Extracto
El uso de péptidos pequeños o bacteriocinas antimicrobianos, como la nisina, para tratar el cáncer es un nuevo enfoque que representa una gran promesa. La nisina es un ejemplo de este nuevo enfoque, ya que se ha usado de manera segura en los seres humanos durante muchos años como conservante de alimentos, y los estudios de laboratorio recientes apoyan su potencial anti-tumor en el cáncer de cabeza y cuello. Anteriormente, hemos demostrado que la nisina (2,5%, de bajo contenido) tiene un potencial antitumoral en carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC)
in vitro
y
in vivo
. Los estudios actuales exploraron una variante natural de la nisina (ZP nisina; 95%, alto contenido) por sus efectos antitumorales
in vitro
y
in vivo
. La nisina ZP indujo el mayor nivel de apoptosis en las células HNSCC baja en comparación con la nisina contenido. células HNSCC tratados con concentraciones crecientes de nisina ZP exhibieron aumento de los niveles de apoptosis y la disminución de los niveles de proliferación celular, la capacidad de clonogénico, y formación de esferas. La nisina ZP induce apoptosis a través de una vía dependiente de la calpaína en las células HNSCC pero no en los queratinocitos orales humanos. La nisina ZP también indujo la apoptosis dependiente de la dosis en las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) con la consiguiente disminución de la formación de brotes vasculares
in vitro
y la reducción de la densidad microvascular intratumoral
in vivo
. La nisina ZP reduce la tumorigénesis
in vivo
y el tratamiento a largo plazo con una supervivencia prolongada nisina ZP. Además, los ratones tratados con nisina exhiben histología órgano normal, sin evidencia de inflamación, fibrosis o necrosis. En resumen, exposiciones ZP nisina mayores efectos antitumorales que bajo contenido de nisina, y por lo tanto tiene el potencial de servir como un agente terapéutico novedoso para HNSCC
Visto:. Kamarajan P, T Hayami, Matte B, Liu Y, T Danciu , Ramamoorthy A, et al. (2015) La nisina ZP, una bacteriocina y conservante de alimentos, inhibe el cáncer de cabeza y cuello Tumorigénesis y prolonga la supervivencia. PLoS ONE 10 (7): e0131008. doi: 10.1371 /journal.pone.0131008
Editor: Hari K. Koul, Universidad Centro de Ciencias de la Salud del Estado de Louisiana, Estados Unidos |
Recibido: 10 Febrero, 2015; Aceptado: 26-may de 2015; Publicado: 1 de julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Kamarajan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están disponibles dentro del papel y su archivo de información de apoyo
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Universidad de Michigan mCubed Financiación#U036798 a YK, OPF, y AR. BM fue apoyada por la CAPES CNPq de Brasil y patrocinado, Ciencia Sin Fronteras Programa. YL fue apoyada por el Programa de Becarios de la Escuela de la Universidad de Pekín y el Hospital de Estomatología
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) es la sexta causa principal de muerte en todo el mundo. Los pacientes diagnosticados con HNSCC se tratan con cirugía, radioterapia y quimioterapia. Dada su ubicación anatómica, HNSCC resección quirúrgica es a menudo destructivo y, con frecuencia, la eliminación completa de la masa tumoral no es una opción viable, a menudo la prestación de estos pacientes con enfermedad incurable después de los tratamientos con quimioterapia [1]. Hay opciones limitadas para los pacientes de quimioterapia una vez que su enfermedad ya no es susceptible de curar, y las tasas de supervivencia a 5 años para los pacientes con bajos CECC metastásico no han mejorado en las últimas décadas [2,3]. Estos hechos ponen de relieve la urgencia de mejorar las opciones de tratamiento para estos pacientes.
Algunos informes han sugerido que los péptidos antimicrobianos o bacteriocinas tienen efectos citotóxicos contra las células del cáncer [4-8]. Teniendo en cuenta esta premisa interesante, hemos explorado las propiedades citotóxicas y antitumorales del péptido antimicrobiano, nisina, y encontramos que bloquea CECC tumorigénesis [9]. La nisina es un péptido antibacteriano policíclico ácido 34-amino que se produce por la fermentación de la bacteria gram-positiva
Lactococcus lactis
. Muchos agentes antibacterianos son eficaces contra las especies bacterianas similares; sin embargo, la nisina tiene efectos de amplio espectro, ya que también inhibe las bacterias gram-negativas [10]. La nisina no es tóxico para los animales y es seguro para el consumo humano [11]. La nisina fue aprobado para uso humano como conservante de alimentos por la organización mundial de la salud (OMS) en 1969 y por la Food and Drug Administration (FDA) en 1988, y se le ha dado una designación generalmente considerado por uso seguro (GRAS) por la FDA [12]. Se estima que se consumen 0,94 a 2,24 mg de nisina por persona por día en los EE.UU. [12]. Aunque las bacteriocinas, como la nisina, se han utilizado durante décadas en la prevención de crecimiento de las bacterias en los alimentos, sólo recientemente se han probado para la prevención del crecimiento o la inducción de la apoptosis de las células cancerosas. La apoptosis o muerte celular programada es un proceso natural que elimina las células no deseadas o mayores. Sin embargo, las células cancerosas son resistentes a la apoptosis. Por lo tanto, existe un gran esfuerzo para entender los mecanismos que regulan la apoptosis en estas células de modo que nuevos agentes se pueden desarrollar para inducir la apoptosis de las células cancerosas. La nisina puede servir en esta capacidad y el desarrollo de la nisina como agente terapéutico del cáncer puede ser perseguido fácilmente tras las determinaciones de dosificación.
Recientemente, se informó que la nisina, puede servir como un potencial terapéutico novedoso para el tratamiento de CECC [9]. La nisina media estos efectos mediante la inducción de apoptosis preferencial, la detención del ciclo celular, y la reducción de la proliferación celular en células HNSCC, en comparación con los queratinocitos primarios. La nisina también reduce la tumorigénesis HNSCC in vivo. Mecánicamente, la nisina ejerce estos efectos en HNSCC, en parte, a través del regulador de transporte de cationes homólogo 1 (CHAC1), un regulador de transporte de cationes proapoptótico y a través de una afluencia CHAC1 independiente concomitante de calcio extracelular [9,13]. Estos resultados apoyan el uso de la nisina como potencialmente nueva terapéutica para la CECC, y puesto que la nisina es seguro para el consumo humano como conservante de alimentos, su traducción en un entorno clínico puede ser facilitada.
La nisina actúa mediante la alteración de la integridad de la membrana celular y la formación de poros de vida corta, cambiando así el potencial de membrana [14]. La nisina se sumerge en la membrana celular a través de las porciones catiónicos de los aminoácidos que se extienden a un lado de la molécula. Estas porciones catiónicos interactúan con las cabezas de fosfolípidos con carga negativa, mientras que la parte hidrófoba de la nisina interactúa con el núcleo de membrana [15]. La participación de nisina con la membrana, por lo tanto, media la reorganización de fosfolípidos y permite una afluencia de iones [14,16]. Dado que las células HNSCC y queratinocitos primarios difieren en su composición de la membrana de lípidos y la función y la respuesta a los flujos de calcio, la capacidad de la nisina para alterar el potencial de membrana y transmembrana composición de células puede dar lugar a efectos diferenciales sobre estas células [17-22]. De hecho, nuestros datos apoyan esta premisa como base para el diferencial muerte celular apoptótica mediada por nisina y la proliferación reducida de las células en comparación con HNSCC queratinocitos primarios [9].
Dado el papel de la nisina como una bacteriocina seguro para la conservación de alimentos, y el conocimiento de que otras bacteriocinas poseen propiedades proapoptóticos contra las células cancerosas, nuestros resultados sobre los efectos de la nisina sobre ayuda tumorigénesis HNSCC proporcionar una base para la nisina como una novela potencial terapéutico para HNSCC. Por lo tanto, nuestro enfoque en el presente estudio fue extender este conocimiento de base. Anteriormente, se utilizó una formulación al 2,5% de nisina (bajo contenido). En este estudio, nuestro objetivo era poner a prueba la eficacia de un 95% de nisina (alto contenido) sobre la apoptosis y la proliferación celular HNSCC in vitro y en la tumorigénesis in vivo. En concreto, nos centramos en su potencial de traslación mediante el examen de una forma muy pura, de calidad alimentaria de la nisina por su in vivo y efectos a largo plazo. Con este fin, hemos probado dos de origen natural, variantes de alto contenido de nisina, ZP nisina y AP nisina. Teniendo en cuenta la seguridad de la nisina para el consumo humano y dada su in vitro e in vivo la eficacia en HNSCC, la nisina podría desarrollarse como una nueva terapéutica para el cáncer CECC.
Materiales y Métodos
aprobación de la Junta de Revisión Institucional
Este estudio ha sido aprobado y se llevó a cabo de acuerdo con las normas establecidas por la junta de revisión institucional y el comité sobre el uso y cuidado de los animales en la Universidad de Michigan.
cultivo celular
Cuatro líneas celulares HNSCC humanos fueron utilizados para estos estudios. CECC autenticación línea celular y el origen fue proporcionada por sus fuentes y publicado extensamente. Las líneas celulares humanas HNSCC, UM-SCC-17B (supraglotis /tejidos blandos del cuello) y UM-SCC-14A (piso de la boca) fueron proporcionados por el Dr. Thomas Carey (Profesor de la Universidad de Michigan, MI) [23]. La línea celular SCC oral de HSC-3 (lengua) fue proporcionado por el Dr. Randall Kramer (Profesor de la Universidad de California, San Francisco, CA) [24]. La línea celular SCC orales, CCCA-3 (lengua) fue proporcionado por el Dr. Mark Lingen (Profesor de la Universidad de Chicago). células HNSCC se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal, 1% de penicilina y 1% de estreptomicina. Las células normales-humana endoteliales de la vena umbilical (HUVEC), y los medios de comunicación y suplementos (EGM-2 Kits de bala) de cultivo de células que se acompañan se obtuvieron de Lonza (Allendale, Nueva Jersey). VEGF165 recombinante humano se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y Matrigel matriz se obtuvo de BD Biosciences (San Jose, CA). Las HUVEC se cultivaron en EGM-2 medio basal a 37 ° C en 5% de CO
2.
La nisina
La nisina A y nisina Z son dos variantes naturales de nisina que se producen por fermentación de
Lactococcus lactis
y difieren por un único residuo de aminoácido en la posición 27; histidina en la nisina A y asparagina en Z nisina [25]. formas alto contenido de estas dos variantes, ZP nisina y nisina AP (contenido de 95% /ultrapura;% en peso /peso; potencia hidratado ≥38,000 UI /mg) se adquirieron de Handary (Bruselas, Bélgica) y bajo contenido de nisina A (2,5% contenido en cloruro de equilibrio de sodio y sólidos de la leche desnaturalizadas; potencia ≥1,000,000 por UI /g) se adquirió de Sigma-Aldrich (N5764). La nisina ZP y AP y de bajo contenido de nisina se reconstituyeron en agua y se utilizaron para todos los experimentos.
proliferación de células y ensayos de formación de colonias
Para determinar el efecto de la nisina sobre la proliferación celular, la célula CyQUANT NF Ensayo de proliferación kit se utilizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen /Life Technologies, Grand Island, NY). Para los ensayos de formación de colonias, las células 2000 se sembraron en una placa de 6 pocillos. Después de la incubación durante la noche, las células se trataron con diferentes concentraciones de nisina ZP durante 48 horas. Después del tratamiento, por medio fresco se añadió cada 2 días durante un período de 10 días. Las colonias fueron teñidas con 0,5% de cristal violeta y las colonias que contenían & gt; 50 se contaron las células. Los experimentos se repitieron por triplicado.
Orasphere Ensayo
Esfera ensayos se utilizaron para evaluar el crecimiento independiente de anclaje, una propiedad pensado para contribuir al potencial metastásico. oraspheres CECC (UM-SCC-17B) se prepararon como se informó anteriormente [26-29]. En resumen, las células que sobreviven forma de retiro o agregados multicelulares oraspheres de anclaje. Oraspheres fueron desarrollados por el mantenimiento de células en condiciones de suspensión en poli (metacrilato de 2-hidroxietilo) (poli-HEMA) placas revestidas (7,5 mg /ml en etanol al 95%, Sigma-Aldrich) durante 36 horas. Un orasphere se define como un agregado de células que es al menos 50 micras de diámetro. La superficie total ocupada por oraspheres en cada pocillo se cuantificó para cada condición de tratamiento usando el software de imágenes NIS-Elements BR4.13.04. Los experimentos se realizaron por triplicado. La nisina se añadió a cada pocillo en el momento de la siembra celular.
Apoptosis ensayos
Para determinar los efectos de tres formas diferentes de nisina en la apoptosis celular HNSCC se realizaron tres ensayos diferentes. La apoptosis se evaluó en las células tratadas con nisina utilizando un método directo de la tinción, un ensayo de flujo basado en citometría-y un enfoque de transferencia de Western para evaluar las proteínas de señalización de apoptosis conocidos
Apoptosis:. Tinción y microscopía
etidio bromuro y naranja de acridina (EB /AO) tinción se utilizó para medir la apoptosis como se describe anteriormente [30]. Para estos ensayos, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a 2 x 10
4 células /cm
2, y después de 24 horas, se trató con diversas concentraciones de nisina (0, 100, 200, 400 y 800 g /ml) durante 24 horas. Las células fueron teñidas con una tinción de EB /AO. EB se obtuvo de Bio-rad (Berkeley, CA) y AO se obtuvo de Acros Organics (Geel, Bélgica). El reactivo colorante EB /AO se compone de 100μg /ml de bromuro de etidio y 100μg /ml de naranja de acridina en PBS. El tinte EB /AO se añadió a cada pocillo, se quitó, y luego las imágenes de las células teñidas fueron capturados utilizando un microscopio equipado con un sistema de imagen digital (Eclipse 50i Nikon, Melville, NY). Se contaron las células y, en base a su color, se clasifican como de vital importancia, apoptosis o necrosis. AO impregna todas las células y hace que los núcleos aparecen verdes. EB sólo es captada por las células cuando se pierde la integridad de la membrana citoplásmica, y se tiñe el núcleo de forma que aparecen de color rojo. Por lo tanto, las células apoptóticas aparecen temprano verde con puntos verdes brillantes en los núcleos de la condensación de la cromatina y fragmentación nuclear. Fines de células apoptóticas aparecen de color naranja (combinación de colores verde y rojo) con la condensación de la cromatina más significativo y fragmentación nuclear. Las células necróticas aparecen naranja, pero su morfología nuclear se asemeja a la de las células viables, por lo que hay una ausencia de condensación de la cromatina. El porcentaje de células en cada categoría se determinó contando un mínimo de 100 células. Los experimentos se realizaron por triplicado
Apoptosis:. Citometría de flujo
El porcentaje de células apoptóticas inducida por el tratamiento nisina se determinó por citometría de flujo. Brevemente, las células se separaron por incubación con tampón de disociación libre de enzima (Invitrogen), se sedimentaron por centrifugación, y se tiñeron con anexina V (BD Pharmingen) para el análisis por citometría de flujo (clasificador FACSDiVa Cell, Becton Dickinson).
apoptosis: transferencia Western
para evaluar los efectos de ZP nisina en la expresión de proteínas pro-apoptóticas en las células HNSCC, se realizó un análisis de Western blot de las células UM-SCC-17B que fueron tratados con ZP nisina durante 18 horas . Un inhibidor de la calpaína también fue examinado en este contexto por su capacidad para revertir los efectos apoptóticos inducidos por la nisina ZP; es decir, el bloqueo de la escisión de PARP. El inhibidor de calpaína se adquirió de Sigma-Aldrich (a6185, St. Louis, MO), reconstituido en agua, y se utiliza a una concentración de 500 nM. Después de varios tratamientos, se recogieron las células, se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato y se lisaron durante 30 minutos, mientras que en el hielo en el ensayo de radioimmunoprecipitatation (RIPA) tampón (R0278, Sigma-Aldrich) que contenía un cóctel inhibidor de proteasa 1% (P8340, Sigma Aldrich). Los lisados se ajustaron por concentración de proteína con el kit de ensayo de proteína BCA (Bio-Rad, Berkeley, CA). Proteína lisados se resolvieron mediante electroforesis en dodecil de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) y se transfirieron a membranas Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA). Western blot análisis se realizaron con un anti-poli (ADP-ribosa) polimerasa-1 (PARP, SC-7150, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) anticuerpo primario, a-3 caspasa anticuerpo primario (SC-7148, Santa Cruz Biotechnology), un anticuerpo primario calpaína (MAB3083, Millipore) seguido de un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante anti-conejo (SC-2004, Santa Cruz Biotechnology) o anticuerpo anti-ratón (A9044, Sigma-Aldrich). Las transferencias se desarrollaron a continuación, con el sistema de detección ECL-Plus (Pierce). Para evaluar las muestras para la igualdad de la carga de proteínas, membranas fueron despojados y se volvieron a sondar con un anticuerpo anti-β-actina (SC-1615, Santa Cruz Biotechnology).
in vitro Ensayo de angiogénesis
Para determinar el efecto de la ZP nisina sobre la angiogénesis, se realizó en los ensayos de brotes in vitro [31]. Para los ensayos de brotar, HUVECs se tripsinizaron y se suspendió en medio de crecimiento de células endoteliales (EGM-2) que contiene 50 ng /ml de factor de recombinante de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y diversas concentraciones de ZP nisina (0, 100, 400 y 800 mg /ml ). Las células se sembraron a 1 x 10
4 células /cm
2 en Matrigel recubierto de placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche. Las imágenes de los brotes fueron capturados utilizando el Sistema de EVOS XL núcleo formador de imágenes (Life Technologies, Grand Island, NY), entonces longitud total de brotes se midió utilizando la imagen J (National Institutes of Health). Los ensayos se realizaron por triplicado.
Los análisis inmunohistoquímicos
Para evaluar los efectos de la nisina sobre la angiogénesis in vivo, análisis de inmunohistoquímica se utilizaron para evaluar la expresión de CD31, una molécula de adhesión celular endotelial, en secciones de tejidos tumorales de ratón. En pocas palabras, después de la recuperación de antígeno por el pretratamiento de microondas (tampón de citrato, 10 mM, pH 6,0), las diapositivas se incubaron con un anticuerpo primario CD31 (DIA-310, Dianova, Hamburgo, Alemania) durante la noche a 4 ° C. Después de la reacción de cromógeno diaminobencidina (DAB), las diapositivas se counterstained con hematoxilina de rutina. La tinción inmunohistoquímica para CD31 se clasificó y anotó por un patólogo en una forma ciega.
ratón El cáncer oral modelo
Para examinar los efectos antitumorales in vivo de ZP nisina, un cáncer oral piso-de- se utilizó un modelo de ratón boca. Se inyectaron células UM-SCC-17B submucosa en el suelo de la boca en ratones como se describe anteriormente [9, 28, 29, 32]. Todos los protocolos para los estudios in vivo fueron aprobados por el Comité para el Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Michigan. Específicamente, las células fueron cultivadas a 70% de confluencia, se suspendió en DMEM, se mezcla con un volumen igual de crecimiento matriz de membrana basal reducido factor de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) a una concentración final de 1,25 x 10
4 /0,05 ml. Seis semanas de edad, los ratones desnudos atímicos (NCr-nu /nu cepa, NCI, Frederick, MD) fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal con 100 mg /kg de ketamina y 10 mg /kg de xilazina. Un volumen total de 0,05 ml de células SCC /suspensión Matrigel se inyectó por vía submucosa en el piso de la boca. Tres semanas después de las inyecciones de células tumorales y cuando se confirme que se establecieron los tumores, los animales se distribuyeron por igual en seis grupos: un grupo de control que se le dio agua (igual volumen /control) por sonda oral durante 3 semanas y cinco grupos de tratamiento diferentes que se les dio la nisina tratamiento por sonda oral durante 3 semanas. Después de las inyecciones de células tumorales, los ratones fueron controlados en días alternos. Los grupos de tratamiento consistían en los ratones que recibieron ZP nisina a dos concentraciones diferentes (400 y 800 mg /kg por día) y los ratones que recibieron AP nisina a dos concentraciones diferentes (400 y 800 mg /kg por día). Había también otro grupo de ratones que se le dio ZP nisina (800 mg /kg por día) durante un período prolongado de tiempo (meses). Tras la finalización de la administración de la nisina, los ratones fueron sacrificados por CO
2 sobredosis y dislocación cervical, a continuación, se recogieron los tumores, se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), la imagen formada, y se fijaron durante la noche en 10% de formalina tamponada. Se utilizó un calibrador digital para determinar el volumen del tumor utilizando la fórmula
a
x
a
x
b
/2, donde
a
es la más pequeña dimensión. En general, los ratones fueron sacrificados si los ratones mostraron signos fisiológicos del estrés de la incapacidad de comer o beber, pérdida de peso, o cuando los volúmenes tumorales alcanzan un rango de 300-500mm
3, y por lo tanto los ratones fueron sacrificados en general, aproximadamente a las 3 semanas de el protocolo a corto plazo. Los ratones fueron sacrificados por un CO
2 sobredosis.
Análisis estadístico
En general, los valores se expresaron como media ± SD. diferencias intergrupales se analizaron mediante el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey-Kramer HSD. Para los estudios in vivo, se utilizaron pruebas t independientes con varianza desigual.
Resultados
La nisina ZP y nisina AP inducir dependiente de la dosis significativa la apoptosis celular HNSCC y más allá de que en bajo contenido de nisina
El tratamiento con ambos ZP nisina (95%) y AP nisina (95%) inducida por un aumento significativo en la apoptosis en células HNSCC (UM-SCC-17B y HSC-3) en comparación con el tratamiento con bajo nisina contenido (2,5% ) (Fig 1A y 1B). La apoptosis se midió usando bromuro de etidio y naranja de acridina (EB /AO) tinción y microscopía. Los efectos de la ZP nisina y AP sobre la apoptosis eran dependientes de la dosis y aumentaron a medida que las concentraciones de nisina y ZP AP aumentaron 200-400 g /ml. A pesar de las diferencias en la apoptosis entre ZP nisina y la nisina AP no fueron significativas, nisina ZP exhibió una mejor solubilidad, y por lo tanto la mayoría de los experimentos se realizaron con ZP nisina.
A y B Opiniones, Gráficos que muestran los cambios en el porcentaje de células apoptóticas HNSCC (HSC-3 y UM-SCC-17B) tratados con medio de control o medio que contiene 2,5% de nisina, 95% de nisina AP, o 95% ZP nisina para 24 h. Las células fueron teñidas utilizando una naranja de acridina y bromuro de etidio (/AO EB) mancha y se contaron. Las comparaciones entre grupos respecto a los controles se analizaron mediante ANOVA con el nivel de significación establecida en * p & lt; 0,05.
C
, imágenes microscópicas que muestran morphologhy de células HNSCC tratados con medios de control o medios que contienen ZP nisina (100 a 800 mg /ml) durante 24 h después se tiñeron con EB /AO (Barras de escala, 100 m).
DF
, Gráficas que muestran cambios en el porcentaje de células vitales, apoptóticas y necróticas (UM-SCC-17B, HSC-3 y queratinocitos orales normales) tratados con medios de control o medios que contienen ZP nisina (400 o 800 mg /ml) durante 24 h. Las comparaciones entre los grupos respecto a los controles fueron analizados por ANOVA con el nivel de significación establecida en * p & lt; 0,05 células vitales;#P & lt;. 0.05 células apoptóticas
Además, los efectos de la ZP de nisina en la apoptosis celular HNSCC fueron significativas a lo largo de una amplia gama de dosis de 100, 200, 400 y 800 mg /ml (Fig 1C- 1E) y en varias líneas celulares CECC (UM-SCC-17B y HSC-3). Coordinadamente, las células tratadas con dosis crecientes de ZP nisina exhibido disminuyendo significativamente el número de células vitales y significativamente el número de células apoptóticas en aumento, mientras que el número de células necróticas se mantuvo relativamente baja y constante. Por el contrario, los queratinocitos primarios no mostraron mayores niveles de apoptosis como la observada en líneas celulares CECC (figura 1F).
La nisina ZP induce apoptosis a través de la calpaína, la caspasa 8 y PARP
Para más examinar el mecanismo de la apoptosis mediada por la nisina, se emplearon ensayos de apoptosis adicionales y proteínas de señalización de apoptosis conocido encuestados. Cuatro líneas de células HNSCC diferentes se examinaron para su capacidad de respuesta nisina. La nisina se incrementó significativamente la apoptosis en células de todas las líneas de cuatro HNSCC tal como se evaluó mediante tinción con anexina V y citometría de flujo (Figura 2A).
Un
, Gráficas que muestran cambios en el porcentaje de células apoptóticas (UM-SCC 17B, HSC-3, UM-SCC-14A y OSCC-3) tratados con los medios de control o medios que contienen ZP nisina (400 mg /ml) durante 24 h. Las células fueron teñidas con anexina V y la apoptosis se evaluó por citometría de flujo. Las comparaciones entre grupos respecto a los controles se analizaron mediante ANOVA con el nivel de significación establecida en * p & lt; 0,05.
B Opiniones, inmunotransferencias que muestran la calpaína 1, caspasa-8, los niveles de caspasa-3, y de la proteína PARP en CECC (UM-SCC-17B) y
C
, lisados de células normales queratinocitos orales humanos después de tratamiento con ZP nisina para 18 h.
D
, inmunotransferencias que muestran PARP y calpaína 1 de activación en los lisados celulares HNSCC después del tratamiento durante 18 h con los medios de control, medios que contienen ZP nisina (400 mg /ml), medio que contiene un inhibidor de la calpaína (ALLN, 500 nM) o medios que contienen tanto un inhibidor de la calpaína (ALLN, 500 nM) y la nisina (400 mg /ml).
D
, una inmunotransferencia de ß-actina se muestran los controles de carga.
Teniendo en cuenta nuestros resultados anteriores que la nisina media la apoptosis dependiente de calcio, se analizó la posible participación de la calpaína, una conocida mediador dependiente de calcio de la apoptosis [9]. De hecho, las células tratadas HNSCC nisina mostraron una disminución de los niveles de expresión de la calpaína 1 subunidad pequeña, indicativo de la calpaína 1 de activación (Fig 2B). La expresión de la disminución de la calpaína 1 subunidad pequeña refleja las dosis crecientes de ZP nisina de 100 a 400 mg /ml, y por lo tanto era dependiente de la dosis.
Para profundizar en el mecanismo de la apoptosis inducida por la nisina ZP, caspasa -8 y la caspasa-3 división fueron examinados en este contexto. La nisina inducida por la activación de la caspasa-8 de una manera dependiente de la dosis (Fig 2B). Sin embargo, el tratamiento de células con HNSCC ZP nisina inducida caspasa-3 apoptosis independiente (Fig 2B). Western blot para la caspasa-3 en células tratadas ZP nisina reveló niveles estables de la caspasa-3 y la ausencia de expresión de la caspasa-3 escisión independientemente de la dosis de nisina probado (Fig 2B).
células tratadas nisina ZP también exhibió poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) de escisión, un sello de apoptosis (figura 2B). PARP división aumentó de forma dependiente de la dosis como dosis ZP nisina se incrementaron. Para determinar si la escisión de PARP nisina mediada por un mecanismo calpaína dependiente, un inhibidor de la calpaína (ALLN) se examinó en este contexto (Fig 2C). El tratamiento de células con HNSCC tanto nisina ZP y un inhibidor de la calpaína, con eficacia disminuida de escisión de PARP, en comparación con las células tratadas con nisina sola. Normales queratinocitos orales humanos no mostraron activación de la calpaína, caspasa-8, caspasa-3 o PARP en respuesta al tratamiento con ZP nisina (Fig 2D). Por lo tanto la apoptosis, ZP nisina inducida de células HNSCC través de la activación /escisión de la calpaína, caspasa-8 y PARP, pero independiente de la caspasa-3 división.
La nisina ZP y nisina AP reducen significativamente CECC tiempo- la proliferación celular y la dosis -dependently
Los efectos de ZP nisina y AP sobre la proliferación celular HNSCC se examinaron a continuación, y se encontró que el tratamiento con tanto ZP nisina y la proliferación de nisina AP reducido significativamente celular CECC (UM-SCC-17B) (figura 3A ). Los efectos de la ZP nisina y AP sobre la proliferación celular HNSCC eran dependiente de la dosis, ya que los niveles de proliferación disminuyeron a medida que la concentración de nisina y ZP AP aumentaron 4-800 mg /ml. Además, las diferencias en la proliferación celular HNSCC inducidos por nisina frente a ZP nisina tratamiento AP fueron significativas, de manera que los efectos inducidos por nisina ZP fueron más pronunciadas. Por lo tanto, teniendo en cuenta los mayores efectos de ZP nisina en la reducción de la proliferación y dado que la solubilidad mejorada de ZP nisina sobre la nisina AP, la nisina ZP fue seleccionado para su posterior estudio. Los efectos de la ZP nisina sobre la proliferación celular HNSCC fueron significativas a lo largo de una amplia gama de dosis de 100 a 800 mg /ml y en varias líneas celulares HNSCC (Fig 3B). Además, la nisina reducción mediada por ZP en la proliferación celular HNSCC era dependiente del tiempo, que muestra efectos significativos a los 6, 12, 24, y 48 h (Figura 3C). La proliferación celular reducida probablemente refleja, en parte, la detención del ciclo celular mediada por la nisina [9]; además se evidencia por una disminución de la fosforilación del marcador de punto de control, cdc2 (S1 figura).
Un
. Gráficos que muestran cambios en la proliferación celular en las células UM-SCC-17B tratados con los medios de control o medios que contienen AP nisina o ZP (400 o 800 mg /ml) durante 48 h. Las comparaciones entre grupos respecto a los controles se analizaron mediante ANOVA con el nivel de significación establecida en * p & lt; 0,05.#Comparación entre AP nisina y la nisina ZP * p = 0.05.
B Opiniones. Gráficos que muestran cambios en la proliferación celular en las células HNSCC (UM-SCC-17B, HSC-3 y UM-SCC-14A) tratados con los medios de control o medios que contienen dosis crecientes de ZP nisina (100 a 800 mg /ml) durante 48 h. Las comparaciones entre grupos respecto a los controles se analizaron mediante ANOVA con el nivel de significación establecida en * p & lt; 0,05. ¶Comparison entre la 100 mg /ml grupo en relación con el control para células UM-SCC-17B * pμ0.05.
C
. Gráficos que muestran cambios en la proliferación celular en las células UM-SCC-17B tratados con los medios de control o medios que contienen ZP nisina (400 mg /ml) durante 6, 12, 24 y 48 h. Las comparaciones entre grupos respecto a los controles se analizaron mediante ANOVA con el nivel de significación establecida en * p & lt; 0,05.
D
, las imágenes son de células UM-SCC-17B tratadas durante 48 horas con los medios de control o medios que contienen ZP nisina (400 o 800 mg /ml) y después se cultivaron durante 10 días, se tiñeron con cristal violeta y la imagen de evaluar la capacidad clonogénico.
E
, el gráfico muestra el porcentaje de colonias presentes en relación con los controles para los ensayos que miden la capacidad clonogénico. Las comparaciones entre grupos respecto a los controles se analizaron mediante ANOVA con el nivel de significación establecida en * p & lt; 0,05.
F
. Gráficos que muestran los cambios en la proliferación celular en los queratinocitos orales humanos normales tratados con los medios de control o medios que contienen ZP nisina (100, 200, 400 o 800 mg /ml) durante 48 h. Las comparaciones entre los grupos respecto a los controles fueron analizados por ANOVA con el nivel de significación de p *. & Lt; 0,05
La nisina ZP reduce la formación de colonias de células CECC
Además, exploramos los efectos de ZP nisina sobre la proliferación celular mediante la medición de sus efectos a largo plazo usando ensayos de formación de colonias. De acuerdo con los ensayos de proliferación a corto plazo, el tratamiento con la formación de colonias inhibido ZP nisina en las células CECC (Figura 3D y 3E). Los efectos inhibidores sobre la formación de colonias eran dependiente de la dosis, ya que la formación de colonias disminuyó significativamente a medida que la dosis ZP nisina aumento de 400 a 800 mg /ml. células HNSCC tratados con estas dos dosis mostraron una disminución 2 y 50 veces en la capacidad clonogénico. La nisina no inhibió la proliferación en los queratinocitos orales humanos normales como en células que CECC (Figura 3F).
nisina ZP bloques orasphere formación
Estamos, además, que el tratamiento con ZP nisina bloqueó significativamente la formación o orasphere crecimiento independiente de anclaje (Fig 4A y 4B). Orasphere la formación o crecimiento independiente del anclaje es una característica que contribuye al potencial tumorigénico. efectos de la nisina ZP en orasphere formación dependían de la dosis, de tal manera que el área orasphere total disminuyó de manera constante después del tratamiento con dosis de nisina de 100, 200, 400 y 800 mg /ml.
Un
, Fase contrastar imágenes y
B Opiniones, gráfico que muestra el porcentaje de inhibición orasphere (área total) en las células CECC (UM-SCC-17B) cultiva en condiciones de suspensión y se trató con medios de control o un medio que contiene nisina ZP (100 a 800 mg /ml) durante 36 h. Las comparaciones entre los grupos respecto a los controles fueron analizados por ANOVA con el nivel de significación de p *. & Lt; 0,05
La nisina ZP induce la apoptosis de las células endoteliales e inhibe la germinación angiogénico
Nos mostró anteriormente que el tratamiento con bajo contenido de nisina inhibe el crecimiento del tumor y resultó en tumores pequeños pálidos, lo que sugiere que la nisina afectado el suministro de sangre del tumor. También se informó anteriormente de que los efectos antitumorales de la nisina se mediada por CHAC1, un inductor proapoptótico en células endoteliales [9].