células G13D eran más resistentes a oxaliplatino, pero tienen la misma sensibilidad a irinotecan, 5FU, doxorubicina y de los padres células G13D DLD-1
, como se demuestra por el ensayo de MTT. (B) El nivel de proteína ERCC1, pero no los de TOPO1 o TS, se reguló después DLD-1
G13D células fueron derribados por KRAS siRNA. (C) El nivel de ARNm de ERCC1, pero no los de TOPO1 o TS, se reguló derribado después de que se DLD-1
células G13D por KRAS siRNA. ***:
p Hotel & lt; 0,001
Varios análisis post hoc de los últimos ensayos aleatorios sobre la Convención sugiere que el estado de KRAS mutación genética podría predecir la eficacia de la quimioterapia citotóxica, sobre todo. para los regímenes basados en oxaliplatino. OPUS [7] y el primer [8] Los estudios, que fueron diseñados tanto para los pacientes que reciben de primera línea oxaliplatino /5FU /leucovorina con /sin anticuerpos monoclonales EGFR, son buenos ejemplos. Principalmente se centra en el grupo de quimioterapia sólo en estos 2 estudios muestra que la primera línea de supervivencia libre de progresión (SLP) en el grupo de KRAS mutado duró más de lo que en el grupo de tipo salvaje, con el 8,6 frente al 7,2 meses en el estudio OPUS, y 8,8 frente a 8,0 meses en el estudio PRIME. Por el contrario, en el estudio CRYSTAL [9], que fue diseñado para pacientes que reciben primera línea con irinotecan /5-FU /leucovorina con /sin anticuerpo monoclonal EGFR, no se observó un fenómeno similar. La mediana de la SLP de primera línea en pacientes con KRAS-mutante y de tipo salvaje fue de 7,7 y 8,4 meses, respectivamente.
De acuerdo con estas observaciones, la hipótesis de que la mutación KRAS puede ser un predictor de la sensibilidad oxaliplatino en el CCR. En primer lugar, KRAS fue derribado en las células CRC KRAS-mutante y sobreexpresa en células CRC-KRAS de tipo salvaje. Estas células CRC emparejados fueron probados por oxaliplatino, irinotecán y 5FU para evaluar el cambio en la sensibilidad a los fármacos. Las razones de la alteración de sensibilidad se determinaron aún más por Western blot y reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR). Por último, el objetivo responsables de la alteración de sensibilidad fue validado por golpear hacia abajo y que sobreexpresa el objetivo.
(A) noqueado-KRAS-SW480 abajo
G12V células eran más resistentes a oxaliplatino, pero tienen la misma sensibilidad a irinotecán, 5FU, doxorubicina y que los padres células SW480 G12V
, como se demuestra por el ensayo MTT. (B) El nivel de proteína ERCC1, pero no los de TOPO1 o TS, se reguló después SW480
G12V células fueron derribados por KRAS siRNA. (C) El nivel de ARNm de ERCC1, pero no los de TOPO1 o TS, se reguló después SW480
G12V células fueron derribados por KRAS siRNA. ***:.
p Hotel & lt; 0,001
Materiales y Métodos
Cultivo celular y reactivos
CRC líneas celulares Colo320DM Humano (KRAS de tipo -wild), DLD-1
G13D (KRAS G13D mutación), y SW480
G12V (KRAS G12V mutación) se obtuvieron todos de la American Type Culture Collection. Las células fueron todos mantuvieron en medio RPMI-1640 que contenía suero bovino fetal al 10%, 2 mmol /L de L-glutamina (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.), y PSA (10.000 unidades /ml de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina y 25 mg /ml de anfotericina B; Biological Industries, Kibbutz Beit Haemek, Israel) y se cultivaron a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO2. El oxaliplatino (Eloxatin inyección de 5 mg /ml) se obtuvo de Sanofi-Aventis Co., Ltd. (Taipei, Taiwán). Irinotecan, 5FU, y la doxorrubicina fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). Los anticuerpos de conejo para western blot contra ERCC1 y KRAS se adquirieron de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, EE.UU.). Los anticuerpos de ratón contra TS, la topoisomerasa I (topo I), y β-actina se obtuvieron de Millipore (Bedford, MA, EE.UU.), BD Biosciences (San Jose, CA, EE.UU.) y celulares Biolabs, Inc. (San Diego, CA, EE.UU.), respectivamente.
(a) KRAS células
G13D-DDK-myc-Colo320DM eran más sensibles a oxaliplatino, pero tienen la misma sensibilidad a irinotecán, 5FU, doxorubicina y que las células parentales Colo320DM, como demostrado por el ensayo de MTT. (B) El nivel de proteína ERCC1, pero no los de TOPO1 o TS, se downregulated después de las células Colo320DM fueron transfectadas por el gen KRAS
G13D vector mutante. (C) El nivel de ARNm de ERCC1, pero no los de TOPO1 o TS, se downregulated después de las células Colo320DM fueron transfectadas por el gen KRAS
G13D vector mutante. **:.
p Hotel & lt; 0,01
Llamar a la puerta abajo de KRAS y ERCC1
Hay dos tipos de tanto KRAS y ERCC1 pequeños RNAs de interferencia (siRNA) y revueltos no específica (control negativo) siRNA fueron adquiridos de Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, EE.UU.). Para KRAS gen desmontables, DLD-1
G13D y SW480
células G12V se transfectaron primero con KRAS- o revueltos siRNAs durante 1 día usando el reactivo de transfección Lipofectamine2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante . Las células transfectadas se trataron entonces con oxaliplatino, irinotecan, 5FU y doxorrubicina con varias concentraciones para las siguientes 72 horas. El lisado de proteína y ARNm de los padres y KRAS caída DLD-1
G13D y las células SW480 G12V
se recogieron en 24, 48, 72 y 96 horas después de la transfección para la evaluación de la magnitud de KRAS caída por Western blot. Para desmontables gen ERCC1, las células transfectadas con Colo320DM dos ERCC1- diferente o SiRNAs revueltos fueron tratados con oxaliplatino durante 72 horas. El lisado de proteína y ARNm de las células parentales y Colo320DM ERCC-derribados fueron recogidos en 24, 48, 72 y 96 horas después de la transfección para evaluar el efecto de ERCC1 caída por Western blot y QRT-PCR.
( a) KRAS
células G12V-DDK-myc-Colo320DM eran más sensibles a oxaliplatino, pero tienen la misma sensibilidad a irinotecan, 5FU, doxorubicina y que las células Colo320DM parentales, como se demuestra por el ensayo de MTT. (B) El nivel de proteína ERCC1, pero no los de TOPO1 o TS, se downregulated después de las células Colo320DM fueron transfectadas por el gen KRAS
G12V vector mutante. (C) El nivel de ARNm de ERCC1, pero no los de TOPO1 o TS, se downregulated después de las células Colo320DM fueron transfectadas por el gen KRAS
G12V vector mutante. **:
p Hotel & lt; 0,01. (D) el porcentaje de aumento de la apoptosis, del 22,5% ± 0,2% a 39,1% ± 0,2% de la apoptosis (P & lt; 0,001), se ha demostrado cuando KRAS
células wt-DDK-myc-Colo320DM, se compararon con KRAS
células G12V-DDK-myc-Colo320DM, en el que, tanto fueron tratados por la misma concentración de oxaliplatino en 5 mM. *:
p Hotel & lt; 0,001
La sobreexpresión del gen KRAS y ERCC1
El vector-KRAS-etiquetados pCMV6-Myc-DDK se adquirió de OriGene Technologies (. Rockville, MD, EE.UU.). Secuencia de ADN que codifica KRAS G12V y mutación G13D fueron generados por mutagénesis dirigida al sitio y se clonó en el vector de etiquetado pCMV6-Myc-DDK-KRAS. Las secuencias de KRAS G12V y mutación G13D eran como sigue: 5'-GTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGCGTAGGCAAGAATGCC-3 '; inversa: 5'-GGCACTCTTGCCTACGCCAACAGCTCCAACTACCACAAG-3 'y hacia adelante: 5'-GGTAGTTGGAGCTGGTGACGTAGGCAAGAGTGCC-3'; inversa: 5'-GGCACTCTTGCCTACGTCACCAGCTCCAACTACC-3 ', respectivamente. Para la sobreexpresión del gen KRAS, células Colo320DM fueron transfectadas transitoriamente con el etiquetado-pCMV6-Myc-DDK-KRAS, vectores -KRAS
G12V, y -KRAS
G13D. Después de 24 horas de la transfección, las células fueron tratadas con oxaliplatino, irinotecan, 5FU, doxorubicina y con varias concentraciones de las siguientes 72 horas. El lisado de proteína y ARNm de las células transfectadas por el Colo320DM-etiquetados pCMV6-Myc-DDK-KRAS, -KRAS
G12V, y -KRAS
vectores G13D se recogieron a las 24, 48, 72, y 96 horas para la evaluación KRAS de magnitud sobreexpresión por Western blot. Para la sobreexpresión de ERCC1, SW480
G12V células fueron transfectadas por el vector pCMV6-ERCC1-GFP (OriGene Technologies, Rockville, MD, EE.UU.) durante 24 horas, y tratados con oxaliplatino durante 72 horas. El lisado de proteínas de SW480
células G12V transfectadas por el vector ERCC1-GFP se recogieron a las 24, 48, 72, y 96 horas para la evaluación de magnitud ERCC1 sobreexpresión por Western blot.
(A) ERCC1- células Colo320DM derribados eran más sensibles a oxaliplatino que las células Colo320DM parentales, como se demuestra por el ensayo de MTT. (B) Las proteínas y los niveles de ARNm de ERCC1 se downregulated cuando fueron derribados por las células Colo320DM ERCC1 siRNA. *:
p Hotel & lt; 0,05 (C) ERCC1-GFP-SW480
G12V células eran más resistentes a oxaliplatino que los padres células SW480 G12V
. (D) ERCC1 ectópico se reguló después SW480
G12V células fueron transfectadas por el vector de expresión de ERCC1-GFP.
Viabilidad de las células apoptóticas y análisis
La viabilidad celular se evaluó mediante el uso de la 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT; Tokyo Chemical Industry Inc., Tokio, Japón) de ensayo en 6 repeticiones. Inicialmente, Colo320DM, SW480
G12V, y las células G13D DLD-1
se sembraron a 3500, 4500, y 3000 células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo plano, respectivamente. Después de 24 horas de incubación, las células SW480 G13D
G12V y DLD-1
fueron transfectadas por KRAS- y revueltos siRNAs, y las células fueron transfectadas Colo320DM por el KRAS-etiquetados pCMV6-Myc-DDK, -KRAS
G12V, y -KRAS
G13D vectores, como se ha descrito. Después de KRAS-siRNAs fueron transfectadas con DLD-1
G13D /SW480
células G12V y vectores KRAS-mutante para Colo320DM células durante 24 horas, las células fueron tratadas con oxaliplatino, irinotecán, 5FU, y doxorrubicina en diversas concentraciones en 10 % FBS-complementados RPMI-1640 durante 72 horas. Las células de control se mezclaron con DMSO a una concentración igual a la de las células tratadas con fármaco. La viabilidad celular de estas células tratadas se midió mediante la adición de 200 l de 0,5 mg /ml de MTT solubilizados en DMSO a cada pocillo, y se incubaron las células en el CO
2 incubadora a 37 ° C durante 2 horas después de la eliminación del medio. La absorbancia se determinó a 570 nm. Las concentraciones de compuestos que inhiben la viabilidad en un 50% (IC
50) se determina utilizando el método de la mediana del efecto mediante el empleo de software Calcusyn (Biosoft, Ferguson, MO, EE.UU.).
(A) Expresión de proteínas de ERCC1 en las células DLD-1 (KRAS
mutación G13D) es regulada hasta después de 5'-azacitidina (agente de-metilación) de tratamiento durante 96 horas, lo que da a entender que la regulación a la baja de ERCC1 en las células CRC KRAS-mutante podría deberse en parte a través hipermetilación ERCC1. (B) Regulación a la baja de ERCC1 en Colo320DM (KRAS de tipo salvaje) células transfectadas por KRAS
G13D-mutante-vector durante 24 y 96 horas no sólo pueden ser restaurados por 5'-azacitidina en 10 M, pero también causó arriba regulación de DNMT3B.
La fracción de células apoptóticas, después de KRAS sobreexpresa en células Colo320DM, y tratada por oxaliplatino, se evaluó mediante citometría de flujo con anexina V-FITC. Colo320DM células se sembraron a 2,5 x 10
5 células /por pocillo durante revueltos y KRAS
transfección G12V-mutante-vector en placas de 6 pocillos. Después de 6 horas de la transfección, el medio de transfección se sustituyó por el medio de regular. Oxaliplatino con la concentración de 5 mM se le dio a las células Colo320DM transfectadas en el día siguiente. células Colo320DM transfectadas se tripsinizaron entonces y se recogieron para su análisis después de 48 horas de tratamiento con oxaliplatino. Las células se centrifugaron a 300 g durante 5 minutos a temperatura ambiente, y la suspensión de células se tiñeron con Anexina V-FITC (kit de ensayo V Anexina, BD Biosciences Pharmingen) y yoduro de propidio a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos en la oscuridad. Las células se analizaron entonces mediante citómetro de flujo FACScan y el programa Cell Quest. La proporción de células apoptóticas fue la proporción de células teñidas con anexina V-FITC.
Análisis Western Blot
KRAS-sobreexpresa Colo320DM y KRAS derribado-SW480
G12V y DLD- 1
células G13D tratados con varias concentraciones de oxaliplatino, irinotecan, y 5FU durante 72 horas en 6 cm platos (1 × 10
5 células por placa) se recogieron y se lisaron con un tampón de lisis RIPA [50 mmol /L Tris-HCl (pH 8,0), 150 mmol /L de NaCl, 1% de NP40, 0,5% desoxicolato de sodio, 0,1% de SDS] (Sigma Cat. No. R0278). Las concentraciones de proteína del lisado se determinaron utilizando un kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Scientific térmica, Odessa, Texas, EE.UU.). cantidades equivalentes de proteína de cada lisado se sometieron a SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de nitrocelulosa para inmunotransferencia. Las membranas se lavaron dos veces transblotted con solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía 0,1% de Tween 20 (TBST). Después de bloquear con TBST que contenía 5% de leche sin grasa durante 40 minutos, las membranas se incubaron con el anticuerpo primario apropiado en TBST que contenía 1% de leche sin grasa a 4 ° C durante la noche. Todos los anticuerpos primarios se diluyeron en una concentración apropiada de 1% sin grasa TBST que contiene leche. Después del tratamiento con el anticuerpo primario, las membranas se lavaron dos veces con TBST durante 20 minutos, seguido de cabra anti-conejo o anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa anti-IgG de ratón-rábano picante (diluido 1:3000) durante 1 hora a temperatura ambiente y se lavó 3 veces con TBST durante 1 hora. Las membranas fueron desarrolladas utilizando un sustrato de quimioluminiscencia mejorada peroxidasa de rábano picante (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
cuantitativa en tiempo real de la transcriptasa inversa de la polimerasa Reacción en Cadena (QRT-PCR)
Colo320DM KRAS-sobreexpresado, KRAS-abatidos SW480
G12V y DLD-1
células G13D tratados con varias concentraciones de oxaliplatino, irinotecán y 5FU durante 24, 48 y 72 horas, respectivamente, se recogieron y se lisaron en un reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y almacenados a -20 ° C. El ARN de estas células se extrajo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ADNc se sintetizaron a partir de ARN total (1 g), utilizando el kit cDNA Archivo Applied Biosystems de alta capacidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc a partir de ARN total de 50 ng se cuantificaron utilizando el universal TaqMan o SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) en un ABI PRISM 7900 Sequence Detection System (Perkin-Elmer /Applied Biosystems). El primer secuencias de ERCC1 (ABI TaqMan ensayo ID: Hs01012158_ml), Topo I (ABI TaqMan ensayo ID: Hs00243257_ml), TS (ABI TaqMan ensayo ID: Hs00426586_ml), y el gen de la β-actina (ABI TaqMan ensayo ID: Hs99999903_ml) como una control endógeno fueron todos adquiridos de Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.). Condiciones para la PCR fueron 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, y 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos (desnaturalización) y 60 ° C durante 1 minuto (hibridación /extensión). La cantidad relativa mRNA del gen diana /gen control endógeno (β-actina) se calculó utilizando el método de? Ct (ciclo umbral), como sigue: expresión relativa = 2-Ct, donde Ct = Ct (gen diana) - Ct (β -actina).
Análisis estadístico
para los estudios de líneas celulares, todos los datos se repitieron durante al menos 3 experimentos independientes. Los datos cuantitativos se representan como media ± desviación estándar. Las comparaciones entre los datos dentro de los mismos experimentos fueron analizados utilizando
t
test de Student. Un
p-valor de
. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Llamar a la puerta abajo KRAS en células CRC KRAS-mutante aumenta la resistencia y oxaliplatino Causas ERCC1 sobreexpresión
El golpear hacia abajo KRAS en LDN-1
células G13D dieron lugar a células más resistentes al oxaliplatino, pero no a irinotecán y 5FU, agentes quimioterapéuticos estándar para el CDN, y no a la doxorrubicina, agente amplio quimioterapéutico espectro para otros tipos de cáncer más importantes. Dos diferentes KRAS-siRNAs fueron transfectadas con DLD-1
G13D células. El IC
50 de los (1) células-emparejado primeros padres DLD-1
G13D /KRAS-siRNA -DLD-1
G13D tratados con oxaliplatino durante 72 horas fue de 3,97 /33,07 M. Los (2)
células segundos emparejado padres DLD-1
G13D /KRAS-siRNA-1 -DLD G13D fue de 3,97 /13,49 M. El IC
50 de DLD-1
KRAS-siRNA-DLD-1
células parentales G13D G13D /pareados tratados con irinotecan, 5FU y doxorrubicina se mantuvo sin cambios (Figura 1A). ERCC1, Topo I y TS, que se piensa que es biomarcadores para predecir la sensibilidad de oxaliplatino [1], irinotecán [10] y 5FU [2], respectivamente, se comprobaron además por Western blot y QRT-PCR (Figuras 1B, and1C ) para explorar mecanismos detrás de nuestros hallazgos. Sólo la expresión de ERCC1 se reguló después de KRAS desmontables; por el contrario, Topo I y TS se mantuvo constante tanto en las proteínas y los niveles de ARNm. eficiencia desmontables KRAS se evaluó por Western blot, que tuvieron disminuido de expresión del gen KRAS después de 72 horas de golpear hacia abajo el gen KRAS (Figura 1B).
Para consolidar aún más nuestra observación, se utilizó otra célula CRC, SW480 , que albergaba otro subtipo KRAS mutante, G12V, a repetir los mismos procedimientos experimentales. En resumen, los padres SW480
células G12V fue, como se esperaba, más sensibles a oxaliplatino de abatidos SW480
células G12V KRAS. El IC
50 de SW480
KRAS-siRNA-SW480
células parentales G12V /G12V tratados con oxaliplatino durante 72 horas fue de 2,08 /13,53 M, sino la de los padres SW480
G12V /KRAS-siRNA- SW480
células G12V tratados con irinotecan, 5FU, doxorubicina y se mantuvo sin cambios (Figura 2A). ERCC1, TOPO I, y TS fueron verificados simultáneamente por Western blot y QRT-PCR (Figuras 2B y 2C), y de nuevo sólo ERCC1 se upregulated después de KRAS desmontables, con niveles TOPO I y TS restante sin cambios en proteínas y los niveles de ARNm. Del mismo modo, la eficiencia desmontables KRAS se midió mediante western blot, que mostró una disminución en la expresión del gen KRAS después de 72 horas de golpear hacia abajo el gen KRAS (Figura 2B).
sobreexpresan en KRAS KRAS de tipo salvaje Células CRC Ventas El oxaliplatino a la sensibilidad y la regulación a la baja de ERCC1
La sobreexpresión del gen KRAS en células Colo320DM por KRAS-mutantes vectores dieron lugar a células más sensibles al oxaliplatino. El IC
50 de Colo320DM los padres /células KRAS
G13D-DDK-myc-Colo320DM tratados con oxaliplatino durante 72 horas fue de 2,86 /0,26 M, sino la de los padres Colo320DM /KRAS
G13D-DDK-Myc células Colo320DM tratados con irinotecan, 5FU, doxorubicina y se mantuvo sin cambios (Figura 3A). ERCC1, Topo I, y TS se comprobaron mediante western blot y QRT-PCR (Figuras 3B y 3C), que mostró que sólo ERCC1 se downregulated sin ningún cambio en los niveles de ARNm y proteínas en TOPO I y TS después de la sobreexpresión del gen KRAS. La expresión de KRAS ectópicos y KRAS endógena se midió por inmunotransferencia de tipo Western, que mostró una sólida expresión de ectópico KRAS, con una expresión constante de KRAS endógenas después de 24 horas la sobreexpresión del gen KRAS (Figura 3B).
los mismos resultados se encontraron también en las células Colo320DM transfectadas con el vector de G12V-mutante KRAS
. El IC
50 de Colo320DM los padres /KRAS
células G12V-DDK-myc-Colo320DM tratados con oxaliplatino durante 72 horas fue de 2,55 /0,25 M, sino la de los padres Colo320DM /KRAS
G12V-DDK-Myc células Colo320DM tratados con irinotecan, 5FU, doxorubicina y se mantuvo sin cambios (Figura 4A). Una vez más, sólo el ERCC1 se downregulated sin ningún cambio de Topo I y TS en proteínas (Figura 4B) y los niveles de mRNA (Figura 4C) después de la sobreexpresión del gen KRAS. La expresión de KRAS ectópicos y KRAS endógenas después de 24 horas la sobreexpresión del gen KRAS se muestra en la Figura 4B. Para fortalecer aún más el hallazgo de que KRAS
células G12V-DDK-myc-Colo320DM eran más sensibles a oxaliplatino que las células parentales Colo320DM, citometría de flujo con anexina V-FITC se realizó. En consecuencia, el aumento de porcentaje de apoptosis, de 22,5% ± 0,2% a 39,1% ± 0,2% de la apoptosis (P & lt; 0,001), se ha encontrado cuando las células Colo320DM parentales, transfectadas por KRAS
WT-DDK-myc-vector, eran en comparación con las células transfectadas por Colo320DM, KRAS
G12V-DDK-myc-vector, en el cual, ambos fueron tratados por la misma concentración de oxaliplatino en 5 M (Figura 4D).
Validación de expresión como el ERCC1 predictor de oxaliplatino sensibilidad
Llamar a la puerta abajo ERCC1 en las células CRC KRAS nativo restaura la sensibilidad de oxaliplatino.
Para confirmar aún más la relación entre la expresión de ERCC1 y sensibilidad oxaliplatino, nos llamó abajo del gen ERCC1 2 usando diferentes ERCC1-siRNAs en células de tipo salvaje KRAS (Colo320DM). Se encontró que el IC
50 de la primera emparejado Colo320DM parental /ERCC1-siRNA (1) células -COLO320DM tratados con oxaliplatino durante 72 horas fue de 2,75 /0,91 M (Figura 5A). Los (2) células -COLO320DM segundos emparejado parentales Colo320DM /ERCC1-siRNA fue de 2,75 /0,83 M (Figura 5A). Las proteínas y los niveles de mRNA de expresión de ERCC1 fueron regulados a la baja después de ERCC1 fue derribado por ERCC1-siRNA en células Colo320DM (Figura 5B).
sobreexpresan ERCC1 en las células CRC KRAS-mutante causa resistencia oxaliplatino.
la sobreexpresión de ERCC1 en SW480
células G12V por el vector ERCC1 que sobreexpresa causados SW480
G12V células se vuelvan más resistentes a oxaliplatino. El IC
50 de SW480
G12V células parentales G12V /ERCC1-GFP-SW480
tratados con oxaliplatino durante 72 horas fue de 1,87 /11,03 M (Figura 5C). Se utilizó Western blot para determinar el nivel de sobreexpresión ERCC1-GFP después de la transfección (Figura 5D).
Discusión
Nuestro estudio muestra que la mutación KRAS es un predictor de la sensibilidad oxaliplatino en las células de cáncer de colon por ERCC1 regulación a la baja. Esto puede proporcionar un paso importante a la quimioterapia personalizada en el cáncer de colon.
En la era de la terapia pre-dirigido, Tournigand et al [11] publicaron el artículo fundamental que indica que, quimioterapia de primera línea, ya sea con irinotecán /5FU /lecovorin (FOLFIRI) u oxaliplatino /5FU /leucovorina (FOLFOX6) en "no seleccionado" pacientes con CCR metastásico, seguido secuencialmente por la otra después de la progresión, no influyó en la supervivencia global (SG). Su artículo también indicó que ambos regímenes pueden ser recomendados como tratamiento de primera línea para CCR avanzado. En la era moderna de la terapia dirigida, el tratamiento actual se ha avanzado a la terapia personalizada después de que el gen KRAS de tipo salvaje fue identificado como un predictor para el anticuerpo monoclonal EGFR. estado de KRAS se ha recomendado que comprobar de forma rutinaria en la práctica oncológica diaria. Para identificar los mejores predictores de la quimioterapia actual o nuevas dianas terapéuticas para los pacientes con CRC KRAS-mutante se justifica. Nuestro estudio se inició para encontrar mejores predictores de la quimioterapia actual, por el que se generó la hipótesis de los análisis de subgrupos de los ensayos clínicos aleatorizados, PRIME [8] y OPUS [7], en comparación con CRYSTAL [9]. De acuerdo con nuestros resultados, los pacientes con CCR-KRAS mutantes podrían beneficiarse más de los que reciben regímenes basados en oxaliplatino de primera línea de pacientes de tipo salvaje KRAS. Este fenómeno merece una mayor confirmación por parte de grandes ensayos clínicos prospectivos.
Nuestros datos demuestran que la mutación KRAS en las células CRC causó regulación a la baja de ERCC1. Este hallazgo significativo podría implicar que algunos otros objetivos druggable desconocidos todavía pueden ser responsables para el tratamiento CRC KRAS-mutante además de la vía tradicional /ERK RAS /RAF /MEK. Para explorar estos objetivos desconocidos, los estudios diseñados desde el punto de vista epigenética y /o genéticos pueden ser útiles. Desde el punto de vista epigenética, la hipermetilación hace que el silenciamiento de genes es bien conocido [12], [13]. En nuestro estudio, hemos encontrado que la expresión de la proteína de ERCC1 en LDN-1 (KRAS
mutación G13D) células es regulada hasta después de (agente de-metilación) de tratamiento 5'-azacitidina durante 96 horas (Figura 6A), lo que indica que la regulación a la baja de ERCC1 en células CRC KRAS-mutante podría ser en parte a través de la hipermetilación ERCC1. También se encontró que la regulación a la baja de la expresión de la proteína de ERCC1 en Colo320DM (KRAS de tipo salvaje) células transfectadas por KRAS-mutante-vector durante 24 y 96 horas podrá ser restituido por 5'-azacitidina (Figura 6B). Esto implicó además que la regulación a la baja de la expresión de ERCC1 en células CRC no es sólo en parte a través de la hipermetilación, pero también determinado por los cambios de expresión en las células KRAS CRC. Debido a la regulación por disminución de ERCC1 en las células transfectadas por Colo320DM, KRAS
G13D-mutante-vector, puedan ser causados por hipermetilación de ERCC1, nos registramos más DNMT3B (ADN metiltransferasa 3B), cuyo papel principal es proceder el proceso de metilación. Se encontró que DNMT3B se reguló cuando ERCC1 se dowenregulated en las células transfectadas por Colo320DM, KRAS
G13D-mutante-vector (Figura 6B). DNMT3B puede suprimir de nuevo por 5'-azacitidina, lo que representa que DNMT3B es probablemente responsable del proceso de metilación. Por lo tanto, nuestros datos muestran que la regulación negativa de ERCC1 en las células CRC KRAS-mutante podría ser a través de la hipermetilación ERCC1. Hemos propuesto que las células CRC KRAS mutantes podrían tener una mayor tasa de metilación en las islas CpG de ERCC1 región promotora que KRAS-mutantes células transfectadas por el gen KRAS de siRNA. Esta hipótesis puede ser validado mediante la comparación de las posibles diferencias de hipermetilación en ERCC1 región promotora del gen KRAS entre las células y las células mutantes KRAS-mutante transfectadas por el gen KRAS de siRNA por metilación de PCR y /o análisis de secuenciación de bisulfito de sodio [14] específica. Todo el concepto sería que la mutación KRAS activación podría causar DNMT3B regulación al alza. Posteriormente, DNMT3B podría obligar a la región promotora de ERCC1 para dar lugar a la hipermetilación del gen ERCC1. Por último, la hipermetilación del gen da ERCC1 en la regulación negativa de la expresión de ERCC1. Alternativamente, desde el punto de vista genético, como KRAS mutación es una mutación de activación, que ha sido ampliamente aceptada [15], [16], hemos propuesto que podría haber un factor desconocido existido, que puede ser inhibida por la activación de gen KRAS o sus señales de aguas abajo. Este factor debe también ser un factor de activación para activar el gen ERCC1. Luego, una vez que se muta el gen KRAS (activado), este factor podría ser inhibida, y la cantidad de este factor podría ser rechazada. Posteriormente, la expresión de ERCC1 podría ser suprimida debido a la falta de este factor. Para llevar a cabo este tipo de estudios, reportero construcciones genéticas utilizando promotor ERCC1, ensayo de actividad de la luciferasa y la inmunoprecipitación de la cromatina pueden por lo tanto necesitan [17].
A pesar de que los mecanismos detallados detrás de estos resultados siguen siendo difícil de alcanzar, crosstalks entre el gen KRAS mutado y las vías de maquinaria de reparación del ADN, que también podrían ser responsables del efecto del tratamiento basado en oxaliplatino, han sido objeto de investigación [18], [19]. Además, varias nuevas generaciones de tecnologías basadas en microarrays, comparando mismas células dadas con /sin la mutación KRAS golpeando hacia abajo y que sobreexpresan el gen KRAS en consecuencia, pueden ser otra forma útil en la definición de nuevos objetivos para KRAS-mutantes tratamiento CRC [5], [6].
la sobreexpresión de ERCC1 se asocia a la resistencia a la quimioterapia basada en platino [1], [20], [21], [22], [23], [24], que ha sido demostrado en diversos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de esófago [25], no pequeñas de cáncer de pulmón de células [26], y los cánceres de vejiga [27]. Estos resultados también son compatibles con el estudio actual. En nuestro estudio, hemos demostrado que KRAS de tipo salvaje células (Colo320DM) CRC eran más resistentes a oxaliplatino que las mismas células dadas (Colo320DM) transfectadas por el gen KRAS de mutantes-vectores.