Extracto
Un número de tipos de cáncer aparecen aumento de la expresión de nicotinamida fosforribosil transferasa (Nampt). Sin embargo, el mecanismo por el que se regula positivamente Nampt no está claro. En nuestro estudio, encontramos que el FK866 inhibidor químico Nampt específica significativamente la supervivencia celular inhibida y los niveles de nicotinamida adenina dinucleótido reducida (NAD) en líneas celulares LoVo y SW480. Los análisis de la bioinformática sugirió que el miR-26b se dirige Nampt ARNm. Se identificaron Nampt como una nueva diana de miR-26b y se demostró que el miR-26b inhibe la expresión Nampt en la proteína y los niveles de mRNA mediante la unión a la Nampt 3'-UTR. Por otra parte, se encontró que miR-26b se reguló hacia abajo en tejidos de cáncer con respecto a que en los tejidos normales adyacentes en 18 pacientes con cáncer colorrectal. Se observó una correlación inversa estadísticamente significativa entre el miR-26b y la expresión Nampt en muestras de pacientes con cáncer colorrectal y en 5 líneas celulares de cáncer colorrectal (HT-29, SW480, SW1116, LoVo, y HCT116). Además, más de expresión de miR-26b inhibió fuertemente la supervivencia celular LoVo y la invasión, un efecto parcialmente abrogada por la adición de NAD. En conclusión, este estudio demostró que la ruta de biosíntesis de NAD salvando implica Nampt podría desempeñar un papel en la supervivencia de células de cáncer colorrectal. MiR-26b puede servir como un supresor de tumores por la orientación Nampt
Visto:. Zhang C, Tong J, G Huang (2013) nicotinamida fosforribosil transferasa (Nampt) es un blanco de microARN-26b en células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (7): e69963. doi: 10.1371 /journal.pone.0069963
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Febrero, 2013; Aceptado el 13 de junio de 2013; Publicado: July 29, 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por becas de investigación de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (los números 30830038, 30970842, 81071180, 81000929); Proyecto "973" (2012CB932604); Proyecto de descubrimiento de nuevo fármaco (2012ZX09506-001-005); Proyecto Clave de la Comisión de Ciencia y Tecnología de la municipalidad de Shanghai (número 10JC1410000); La disciplina y el Proyecto Líder Académico Shanghai (número S30203). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La proteína nicotinamida fosforribosil transferasa (Nampt) tiene varias funciones. Existe en intercelular (iNAMPT) y las formas extracelulares (eNAMPT) [1]. En las células, funciona como una enzima limitante de la velocidad en la vía de recuperación para la síntesis de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), que está implicado en el metabolismo y la proliferación celular [2]. Extracelular Nampt se identificó primero como el factor de mejora de colonia de células pre-B (PBEF), una proteína citoquina similar que estimuló la formación de células B temprano [3]. Su nombre se cambió recientemente como visfatina por Fukuhara y col., Que se identificó como un adipocina derivadas de la grasa visceral que se cree para imitar la función de la insulina [4]. Nampt ha atraído el interés significativo no sólo en los campos del metabolismo y la respuesta inmune, sino también en el campo del cáncer. Un número de tipos de cáncer aparecen aumento de la expresión de Nampt [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], y los inhibidores de Nampt ofrecen aplicaciones terapéuticas prometedoras en el cáncer [12] , [13], [14], [15]. Sin embargo, el mecanismo a través del cual se convierte en upregulated Nampt no está claro.
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeños ARN no codificantes. Identificado como una nueva clase de genes reguladores de expresión, que se dirigen a ARNm para la represión de traducción o degradación [16]. Una serie de estudios han revelado que miRNAs pueden regular la expresión de una variedad de genes, incluyendo los que son importantes para la proliferación tumoral, la invasión o la metástasis [17], [18], [19]. La utilidad de miRNAs en el tratamiento del cáncer se ha demostrado [20], [21], [22].
En este estudio, hemos demostrado que la ruta de biosíntesis de NAD salvamento que implica Nampt juega un papel en colorrectal la supervivencia de células de cáncer. Hemos demostrado por primera vez que Nampt es un objetivo de miR-26b. Por otra parte, la expresión de miR-26b y Nampt fue ensayada en muestras humanas de pacientes con cáncer colorrectal y 5 células de cáncer colorrectal. Se discuten los papeles de miR-26b y Nampt en el desarrollo del cáncer humano.
Métodos
Declaración de Ética
Este estudio ha sido aprobado por el Comité de Ética del Hospital Ren Ji, Escuela de la medicina, Universidad de Shanghai Jiao Tong. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de muestras humanas del Hospital Ren Ji.
Líneas celulares y muestras de tejidos
líneas celulares de cáncer colorrectal SW480, SW1116 , HT-29, LoVo, y HCT116 se utilizaron en este estudio (obtenido de Shanghai Instituto de Enfermedades gastrointestinales, hospital Ren Ji, Escuela de medicina de la Universidad de Shanghai Jiao Tong, china). Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) en una CO 5%
2 incubador humidificado a 37 ° C.
muestras de tejido de colon humano normal adyacente y colorrectal tejidos se obtuvieron de 18 pacientes que se sometieron a cirugía en el hospital Ren Ji, Escuela de medicina de la Universidad de Shanghai Jiao Tong (Shanghai, china). Ninguno de los pacientes recibió quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Las muestras fueron recolectadas y almacenadas a -80 ° C. Los diagnósticos histopatológicos fueron evaluados por el patólogo del hospital utilizando ambos criterios morfológicos y inmunocitoquímica. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado por escrito (como se indica en el formulario de consentimiento PLOS) antes de la recogida de tejidos, y el estudio fue aprobado por los comités de ética del Hospital Ren Ji, Escuela de Medicina de la Universidad de Shanghai Jiao Tong.
CCK-8 Ensayo
La tasa de supervivencia de las células se examinó utilizando Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 5000 células /pocillo en medio completo y se cultivaron durante 24 h. A continuación, el medio se reemplazó con medio RPMI-1640 que contiene 10% de FBS, con o sin tratamiento. Después de la incubación, se añadió 10 l de CCK-8 a cada pocillo, y las placas se incubaron adicionalmente durante 4 h en una incubadora. La absorbancia a 490 nm se leyó espectrofotométricamente utilizando un lector de microplacas.
Apoptosis Ensayo
apoptosis celular se determinó por el ensayo de apoptosis Vybrant kit#2 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cada muestra se evaluó por citometría de flujo con un flujo Coulter Epics XL citómetro (Beckman-Coulter). Los datos se procesaron con la Expo 32 citómetro de software (Beckman Coulter). Los experimentos se llevaron a cabo tres veces por duplicado.
NAD + y NADH Cuantificación
Las concentraciones de NAD
+ y NADH en las células se detectaron utilizando un NAD
+ /NADH kit de cuantificación ( Bio Vision) de acuerdo con el manual. La cantidad de NAD
+ en cada muestra se normalizó al contenido de proteína para cada muestra de ensayo
predicción de los objetivos miARN
basado en computadora TargetScan (http:. //www.targetscan .org /) se utilizó para predecir los miRNAs que se dirigen a Nampt ARNm.
Derribo o sobreexpresión de miR-26b
la expresión de miR-26b en las células fue derribado por transfección con miR-26b inhibidor (GenePharma) o incrementado por la transfección con imita el miR-26b (GenePharma). Las células se sembraron en placas de cultivo o placas de 24 pocillos durante 24 h y luego se transfectaron con inhibidor o imita utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) durante 24 h. Después de la transfección, las células se sometieron a ensayos adicionales o para la extracción de ARN /proteína.
Extracción de ARN y en tiempo real RT-PCR
ARN total fue extraído de células cultivadas y los especímenes de cáncer colorrectal usando TRIzol (Invitrogen). Los niveles de ARNm Nampt y miR-26b se midieron por tiempo real RT-PCR. Para la detección de Nampt ARNm, la transcripción inversa se realizó usando el Sistema de la transcriptasa inversa M-MuLV, y PCR en tiempo real se realizó utilizando SYBR Green (Takara) con el sistema ABI Prism 7700 de detección de secuencias (Applied Biosystems). Se usó gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) para la normalización. Para medir los niveles de miR-26b, en tiempo real el análisis cuantitativo de RT-PCR se realizó usando el kit de transcripción inversa TaqMan y TaqMan microARN Ensayos Kit (Applied Biosystems) según las instrucciones de los fabricantes. Una pequeña sonda TaqMan de ARN nuclear U6 humano se utilizó para la normalización. Las secuencias de cebadores (adelante y atrás) se enumeran en la Tabla 1.
Western Blot
Un número igual de células sedimentadas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato enfriada con hielo (PBS), de nuevo se sedimentaron y se resuspendieron en tampón RIPA. Posteriormente, se incubaron las células a 95 ° C durante 5 min y se centrifugaron en una microcentrífuga durante 5 min. Igual cantidad de proteína total fueron cargados por electroforesis en geles de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con 5% TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente y se incubaron con anticuerpo primario en TBS-T durante 1 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C. Después de lavar 4 veces durante 5 min cada uno en TBS-T, las membranas se incubaron con peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo secundario (Kangchen Technology) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar 4 veces durante 5 minutos, las bandas de proteínas se visualizaron por medio de reacción de quimioluminiscencia y se expusieron a película de rayos X. El anticuerpo primario, anticuerpo anti-Nampt (número de catálogo AP9010c), era de Abgent. Los datos se procesaron utilizando el método 2-ΔΔCT.
Reportero Construye
Los elementos miRNA26b de reconocimiento putativo del gen Nampt y los correspondientes mutantes fueron clonados en la región 3 'no traducida (UTR) de el gen de la luciferasa en el vector pEZX-MT01 luciferasa (GeneCopoeia Inc.). Este clon de expresión contenía la Nampt (Adhesión: NM_005746.2) secuencia 3'-UTR insertado en el vector pEZX-MT01 aguas abajo de un gen de luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor SV40. El vector pEZX-MT01 también contenía el gen de luciferasa de Renilla bajo el control de un promotor de CMV. Firefly luciferase actividad se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla. Se construyeron los clones mutantes para Nampt. La región de unión de la semilla (5'-UACUUGAA-3 ') se cambió a 5' UACUUACA-3 '(sustitución 2-bp). Todas las construcciones fueron confirmados por análisis de secuencia de ADN.
luciferasa reportero de ensayo
células SW480 se cultivaron en placas de 24 pocillos y se transfectaron con mímica el control negativo (NC) o imita el miR-26b (30 nM o 60 nM; GenePharma) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Después de una segunda transfección con un constructo indicador miR-26b o su mutante (50 ng), células SW480 se incubó durante 24 h. Los ensayos de luciferasa se realizaron mediante el sistema de doble luz combinada gen reportero de ensayo (Promega) y Promega Turner TD-20/20 luminómetro.
Transwell ensayo
La migración celular se realizó mediante el ensayo transwell (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Control de miARN o imitadores de células transfectadas miR-26b se cosecharon 24 h después de la transfección. A continuación, 3,0 × 10
5 células transfectadas o células no tratadas en medio libre de suero se añadieron a cada inserto superior pre-recubierto con matriz de Matrigel. A la cámara inferior emparejado, se añadieron 500 l de medio FBS al 10%. Después de la incubación, las células no invasivas se retiran de la superficie superior de la membrana Transwell con un hisopo de algodón, y las células invasoras en la superficie de la membrana inferior se fijaron en metanol, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta, se fotografiaron y se contaron.
Análisis estadístico
Los experimentos se repitieron 3 veces. Los datos se expresan como media ± desviación estándar. Para la comparación de 2 grupos, se utilizó a, t-test no pareado de dos colas. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa. Las pruebas estadísticas se realizaron utilizando el software Estado 12.0 (Stata Corp).
Resultados
-Nampt específica químico inhibidor de FK866 inhibe la síntesis de NAD y Supervivencia Celular
El aumento de expresión Nampt ha sido reportado en cáncer colorrectal primario [5], [6], [7]. FK866 es un inhibidor químico-Nampt específica que inhibe la ruta de biosíntesis de NAD salvar mediante la unión en el sitio de unión de nicotinamida-Nampt, así que las células de NAD [23], [24] el ozono. Según se informa, FK866 se tolera bien, y que inhibe significativamente el crecimiento celular en algunos tumores de tipo [13], [15]. Sin embargo, el efecto de FK866 en el cáncer colorrectal no se ha documentado.
Se analizó el efecto de FK866 en la tasa de supervivencia celular de las células SW480 y LoVo de cáncer colorrectal humano por CCK-8 y ensayo de citometría de flujo. Los resultados mostraron que FK866 promovió significativamente la apoptosis de las células SW480 y LoVo en una forma dependiente de la dosis. El IC
50 de FK866 fue de 14,3 nM para células SW480 y 32,7 nM para células LoVo, de acuerdo con el ensayo de CCK-8 (Figura 1A). La citometría de flujo estudios mostraron que la exposición de las células SW480 y LoVo con diferente concentración de FK866 durante 3 días aumentó el porcentaje de células apoptóticas en fase inicial de 3,37 ± 0,83% a 27,27 ± 1,49% (SW480) y 3,00 ± 0,37% a 21,53 ± 1,76% (LoVo) (Figura 1B).
A. Las células se trataron con diferentes concentraciones de FK866 durante 72 h y luego se evaluaron mediante el uso de Cell Counting Kit-8. El IC
se calcularon 50 valores. Cada ensayo se repitió al menos 3 veces. B. La cuantificación de células apoptóticas inducidas por FK866 fue confirmada por análisis de citometría de flujo. El contenido sub-G1 se designaron las células apoptóticas. *: En comparación con el grupo control negativo; **: En comparación con los 2 grupos de tratamiento. los niveles de C. NAD en células de cáncer colorrectal se midieron después de la exposición a FK866. Cada barra vertical representa la media ± SD de determinaciones por triplicado. Para la comparación de 2 grupos, se utilizó una prueba t no pareada de dos colas.
Se determinó el efecto de la próxima FK866 sobre la biosíntesis de NAD en las células usando el NAD
+ /NADH kit de cuantificación . FK866 exposición durante 3 días, disminuyó el nivel de NAD a partir de 5,33 ± 0,96 a 1,17 ± 0,31 Nm /g (SW480) y 6,63 ± 1,16 a 2,33 ± 0,85 Nm /g (LoVo) (Figura 1C). Estos resultados sugieren que la biosíntesis de NAD salvar mediada por Nampt juega un papel crítico en la supervivencia de las células del cáncer colorrectal y que FK866 tiene propiedades anti-cancerígenas en células de cáncer colorrectal.
miR-26b inhibe la expresión de Nampt través de la unión de su extremo 3 'UTR
Por el análisis de secuencias por ordenador utilizando el software de detección TargetScans (http://www.targetscan.org/), Nampt se predijo a ser un objetivo potencial de miR-26b. La secuencia madura semilla de miR-26b se conserva entre los humanos, chimpancés, rhesus, y las especies arbustivas bebé, entre otros. Por lo tanto, se seleccionó el miR-26b para su posterior caracterización biológica
.
Por imita el miR-26b, la sobreexpresión de miR-26b suprimido Nampt ARNm (Figura 2A izquierda) y proteína (Figura 2B) niveles en las células SW480, detectada por RT-PCR y análisis de transferencia Western, respectivamente. Mientras tanto, imita miR-26b también suprimen el nivel de expresión de NAD +, que se midió por el NAD
+ /NADH kit de cuantificación (Figura 2D izquierda). Por otra parte, la transfección con inhibidor de miR-26b aumentó Nampt mRNA (Figura 2A derecha) y los niveles de proteína (Figura 2C), y miR-26b inhibidor también aumentó el nivel de expresión de NAD + (Figura 2D derecha).
A. Quantitative PCR en tiempo real de Nampt en líneas celulares SW480 después de la transfección con diferentes concentraciones de imita miR-26b o inhibidores. blotting B y C. Western de Nampt en líneas celulares SW480 después de la transfección con diferentes concentraciones de imita miR-26b o inhibidores. D. Los niveles relativos de NAD en las líneas celulares SW480 después de la transfección con diferentes concentraciones de imita miR-26b o inhibidores. los ensayos de reportero de luciferasa E. validación de la interacción directa de miR-26b con la 3'-UTR de Nampt. Nampt-3'-UTR-pEZX (o Nampt-3'-UTR-mut-pEZX) se cotransfectaron con mímica miR-26b o un control negativo en las células SW480. *: En comparación con el grupo control negativo; **: En comparación con los 2 grupos de tratamiento. Cada barra vertical representa la media ± SD de determinaciones por triplicado. Para la comparación de 2 grupos, se utilizó una prueba t no pareada de dos colas.
Para confirmar que Nampt es el objetivo de miR-26b, el efecto de la transfección con imita el miR-26b en la se examinó la actividad del indicador de tipo ancho y mutado pEZX-Nampt. pEZX-Nampt es una construcción de doble informador de luciferasa que contiene un tipo de ancho o segmento mutada del Nampt 3'-UTR con la secuencia de reconocimiento de miR-26b inmediatamente aguas abajo del indicador de luciferasa de luciérnaga (Figura S1A). Un diagrama de Nampt con el tipo salvaje o secuencias mutadas en el sitio de unión de miR-26b potencial se muestra en la Figura S1B. Los mapas de secuencia de tipo salvaje y mutado Nampt obtenida por la secuenciación de genes se muestran en la Figura S1C. Como se muestra en la Figura 2E, la transfección con diferentes concentraciones de imita miR-26b disminuye la actividad de reportero de luciferasa de luciérnaga de tipo salvaje pEZX-Nampt en aproximadamente un 51,7% ± 3,2% y 64,3% ± 4,0%, respectivamente. La inducción de la actividad de reportero por la sobreexpresión de miR-26b por imita miR-26b, sin embargo, no se detectó cuando la secuencia de reconocimiento de miR-26b en la 3'-UTR de Nampt mRNA fue mutado (Figura 2E). Por lo tanto, los resultados de las Figuras 2 confirman que Nampt es un objetivo de miR-26b.
Los niveles de expresión de miR-26b y Nampt en cáncer colorrectal tejidos y líneas celulares
Los niveles de expresión basales de miR-26b y mRNA Nampt se midieron por qRT-PCR en líneas celulares de cáncer colorrectal (HT-29, SW480, SW1116, LoVo, y HCT116), y también se midieron por NAD los niveles basales de expresión de NAD +
+ /Kit NADH cuantificación en líneas celulares. células SW480 tenían la expresión más bajo Nampt y el nivel de NAD +, y el nivel de miR-26b más alto, seguido de HT-29, HCT116, LoVo, y células SW116 (Figura 3A izquierda). Se observó una correlación inversa significativa entre la expresión de miR-26b y el ARNm Nampt, y una correlación positiva significativa entre el NAD + y ARNm Nampt también se observó (Figura 3A derecha).
A. miR-26b, el ARNm Nampt y NAD + se analizaron los niveles en líneas celulares de cáncer colorrectal. La expresión de miR-26b fue inversamente correlacionada con la expresión Nampt en líneas celulares de cáncer colorrectal; la expresión de NAD + fue positivamente correlacionada con la expresión Nampt en líneas celulares de cáncer colorrectal (A la derecha). B. niveles de miR-26b y ARNm Nampt se analizaron en 18 piezas quirúrgicas de tejidos de cáncer colorrectal humano y los tejidos normales adyacentes colorrectales. Nampt niveles significativamente aumentada en los tejidos de cáncer colorrectal se muestran en relación con los niveles Nampt en los tejidos normales adyacentes colorrectales (cambios & gt veces; 6); regulación a la baja de manera significativa los niveles de miR-26b en tejidos de cáncer colorrectal se muestran en relación con los niveles de miR-26b en los tejidos normales adyacentes colorrectales (cruzar los cambios & gt; 2). C. La expresión de miR-26b fue inversamente correlacionada con la expresión Nampt en tejidos de cáncer colorrectal (C izquierda), y el colorrectal tejidos normales adyacentes (C derecha). los niveles de mRNA Nampt se analizaron por tiempo real de RT-PCR y se normalizaron a GAPDH. Los niveles de miR-26b se analizaron por tiempo real de RT-PCR y normalizado a U6. Cada barra vertical representa la media ± SD de determinaciones por triplicado. Para la comparación de 2 grupos, se utilizó una prueba t no pareada de dos colas.
Además, hemos extendido nuestra investigación de muestras de pacientes con cáncer colorrectal. Nuestros resultados mostraron que la expresión Nampt fue significativamente mayor en tejidos de cáncer (6,3 veces) en comparación con la de los tejidos normales adyacentes apareados en el panel de 18 pacientes con cáncer colorrectal (Figura 3B derecha), que fue consistente con los hallazgos de otros [5 ], [6], [7]. Además, encontramos el tejido canceroso mostró una notable pérdida de miR-26b (~45.45%) en comparación con los tejidos normales adyacentes de cáncer colorrectal en el panel de 18 pacientes con cáncer colorrectal (Figura 3B izquierda), que no se ha informado antes . Se observó una correlación inversa entre el miR-26b y la expresión Nampt en los tejidos cancerosos (Figura 3C izquierda) y los tejidos normales adyacentes (Figura 3C derecha).
miR-26b inhibe la supervivencia celular y la invasión, y esto puede ser parcialmente abrogada por la adición de NAD
el Nampt se sabe para regular una variedad de actividades biológicas, incluyendo la supervivencia celular y la invasión. Ya que se cree miR-26b para apuntar Nampt, el efecto de miR-26b en la supervivencia celular y la invasión se investigó. células Además, co-transfectadas con mímica miR-26b, a continuación, se añadieron 1,0 mmol /l NAD + (un máximo de efectividad) para determinar si los efectos de miR-26b están mediados por la biosíntesis de NAD mediada por Nampt.
Uso el ensayo de CKK-8, las células tratadas con inhibidor de miR-26b tenía la proliferación celular más alto, seguido por las células tratadas con el control negativo, imita miR-26b más NAD, y imita miR-26b solo (Figura 4A). Se observó un aumento de 21,1% en el crecimiento celular en las células LoVo 4 días después de la transfección con el inhibidor de miR-26b, cuando se compara con el crecimiento en el control negativo. Sin embargo, la transfección con imita miR-26b suprimió el crecimiento de las células LoVo por 31,48% en comparación con el control negativo. La transfección con imita el miR-26b más NAD aumentó el crecimiento de las células LoVo por 26,85% en comparación con el grupo transfectadas con sólo imita el miR-26b.
A. células LoVo se trataron con imita miR-26b et al., y la viabilidad celular se determinó utilizando Cell Counting Kit-8. B. La cuantificación de células apoptóticas inducidas por imita miR-26b (con y sin NAD) o inhibidor de miR-26b se confirmó por análisis de citometría de flujo. El contenido sub-G1 se designaron las células apoptóticas. C. micrografías representativas de los ensayos de invasión celular (izquierda) y la cuantificación (derecha) de diferentes tratamientos (* P & lt; 0,01). Las células invasoras teñidas se fotografiaron con un microscopio de luz invertida (100 aumentos). *: En comparación con el grupo control negativo; **: En comparación con los 2 grupos de tratamiento. Cada barra vertical representa la media ± SD de determinaciones por triplicado. Para la comparación de 2 grupos, se utilizó una prueba t no pareada de dos colas.
La citometría de flujo resultados del ensayo se muestran en la Figura 4B. La exposición de las células LoVo a los inhibidores de miR-26b durante 4 días disminuyó significativamente el porcentaje de células apoptóticas en etapa temprana (3,03 ± 0,72% en comparación con el 7,33 ± 0,60% en el grupo control negativo). La transfección con imita el miR-26b y NAD disminuyó notablemente la tasa de apoptosis en estadio temprano (12,23 ± 0,35% en comparación con 24,2 ± 0,79% en el grupo transfectadas solamente con imita el miR-26b).
De interés, miR supresión 26b afectado no sólo la supervivencia celular, sino también la invasión (Figura 4C). La transfección con el inhibidor de miR-26b aumentó notablemente la eficiencia invasión de las células LoVo (1,7 veces) de acuerdo con el ensayo Transwell. La transfección con imita miR-26b, sin embargo, la disminución de la eficiencia de las células LoVo invasión a 34,53%, y esto fue rescatado parcialmente por la adición de NAD (aumentado a 66,10%). Los resultados de la Figura 4, por lo tanto indican que el miR-26b inhibe la supervivencia celular y la invasión de las células LoVo. La adición de NAD abrogó parcialmente este efecto.
Discusión
Los estudios han demostrado que Nampt es significativamente mayor en cáncer colorrectal primario [5], [6], [7] y otros tipos de cáncer [8 ], [9], [10], [11]. Por lo tanto, Nampt puede ser un buen marcador biológico de la progresión maligna y la etapa [1], [8], [25], [26]. la biosíntesis de NAD Nampt mediada juega un papel crítico en el metabolismo celular, las funciones de supervivencia, y la resistencia al estrés a través de las sirtuinas y otros reguladores NAD consume [1]. El FK866 inhibidor químico-Nampt específica reduce las células de NAD intracelular mediante la unión al sitio de unión de nicotinamida-de Nampt y la inhibición de la vía de NAD salvamento [23], [24]. En las células cancerosas, FK866 muestra antitumoral [27], anti-metastásico [15], y las actividades anti-angiogénicos [28] y un efecto quimio-sensibilizar [27]. Por el contrario, algunos estudios mostraron células no tumorigénicas no se vieron afectados por FK866 [29], [30]. Estos podrían explicarse por el hecho de que las células cancerosas requieren niveles más altos NAD + para acomodar con alta tasa metabólica de las células normales. En consecuencia, hay una diferencia en la dosis-respuesta entre células malignas y normales como para los niveles de la NAD celular + contenido. Por lo tanto, FK866 se tolera bien, y que inhibe significativamente el crecimiento del tumor in vitro e in vivo. Estos resultados son compatibles con muchas investigaciones [12], [13], [14], [15]. En este estudio, se mostró por primera vez que FK866 supervivencia celular significativamente inhibido y redujo los niveles de NAD en las células SW480 y LoVo, lo que sugiere que el mecanismo de biosíntesis de NAD mediada por Nampt es activo en células de cáncer colorrectal. Interesante, había poca correlación entre la disminución de NAD + y el aumento de la apoptosis usando FK866 acuerdo con nuestros resultados (r = -0.8544,
p = 0.3479)
. Puede haber dos conjeturas diferentes como para el resultado. En primer lugar, puede haber un efecto umbral debido a la alta concentración de FK866. En segundo lugar, Thakur, B. K. informó FK866 es capaz de inducir apoptosis en células leucémicas mediante la activación indirecta de la proteína supresora de tumores p53 [13], y esta vía también podría funcionar en células de cáncer colorrectal. Aunque había poca correlación entre el NAD + y la apoptosis de acuerdo con nuestros resultados, esto no afecta al hecho de que FK866 podría ser un agente prometedor para el cáncer colorrectal. Y los mecanismos moleculares responsables de la alta expresión de Nampt en el cáncer colorrectal no se entienden completamente.
Recientemente, se informó de que la expresión inapropiada de miRNAs contribuye a la patogénesis del cáncer. Disminución de los niveles de miR-26b se observan en una amplia gama de tumores [17], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]. En nuestros estudios, hemos demostrado que la expresión de miR-26b fue significativamente downregulated en 18 muestras cancerosas de pacientes con cáncer colorrectal. En pacientes con cáncer colorrectal, miR-26b era 2,2 veces mayor en los tejidos normales adyacentes que en los tejidos cancerosos (p & lt; 0,0001). En principio habíamos identificado Nampt como un objetivo de miR-26b por el análisis de la bioinformática, los ensayos de reportero de luciferasa, y el ensayo facción mediante transfección de miR-26 imita o inhibidores. La sobreexpresión de miR-26b mediante transfección de miR-26 imita disminuyó significativamente Nampt mRNA y los niveles de proteína in vitro. Nuestro estudio encontró que imita miR-26b son más eficaces en la apoptosis que en los ensayos de proliferación. Los resultados consistentes con otros estudios que la inhibición de la citotoxicidad Nampt causados general [13]. Desmontables de miR-26b por transfección de los inhibidores de miR-26b aumentó significativamente Nampt mRNA y los niveles de proteína. Esto indica que el miR-26b regula Nampt principalmente a través de la represión de traducción. Mientras tanto, en los resultados de las vías de regulación de miR-26b se asociaron con capacidad de invasión y metástasis en células de cáncer colorrectal. Ma et al. mostró que la sobreexpresión de miR-26b inhibe en el crecimiento del tumor in vivo en ratones inyectados con células LoVo [38]. Además, hemos encontrado que la inhibición de la supervivencia celular y la invasión por la sobreexpresión de miR-26b podría ser parcialmente rescatado por la adición de NAD. Este resultado indica que la inhibición de miR-26b de la supervivencia de células tumorales y la invasión implica la biosíntesis de NAD Nampt mediada. Por lo tanto, nuestros resultados proporcionan una idea de la función de miR-26b en la regulación de la tumorigénesis colorrectal. Además, dado que las funciones Nampt en el metabolismo y la respuesta inmune, miR-26b también pueden afectar a estos procesos mediante la atenuación de la traducción de Nampt. Esto sugiere una explicación mecanicista de la regulación a la baja de miR-26b en ratones diabéticos [39].
Sin embargo, el mecanismo por el que el miR-26b y Nampt regulan la tumorigénesis puede no ser tan simple. Cuando la concentración de NAD + fue máxima eficacia, el rescate no se recuperó completamente. La vía alternativa podría ser posible participación. En primer lugar, los estudios recientes indican que el miR-26b tiene muchos otros objetivos directos, como EphA2 [40], SLC7A11 [32], Lef-1 [41], proteína pRb [42], y la COX-2 [36]. En segundo lugar, los miRNAs distintos de miR-26b podrían dirigir la expresión Nampt. Por ejemplo, miR-182 downregulated expresión Nampt en inducida por Tat del VIH-1 repetición terminal larga (LTR) de transactivación [43]. En tercer lugar, aunque se informó que la regulación de la glucosa estimula la secreción de insulina y mTORC1 y ERK1 /2 vía de señalización están involucrados en la síntesis de NAD salvamento Nampt-media [12], [44], otras vías de señalización que implican Nampt, tales como PI3K /Akt [45] y STAT3 [46], [47], también participan en la formación de tumores, la transformación, y la angiogénesis. En su conjunto, la vía de señalización de miR-26b-Nampt-NAD contribuye a la supervivencia de células de cáncer colorrectal y la invasión, pero no es la única vía.
Conclusión
En resumen, nuestro estudio sugiere presente que miR-26b regula negativamente la expresión Nampt a nivel postranscripcional por unión a su extremo 3 'UTR. Además, miR-26b inhibe el crecimiento del tumor y la invasión, y este efecto fue abrogada parcialmente por la adición de NAD. También se encontró que los niveles de miR-26b en los tejidos tumorales de colon de pacientes eran mucho más bajos que en los tejidos normales adyacentes, y que la expresión de miR-26b inversamente correlacionada con la expresión de mRNA Nampt en líneas celulares de cáncer colorrectal y 5 muestras de pacientes. Estos resultados indican que nuestros resultados son clínicamente relevantes: la sobreexpresión de miR-26b y la inhibición de la vía de señalización Nampt-NAD pueden ser una justificación para las intervenciones terapéuticas en el cáncer colorrectal en el futuro
Apoyo a la Información
Figura S1. .
luciferasa reportero ensayos de validación de la interacción entre el miR-26b y Nampt. A. Construcción del reportero pEZX-MT01 luciferasa (Luc-Nampt 3'-UTR). hLuc, luciérnaga gen indicador de luciferasa; hRLuc, Renilla gen indicador de luciferasa. la expresión de luciferasa de la luciérnaga está regulada por la unión de los genes miARN a la secuencia diana 3'-UTR. Firefly luciferase actividad se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla. B. Diagrama de Nampt con el tipo salvaje y secuencias mutadas en el sitio de unión de miR-26b potencial. C. mapas de secuencia de tipo salvaje y secuencias mutadas Nampt establecidos por la secuenciación de genes
doi:. 10.1371 /journal.pone.0069963.s001 gratis (TIF)