Extracto
El cáncer de ovario es la enfermedad ginecológica más letal que afecta a las mujeres en los EE.UU.. La Red Atlas del Genoma del Cáncer identificado mutaciones de p53 en el 96% de los carcinomas ováricos serosos de alto grado, lo que demuestra su papel crítico. Además, la vía de factor de crecimiento transformante beta (TGF) es disfuncional en diversos tumores malignos, incluyendo el cáncer de ovario. Este estudio investigó cómo la expresión de tipo salvaje, mutante, o la ausencia de p53 altera la respuesta ovárica cáncer de células de señalización de TGFß, así como la respuesta del epitelio superficial del ovario y el epitelio de las trompas de Falopio TGF. Sólo las células de cáncer de ovario que expresan p53 de tipo salvaje fueron inhibidas por el crecimiento TGF, mientras que las células de cáncer de ovario que eran p53 mutante o nulo no lo eran. TGF indujo la migración en las células SKOV3 p53 null, que no se observó en células SKOV3 con la expresión estable de p53 R273H mutante. Desmontables de p53 de tipo salvaje en las células de cáncer de ovario OVCA 420 mejoradas migración de células en respuesta a TGF. Se observó un aumento de la expresión de la proteína DKK1 y TMEPAI, dos genes pro-invasivos con mayor expresión en el cáncer de ovario metastásico etapa tardía, en desmontables p53 y células nulas, mientras que las células que expresan de forma estable p53 mutante demostraron menor DKK1 y la inducción TMEPAI. La expresión de p53 o la pérdida de p53 seguido permiso de proliferación de líneas celulares de cáncer de ovario en la presencia de TGF mutante; Sin embargo, las células que expresan p53 mutante exhibición reducen la migración y la disminución de los niveles de proteína de DKK1 y TMEPAI
Visto:. Ó hAinmhire E, Quartuccio SM, Cheng W, Ahmed RA, Rey SM, Burdette JE (2014) La mutación o pérdida Modifica de p53 diferencialmente TGF Acción del cáncer de ovario. PLoS ONE 9 (2): e89553. doi: 10.1371 /journal.pone.0089553
Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos de América
Recibido: 12 de septiembre de 2013; Aceptado: January 21, 2014; Publicado: 20 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Burdette et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado en parte por subvenciones de la Liz Cancer Research Fund Tilberis ovárico L /T /UIC /0.1.2011, Premio Vahlteich de la Facultad de Farmacia de la UIC y la Sociedad Americana de Investigación del cáncer de subvención Académico de Illinois División RSG-12-230-01-TBG . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la quinta causa principal de muerte por cáncer y la enfermedad ginecológica más letal entre las mujeres estadounidenses. En 2013, se diagnosticaron 22.240 casos un estimado de cáncer de ovario, dando como resultado 14.030 muertes [1]. La alta tasa de mortalidad puede atribuirse al hecho de que más del 60% de los cánceres de ovario se diagnostica después de la enfermedad se ha extendido a sitios distantes. Una vez hecho metástasis, la tasa de supervivencia a cinco años se reduce a menos del 30% [1]. La ineficiencia del diagnóstico se debe principalmente a la falta de comprensión de los sucesos iniciadores y mecanismos de progresión que dan lugar al cáncer de ovario, con pocas estrategias de detección precoz [2]. Es importante destacar que, si el cáncer de ovario se diagnostica antes, las tasas de supervivencia puede ser tan alta como 90% [1]. Estas estadísticas ilustran la necesidad fundamental para entender mejor los eventos tempranos mecanicistas de cáncer de ovario que va a ayudar al diagnóstico precoz y un mejor pronóstico de los pacientes.
El supresor tumoral p53 es el gen más frecuentemente mutado en los cánceres humanos [2] . p53 es un factor de transcripción que controla muchas funciones celulares tales como el ciclo celular, apoptosis, y la respuesta al daño del ADN [3]. La mayoría
TP53
mutaciones son mutaciones sin sentido, donde un solo resultados de sustitución de bases de nucleótidos, ya sea en la disfunción o la ausencia de la actividad de p53 [4]. Estas mutaciones conducen a un aumento de la proliferación, invasión y metástasis en muchos tipos de cáncer [5]. El Genome Atlas Cancer Network (CGAN) identificó p53 como ser mutado en hasta el 96% de los cánceres de ovario, de quimioterapia resistentes de alto grado serosas, lo que indica un papel esencial para mutaciones de p53 en el cáncer de ovario seroso [6]. Por otra parte, la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer (IARC)
TP53
base de datos indica que la mutación de p53 más frecuente en el cáncer de ovario seroso es una arginina a histidina conversión en el resto aminoácido 273 (R273H) dentro del dominio de unión a ADN , que representa el 8% de todas las mutaciones de p53 [7]. R273H p53 mutante se ha informado a desempeñar un papel en la promoción de mama y metástasis del cáncer de pulmón [8], [9] mediante el aumento de la migración y la invasión.
Otra vía de señalización importante que se modifica en el cáncer de ovario es el de crecimiento transformante la vía del factor beta (TGF) [10]. TGF es una superfamilia de factores de crecimiento peptídicos que regulan el crecimiento, la diferenciación, la apoptosis y la migración [10]. señales de TGF por la unión a una familia de receptores de membrana de serina /treonina quinasa, que fosforila aguas abajo moléculas de señalización, Smads principalmente 2 y 3 [11]. Una vez activados, estos complejos de Smad se translocan al núcleo e interactúan con diversos co-activadores y represores de modular la transcripción regulada-Smad [11], [12]. TGF juega un papel importante en la inducción de la detención del crecimiento en células de ovario normales [13]. En algunas células cancerosas, TGF induce apoptosis y detención del ciclo celular, mientras que en otras células de cáncer que pierde la capacidad de inducir la detención del crecimiento y en su lugar puede promover la invasión celular [10]. También puede desempeñar un papel en la quimiorresistencia en los cánceres de ovario seroso avanzada [14]. Los componentes básicos de la vía TGF, los receptores de TGF, y las proteínas Smad, rara vez son mutados o perdidos en el cáncer de ovario [5], lo que sugiere que la alteración de la vía de TGF se produce por otros mecanismos.
Como p53 y Smads son ambos factores de transcripción, p53 es capaz de interactuar con Smads para modificar tanto el p53 y TGF vías de señalización [4]. Smads pueden formar un complejo transcripcional con p53 para inducir la expresión de genes que promueven la detención del ciclo celular, tal como p21 [4]. Smads y se unen p53 a sus propios elementos de respuesta en los promotores de genes TGF-sensible para activar sinérgicamente o reprimir la transcripción [4]. De hecho, se ha demostrado que se requiere p53 para la detención del ciclo celular inducida por TGF [4]. Además, mutante R273H p53 abroga la detención del ciclo celular inducida por TGF-y promueve el comportamiento metastásico mediante el bloqueo de p63 en células de carcinoma de mama [8]. En estas células, la p53 mutante /complejo Smad inhibe la transcripción mediada por p63 que conduce a la invasión en presencia de Ras oncogénico [8].
Dado el alto porcentaje de mutaciones de p53 en tumores de ovario [6] y el reciente evidencia de que p53 y Smads interactúan para regular la metástasis en células de carcinoma de mama [8], se investigó el papel de la p53 mutante en respuesta a TGF señalización en el cáncer de ovario. p53 y TGF están implicadas en muchos cánceres como el de mama y de pulmón en su propia [15], [16] y en concierto [8]. En los cánceres de mama y de pulmón, p53 mutante interactúa con Smads para alterar la transcripción de los genes que regulan la metástasis [8], pero se sabe poco acerca de cómo p53 y TGF interactúan en el cáncer de ovario. Factores necesarios para el crecimiento y la metástasis en mama, pulmón, y cáncer de colon pueden no ser necesarios en el cáncer de ovario, lo que lleva al tejido efectos específicos de la señalización de p53 mutante [17]. Dos genes (
TMEPAI
y
DKK1
) fueron estudiados en función de su papel en la metástasis en el cáncer de ovario.
TMEPAI
es un regulador negativo inducida por TGF [18] y está implicada en la metástasis inducida por TGF en líneas celulares de carcinoma de mama [18], pero nunca se ha notificado a ser co-regulados por p53 y Smads.
DKK1
es un inhibidor de la señalización de Wnt, que a menudo se regula positivamente en el cáncer de ovario metastásico, y se asocia con un mal pronóstico [19]. Maspin, una proteína anti-metastásico, también fue elegido como se ha establecido la regulación por p53 y Smads [20]. El presente estudio evaluó si la expresión de una de las mutaciones de p53 más comunes en el cáncer de ovario (R273H) altera la respuesta de las células a Smad señalización para modular la proliferación celular y la migración.
Materiales y Métodos
Cell cultura y
Todos los reactivos se obtuvieron de Life Technologies (Carlsbad, CA) a menos que se indique lo contrario. OVCA 420, OVCA 429, y OVCA 432 son líneas celulares que han sido publicados anteriormente [21], [22], mientras que las células OVCAR5 están disponibles a través del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) como parte de la NCI60 línea de células tumorales de detección de drogas contra el cáncer [ ,,,0],23]. Las células Ovča 420, 429 Ovča, Ovča 432, y OVCAR5 (regalo del Dr. Gustavo Rodríguez y el Dr. Teresa Woodruff en la Universidad Northwestern) se mantuvieron en medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1 % de L-glutamina, aminoácidos no esenciales al 1%, 1% de piruvato sódico, y 1% de penicilina /estreptomicina. Se obtuvieron células OVCAR3 de ATCC (Manassas, VA) y se mantuvieron en el mismo medio que el anterior, con la excepción de la suplementación con 20% de FBS. células SKOV3 se adquirieron de ATCC y se mantuvieron en McCoy 5A suplementado con carbonato de 2,3 g /L de sodio, 10% de FBS, y 1% de penicilina /estreptomicina.
Las líneas celulares estables fueron seleccionados utilizando plásmidos resistentes a los antibióticos que contienen el gen de interesar. las células que expresan de forma estable SKOV3 p53 mutante R273H [24] (Addgene, plásmido: 16439, donado por el Dr. Vogelstein, Universidad Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, MD) fueron seleccionados utilizando 500 mg /ml de G418 (bio-productos Géminis, West Sacramento , CA) y se mantuvieron en medios SKOV3 que contienen 200 mg /ml G418. OVCA 420 células que expresan p53 shRNA o revueltos shRNA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) fueron seleccionados utilizando 4 mg /ml de puromicina (Sigma-Aldrich) y se mantuvo con 1 mg /ml de puromicina. p53 de tipo salvaje plásmido [24] se adquirió de Addgene (plásmido Addgene: 16434, donado por el Dr. Vogelstein, Universidad Johns Hopkins School of Medicine, Baltimore, MD)
Normal inmortalizado células epiteliales superficiales de ovario humano (. IOSE 80) fueron un regalo del Dr. Nelly Auersperg en la Universidad de Vancouver y se mantuvieron en 50% v /v Medium 199 y 50% v /v MCDB (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 15% de FBS, 1% de L-glutamina, 1% de penicilina /estreptomicina, y 0,055% del factor de crecimiento epitelial (EGF, PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ) [25]. trompa de Falopio humana células epiteliales secretoras normales (FTSEC) fueron un regalo del Dr. Ronny Drapkin en la Universidad de Harvard y se mantuvieron en un 50% v /v DMEM y 50% v /v F-12 (Mediatech, Manassas, VA), 1% L-glutamina, 1% de penicilina /estreptomicina, y 2% Ultroser G (Pall Corporation, Port Washington, NY) [26]. Se aislaron células epiteliales de la superficie del ovario de ratón (MOSE) de ratones C57BL /6 y células epiteliales de trompas de ratón (MTEC) fueron aisladas de ratones CD1 como se describió anteriormente [27]. Las células cultivadas se mantuvieron a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora.
luciferasa ensayo
Las células se sembraron a una densidad de 25.000 por pocillo en placas de 24 pocillos y se incubaron durante la noche. Las células fueron transfectadas con 0.05 g /pocillo de una construcción de expresión que contiene el promotor elemento de unión a Smad aguas arriba del gen de la luciferasa usando Mirus TransIT LT1 (Mirus Bio LLC, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. El elemento sensible plásmido Smad contiene una secuencia CAGA repitió doce veces arriba del gen de la luciferasa (donación del Dr. Aris Moustakas en el Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, Uppsala, Suecia). Los plásmidos para la expresión de p53 de tipo salvaje o plásmidos R273H p53 mutantes se transfectaron en células en 0,05 mg /ml. Las células fueron transfectadas durante 24 horas en medio de suero suplementado. Después, las células se lavaron con PBS y se trataron con TGFß1 a 10 ng /ml (Sigma Aldrich) durante 24 horas. SB-431542 (Selleck Chemicals, Houston, TX) se utilizó a una concentración de 5 mM para todos los ensayos de luciferasa. El protocolo y la eficiencia de transfección SBE-luciferasa se normalizaron y se ejecuta como se describe anteriormente [28]. la actividad de luciferasa de las células normales se midió utilizando un Sinergia Mx (BioTek, Winooski, VT).
Ensayo de proliferación
sulforodamina B (SRB) ensayos se utilizan para determinar la densidad celular. Las células fueron tratadas durante 48 horas con TGF (20 ng /ml) seguido de un ensayo colorimétrico como se describe anteriormente [29]. La supervivencia celular se calculó comparando los valores de absorbancia entre los pocillos tratados y de control. Antecedentes fue restada mediante la medición de la absorbancia de 0,1 mM de Tris-base solo.
citometría de flujo Se sembraron
Ovča 420, Ovča 432, y SKOV3 células en matraces T25 24 h antes del tratamiento. se añadió medio que contiene TGF (20 ng /ml) o control disolvente y se incubó durante 48 hr. Después del tratamiento, las células se tripsinizaron, se lavaron con PBS, se resuspendieron en 500 l de PBS, luego se fija en 4 ml de 70% de etanol, y se almacenaron a -20 ° C durante la noche. Las células fijadas se lavaron con PBS y se tiñeron con 500 l de yoduro de propidio (PI) solución [50 mg /ml PI, 90 unidades de RNasa A, 0,1% de Triton X-100, tampón de citrato /L 4 mmol, mM glicol 10 de polietileno (PEG ) 4000]. Las células se incubaron en la solución de PI durante 20 min a 37 ° C antes de ser tratada con 500 solución de sal de l PI (1 mg /ml PI, 0.1 ml de 10% de Triton X-100, solución 4 M de NaCl, mM PEG 10 4000) . análisis de citometría de flujo se realizó en un Beckman Coulter Elite ESP (Miami, FL) con al menos 30.000 eventos individuales por reacción. Los datos se analizaron con el software Mod-fit (Verity Software House, Inc., Topsham, ME).
Western blot
Las células se cultivaron en placas a 50.000 células por pocillo en placas de seis pocillos, transfectadas con plásmidos apropiados a 0,05 g /ml, y se trató con TGFß1 (10 ng /ml) durante 24 hr. Para inducir p53 expreso, cisplatino (Fisher Scientific, NC9343338) de tratamiento se realizó a 125 mu M durante dos horas. La concentración de proteína se determinó por ensayo BCA (Pierce, Rockford, IL). El lisado celular (30 g) se analizó por 10% SDS-PAGE y se transfirió a nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon a continuación con 5% de leche en TBS-T y se sondaron durante la noche con anticuerpos primarios. Los anticuerpos utilizados fueron p53 humano (# 9282), p21 (# 9247), maspin (# 9117), CDC2 (# 9112) (Cell Signaling Technology, Inc., Beverly, MA) a una concentración de 1:1000; DKK1 (H-120) y p21 de ratón (F-5) (Tecnología de Santa Cruz, Inc, Santa Cruz, CA) se utilizó a una concentración de 1:200; TMEPAI 2A12 (Abnova, Taipei, Tiawan) se utilizó a una concentración de 1:500; y actina (Sigma-Aldrich) a una concentración de 1:1000. Se utilizó anti-ratón y conejo HRP-vinculada secundaria (Cell Signaling Technology, Inc.) para todas las transferencias a una concentración de 1:1000.
cicatrización de heridas ensayo
Las células se cultivaron en placas a 50.000 células por pocillo en una placa de 24 pocillos y se incubaron durante la noche. Una herida uniforme fue creado a través de la monocapa de células usando una punta de pipeta. Las células se lavaron y se trataron con TGFß1 (20 ng /ml) inmediatamente después del rascado. Se tomaron fotos a los 0, 24, y 48 hr después del rascado, y el área de la cero se analizaron con el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD). el cierre se midió por ciento en comparación con las 0 horas y doble cambio se determinó a partir ciento cierre de tratados en comparación con no tratados.
animales, cultivo de órganos e inmunohistoquímica (IHC)
Los animales fueron obtenidos, tratados, y alojada como se describe anteriormente [27]. Ovarios y oviductos fueron disecados y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [30], [31]. El medio de crecimiento consistió en alfa-MEM (Invitrogen), y 1% de penicilina /estreptomicina (Invitrogen) con 0,1% de DMSO, 20 ng /l TGF, 5 M SB431542 (inhibidor de TGF), o 20 ng /l TGF plus 5 M SB431542 añadido como condiciones de tratamiento. TGF se disolvió en agua, pero se añadió 0,1% de DMSO a la condición solo TGF para el control de disolvente SB431542. Bromodesoxiuridina (BrdU, Sigma; 10 mM) se añadió en el medio de crecimiento hr 24 antes de la fijación del tejido. Los tejidos se prepararon para la sección de parafina e inmunohistoquímica se completó como se describe anteriormente [27].
imágenes proliferación
imágenes se realizó con un microscopio Nikon E600 con una cámara digital DS-Ri1 y NIS elementos de software (Nikon Instruments, Melville, NY). ImageJ se utilizó para cuantificar la proliferación celular. Se calculó el porcentaje de proliferación dividiendo el número de células epiteliales tinción positiva para BrdU por el número total de células epiteliales.
declaración Ética
Todos los animales fueron tratados de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio y lo establecido Institucional uso de Animales y protocolo de atención médica en la Universidad de Illinois en Chicago. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Illinois en Chicago (número de protocolo: A08-250). Los animales fueron alojados en un ambiente controlado de temperatura y luz (12 h de luz, 12 h oscuridad) y se les proporcionó comida y agua ad libitum. Todos los ratones fueron sacrificados por CO
2 inhalación seguido por dislocación cervical.
Estadística
analiza
Todos los valores se presentan como la media ± el error estándar. ANOVA seguido de pruebas de comparación múltiple de Tukey se utilizó para evaluar las diferencias entre los grupos experimentales y de control. Para el ensayo de curación de la herida, se utilizó una prueba t pareada para analizar el control y tratados en cada línea celular, mientras que se utilizó un test t no apareado al comparar los grupos tratados entre dos líneas de células diferentes. p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
TGF induce la detención del crecimiento de células de cáncer de ovario que expresan p53 de tipo salvaje
Para entender mejor el papel de p53 en el cáncer de ovario. se analizaron seis líneas celulares de cáncer de ovario conocidos para la expresión de p53 (Fig. 1a). OVCA 420 y 429 células expresan niveles bajos de proteína p53, en consonancia con los informes de que tienen p53 de tipo salvaje [32]. Debido a estos bajos niveles, se utilizó el tratamiento con cisplatino para inducir y confirmar la expresión de p53 en OVCA 429 (Fig. S1). SKOV3 y OVCAR5 no mostraron ninguna expresión de la proteína p53, como es coherente con el hallazgo anterior de que los clasificó como nulo p53 [7]. Por el contrario, OVCA 432, y OVCAR3 exhibieron expresión de la proteína p53 abundante debido a las mutaciones R277H y R248Q, respectivamente (Tabla S1) [7].
(a) análisis de transferencia de Western de líneas celulares de cáncer de ovario que demuestra su p53 estado. Actina utilizado como control de carga. (B) Seis líneas de ovario de células cancerosas (Ovča 420, 429, SKOV3, OVCAR 5, Ovča 432, y OVCAR 3), junto con cuatro líneas primarias, no cancerosos de células (MOSE, MTEC, IOSE80, y FTSEC) fueron tratados con o sin TGF (10 ng /ml) usando el plásmido SBE-luc. ANOVA se realizó por separado para la inducción de plegado (TGF) y doblar la represión (inhibidor y TGF inhibidor +) para analizar la significación en comparación con no tratados. Los datos representan como media ± SEM, * p = 0.05.
Para evaluar cómo la expresión de p53 modula la capacidad de las células para responder a la señalización Smad, se empleó un ensayo de luciferasa para determinar qué células fueron sensibles a TGF inducida por la transcripción Smad (Fig. 1b). Todas las líneas celulares ensayadas, excepto OVCAR5, demostrado la transcripción mediada por TGF que podría ser bloqueada por SB431542, un inhibidor de TGF (datos no mostrados).
A continuación, el efecto de TGF sobre las células progenitoras no cancerosas se investigó. Desde el epitelio ovárico superficie (OSE) y el epitelio trompa de Falopio (TEC) puede dar lugar a cáncer de ovario [33], se investigó la respuesta de estas células normales a TGF. A fin de controlar la señalización aguas abajo de TGF, ensayos de SBE-luciferasa se realizaron en OSE normal de 2D murino (MOSE) y las células TEC murino (MTEC), así como humanas inmortalizadas OSE (IOSE80) y el epitelio trompa de Falopio humana (FTSEC). OSE células y TEC respondieron significativamente a la transcripción mediada por Smad inducida por TGF tanto en ratón y líneas celulares humanas (Fig. 1b). MOSE células respondieron con una mayor activación de veces (21 veces) de la reportera que las células MTEC (7 veces). expresión de p53 en MOSE era anterior confirmó que estaban de tipo salvaje [27], [34]. células MTEC comportaron como de tipo salvaje en respuesta a cisplatino (Fig. S2), mientras que el IOSE80 y FTSEC eran funcionalmente nulos para p53 debido a la inmortalización con SV40.
Sobre la base de estos resultados, tres líneas celulares (OVCA 420 , OVCA 432, y SKOV3) fueron elegidos para analizar más a fondo el impacto de TGF sobre la proliferación. Estas líneas celulares se trataron con TGF (20 ng /ml) durante 48 hr y progresión del ciclo celular se examinó por citometría de flujo. TGF tratamiento indujo G
0 G
1 detención del ciclo celular /en OVCA 420 (Fig. 2a). OVCA 432 células, que expresan p53 mutante, no fueron detenidos por el crecimiento TGF tratamiento (Fig. 2b). Por último, TGF no indujo la detención del ciclo celular en las células SKOV3, sino más bien se redujo el número de células en G
0 /G
1 (Fig. 2c).
(a-c) OVCA 420, OVCA 432, y las líneas celulares SKOV3 se trataron con 20 ng /ml TGF durante 24 horas y se sometieron a análisis de citometría de flujo. Distribuciones de células en las tres fases del ciclo celular están representados por porcentajes medios +/- SEM. La significación estadística representa una diferencia entre el número de células en cada ciclo entre tratados y no tratados y representado con * para un aumento de las células tratadas en comparación con los no tratados;
#represents disminución de las células tratadas en comparación con los no tratados; p = 0.05 (d) Análisis de transferencia Western de las tres líneas celulares de cáncer de ovario sondeadas para las proteínas del ciclo celular p21 y CDC2. Actina se utilizó como control de carga. (E-f) Ensayo de proliferación realizó mediante incorporación de BrdU en el cultivo de órganos en 3D de ratón ovarios y las trompas. Utilizó un modelo lineal se realizó. Los datos representan como media ± SEM * p = 0.05.
Para confirmar aún más el mecanismo para la regulación del ciclo celular p53-Smad, expresión de p21 y CDC2 se evaluaron en OVCA 420, OVCA 432, y SKOV3 las células tratadas con TGF (Fig. 2d). p21 es un inhibidor de quinasa dependiente de ciclina que está regulado por tanto p53 y Smads, y se correlaciona con la detención mediada por TGF ciclo celular [4]. CDC2 (CDK1 o) es una quinasa dependiente de ciclina y su expresión es coherente con la progresión del ciclo celular [35]. tratamiento TGF en OVCA 420 aumentó la expresión de proteína p21 (Fig. 2a y d), que no se observó en las células Ovča 432 y SKOV3 (Fig. 2d). Las células Ovča 432 y SKOV3 expresaron niveles elevados de CDC2 en comparación con OVCA 420 (Fig. 2d). A continuación, se realizó inmunohistoquímica para controlar la proliferación de epitelio normal superficial del ovario del ratón y el epitelio oviductal utilizando un sistema de cultivo de órganos 3D [30] tratado con TGF. Después de 48 horas, la proliferación de OSE se redujo significativamente con el tratamiento con TGF comparación con el control de DMSO (Fig. 2e). A pesar de ser transcripcionalmente sensible, la proliferación no fue inhibida por el tratamiento TGF en células oviductales en cultivo 3D (Fig. 2f). Inmortalización de IOSE80 y FTSEC con el antígeno SV40T inactiva p53 [25], [26], por lo tanto, los ensayos de crecimiento con TGF no se realizaron en estas células.
detención del ciclo celular inducida por TGF se suprime en el mutante p53 y células nulas
Variantes de OVCA 420 fueron creados para investigar el papel de p53 en inducida por TGF detención del ciclo celular (Tabla S1 y S2). El uso de shRNA, endógena de p53 de tipo salvaje efectivamente fue derribado en OVCA 420 (420 OVCA p53 shRNA) las células en comparación con el control shRNA revueltos (OVCA 420 SCR) (Fig. 3a). Además, las células SKOV3 se transfectaron de manera estable para expresar R273H p53 mutante (Fig. 3a). P53 de tipo salvaje no podría ser transfectada de forma estable en las células SKOV3 porque las células se sometieron a la senescencia y no podía ser propagada como se informó anteriormente [36]. La transfección transitoria de p53 de tipo salvaje en células SKOV3 no indujo inmediatamente la senescencia, lo que permitió la recolección de datos en los puntos de tiempo más cortos
.
(a) Western blot de líneas celulares estables a desmontables de p53 por shRNA plásmido o expresión de R273H p53 mutante. C = control, T = TGF tratada. (B) SB-431542 (5 M) se utilizó para inhibir la señalización de TGF. Para cada panel, datos representa aumento ± SEM p = 0.05 sobre tratada significar para los grupos marcados con un, o entre los grupos tratados con la etiqueta b. (C) la supervivencia celular. Porcentaje de supervivencia de las células tratadas con TGF en comparación con no tratados. Los datos representan la media ± SEM, * p = 0.05.
En primer lugar, se investigó la capacidad de las líneas celulares variante de responder a TGF. Todas las líneas celulares estables mantienen la capacidad de inducir la transcripción mediada por Smad de un plásmido SBE-luciferasa independientemente del estado de p53 (Fig. 3b). la inducción de luciferasa se mantuvo la misma en el OVCA 420 p53 shRNA y OVCA 420 Scr en comparación con las células parentales OVCA 420 (Fig. 3b). Del mismo modo, las células p53 R273H mutantes estable SKOV3 no alteraron inducida por TGF mediada por la transcripción Smad del gen de la luciferasa (Fig. 3b). La expresión transitoria de p53 de tipo salvaje en las células SKOV3 redujo la transcripción mediada por Smad en comparación con las células R273H mutante p53 SKOV3, pero no aparece ninguna diferencia significativa en comparación con la línea celular padre SKOV3 (Fig. 3b).
a fin de evaluar la proliferación en respuesta a TGF (20 ng /ml), ensayos de crecimiento celular se realizaron después de la incubación de 48 h. Como era de esperar, OVCA 420 crecimiento celular Scr fue reprimida en respuesta a TGF, que era similar a la línea parental (Fig. 3c). inhibición del crecimiento inducida por TGF se perdió en el OVCA 420 p53 shRNA. Del mismo modo, TGF hizo la proliferación no lenta en ambos el padre o la SKOV3 p53 mutante línea celular R273H SKOV3 (Fig. 3c).
expresión de p53 mutante R273H evita la migración TGF-inducida de células SKOV3
Además de afectar a la proliferación, TGF y p53 también se han demostrado que influyen en la migración de las células tumorales de la mama y de pulmón [8], [9], [37]. La literatura previa sugiere que la p53 mutante podría funcionar como un disparador molecular que permite TGF para inducir estímulos pro-migratorias [38]. Por lo tanto, la regulación de TGF de la migración celular en presencia de tipo salvaje, mutante, y p53 nulo se investigó usando un ensayo de herida de curación. TGF induce la migración en ambos OVCA 420 células shRNA SCR y Ovča 420 p53 entre 0 y 24 horas y 24 y 48 horas (Fig. 4a). células OVCA 420 SCR (p53 de tipo salvaje) tratados con TGF migran significativamente más que el control no tratado entre 0 y 24 horas, pero no entre las 24 horas y 48 horas, mientras que OVCA 420 p53 células shRNA tratados con TGF migraron significativamente más que el control entre 0 y 24 horas y entre las 24 y las 48 horas (Fig. 4a). las tasas migratorias se compararon entre los tratados OVCA 420 Scr y p53 OVCA shRNA. Desmontables de p53 permitió un aumento de la migración en comparación con las células de tipo salvaje (Fig. 4b).
(a) ensayos de cicatrización de la herida se realizaron en líneas celulares estables SKOV3 y Ovča 420. monocapas de células se rascaron y se trataron con o sin TGF a 20 ng /ml durante 48 horas. Cierre de la herida se midió como un aumento de veces o disminución en comparación con el control sin tratamiento. Se utilizó la prueba t pareada con una p = 0.05. (B) Comparación de la veces de incremento de muestras TGF desde 5 (a). Se utilizó la prueba t no pareada para analizar la significación. Importancia está representado por * y significa una diferencia estadística entre las líneas celulares. Los datos representan como media ± SEM, * p = 0.05.
La capacidad de las células p53 mutante R273H nulos y SKOV3 SKOV3 migrar en respuesta a TGF fue también analizada. la migración inducida por TGF en las células SKOV3 p53 nulos en comparación con las células no tratadas entre ambos 0 y 24 horas y entre las 24 y 48 horas (Fig. 4a). Sin embargo, la expresión de p53 mutante R273H en las células SKOV3 inhibió la migración inducida por TGF, sin cambio entre 0 y 24 horas, o 24 y 48 horas en comparación con el control (Fig. 4a). SKOV3 que expresan p53 mutante R273H demostraron una menor migración inducida por TGF-SKOV3 de células nulas (Figura 4b).
La expresión de p53 mutante R273H altera TGF-inducida por la expresión de TMEPAI y DKK1
Con el fin de dilucidar los posibles mecanismos por los cuales p53 y TGF podría regular la migración, se investigaron los objetivos pro-invasivos que se sabe están regulados por cualquiera de p53 o TGF en las células de cáncer de ovario. Maspin es un inhibidor de serina proteasa que bloquea la metástasis [20] y se sabe que es co-regulados por p53 y Smads en células epiteliales mamarias [20]. Además, la expresión maspin se habría perdido en los cánceres de ovario, y esto se ha asociado con mal pronóstico y las tasas de supervivencia [39]. Maspin se indujo mínimamente con el tratamiento TGF en OVCA420 y OVCA432 células (Fig. 5a), y no se indujo en SKOV3. Sorprendentemente, maspin no demostró una dependencia de tratamiento TGF o la expresión de p53 en OVCA420 p53 shRNA o líneas de células mutantes p53 SKOV3 R273H (datos no mostrados) en comparación con células parentales que sugieren que las vías adicionales modifican p53 y la regulación Smad de maspin en células de cáncer de ovario.
(a) OVCA 420 (p53 de tipo salvaje), OVCA 432 (mutante p53), y SKOV3 (null p53) las células fueron tratadas con 10 ng /ml TGF durante 24 horas y se analizaron por Western Blot. Las membranas se sondearon con Maspin, TMEPAI y anticuerpos primarios DKK1. Actina se utilizó como control interno de carga. (B) OVCA 420 líneas celulares fueron analizados por Western blot y probaron los factores pro-metastásicos TMEPAI, y DKK1. Actina se utilizó como control interno de carga. (C) las líneas celulares SKOV3 se analizaron por Western blot y probaron los factores pro-metastásicos y TMEPAI DKK1. SKOV3 p53 WT se transfectó transitoriamente con 100 ng /ml de p53 plásmido de tipo salvaje. Actina se utilizó como control interno de carga.
TMEPAI es una proteína inducida por TGF que se sabe que convertir TGF de un supresor de tumores en un promotor de tumores en el cáncer de mama, y se asocia con aumento de la migración en próstata y carcinomas renales [18], [40], [41]. La sobreexpresión de TMEPAI se ha asociado con muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de ovario [42]. TGF aumento de la expresión de TMEPAI en p53 de tipo salvaje OVCA 420 células y células SKOV3 nulos (Fig. 5A). Mutant R277H p53 OVCA 432 células demostraron una inducción reducida de expresión TMEPAI. expresión TMEPAI TGF-inducida en OVCA 420 células transitorias mutante p53 R273H se redujo en comparación con el de tipo salvaje y las células p53 nulo (Fig. 5b). Del mismo modo, TMEPAI inducción por TGF en células R273H mutante p53 SKOV3 fue menor que la de SKOV3 de tipo salvaje y las células p53 nulo (Fig. 5c).
Por último DKK1, un inhibidor de Wnt-señalización, fue seleccionado como se es diferencialmente regulada por la de tipo salvaje y mutantes de p53, y también se sobreexpresa en finales de la etapa metastásica cánceres de ovario [19]. TGF expresión inducida de DKK1 en las células p53 nula SKOV3 (Fig. 5a). Este aumento no se observó en de tipo salvaje OVCA 420 o R277H mutante p53 OVCA 432 células. En OVCA 420 células, los niveles generales de DKK1 fueron más altas en OVCA 420 p53 shRNA, con una ligera inducción por tratamiento TGF (Fig. 5b). OVCA 420 p53 mutante R273H tenía la menor cantidad de DKK1, sin inducción por tratamiento TGF (Fig. 5b).