Extracto
Antecedentes
La metilación de las islas CpG de ADN del genoma y los residuos de lisina de las histonas H3 y H4 colas regula la transcripción de genes. La inhibición de la síntesis de poliaminas por la ornitina descarboxilasa antizyme-1 (OAZ) en línea celular de cáncer oral humana resultó en la acumulación de descarboxilado
S-
adenosilmetionina (dcSAM), que actúa como un inhibidor competitivo de reacciones de metilación. Se anticipó que la acumulación de dcSAM reacciones de metilación alterada y dio como resultado la hipometilación del ADN y las histonas colas del genoma.
Metodología /Principales conclusiones
estado de metilación global del genoma de ADN y lisina residuos de la histona H3 y H4 colas se ensayaron por metilación con el método isoschizomers (Miami) y transferencia Western, respectivamente, en presencia o ausencia de expresión OAZ. La expresión ectópica de OAZ hipometilación mediada de las islas CpG de ADN del genoma y la histona H3 lisina 9 dimethylation (H3K9me2). nivel de proteínas de ADN metiltransferasa 3B (DNMT3B) y la histona metiltransferasa H3K9me específica G9a se redujeron regulado en OAZ transfectante.
Conclusiones /Importancia
OAZ inducida hipometilación de las islas CpG de ADN del genoma global y H3K9me2 DNMT3B por abajo de la regulación y el nivel de proteína G9a. La hipometilación de las islas CpG de ADN del genoma y la histona H3K9me2 es un potente mecanismo de inducción de los genes relacionados con la supresión de tumores y reparación de roturas de doble cadena de ADN
Visto:. Yamamoto D, K Shima, Matsuo K, T Nishioka, Chen CY, Hu Gf, et al. (2010) La ornitina descarboxilasa antizyme Induce Hipometilación de ADN del genoma y la histona H3 lisina 9 dimethylation (H3K9me2) en la línea celular de cáncer oral humana. PLoS ONE 5 (9): e12554. doi: 10.1371 /journal.pone.0012554
Editor: Shuang-Yong Xu, New England Biolabs, Inc, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Mayo 2010; Aceptado: 31 de julio de 2010; Publicado: 3 Septiembre 2010
Derechos de Autor © 2010 Yamamoto et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Institutos Nacionales de la Salud (Instituto Nacional del cáncer) Beca de Investigación RO1-CA10044 para Takanori Tsuji. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ornitina descarboxilasa (ODC; EC4.1.1.17) es la primera y limitante de la velocidad de la enzima clave para la biosíntesis de poliaminas por catalizar partir de L-ornitina a putrescina [1] y está implicado en la proliferación celular y la diferenciación [2 ]. La ornitina descarboxilasa antizyme subfamilia consta de tres miembros antizyme relacionadas y molécula inhibidora de la ornitina descarboxilasa antizyme-1 (OAZ) se descubrió primero y se identificó como un ornitina descarboxilasa (ODC) mediante la estimulación de la degradación de la proteína ODC [3], [4]. OAZ se sabe que se unen diversas proteínas y mediar la degradación o la estabilización de las proteínas diana. Estas proteínas incluyen ODC [5], antizyme inhibidor de [6], ciclina D1 [7], [8] y HPV16 E2 [9]. Como se muestra en la Fig. 1, la inhibición de la actividad de la ODC y la síntesis de poliaminas posterior por OAZ [10] o compuesto químico, α-difluorometilornitina (DFMO) [5] resultó en la acumulación de dcSAM. dcSAM sirve como un donador de aminopropil para la síntesis de poliaminas, pero que actúa como un inhibidor competitivo de la S-adenosilmetionina, prácticamente en todas las reacciones de metilación, incluyendo ADN, ARN, lípidos y proteínas [5], [11]. La expresión ectópica de OAZ en células de cáncer oral, hámster inducida hipometilación global, y transactivated los genes relacionados con la supresión de tumores y la diferenciación epitelial [10]. Posteriormente, se ha perfilado los genes inducidos o hasta reguladas en las células de cáncer oral por humanos OAZ, y encontramos la inducción de genes relacionados con el ADN de doble capítulo romper la reparación por no homóloga fin unirse mecanismo [10].
ODC es una enzima clave de la síntesis de poliaminas por catalizar partir de L-ornitina a putrescina. OAZ es una molécula inhibidora de la actividad de ODC por la mediación de la degradación de la proteína de ODC. SAM sirve como un donante de metilo en reacciones de metilación, así como precursor de la producción dcSAM. dcSAM es un donante de aminopropil de la biosíntesis de poliaminas, pero que también actúa como un inhibidor competitivo de SAM prácticamente en todas las reacciones de metilación. La inhibición de la actividad de la ODC conduce al agotamiento y la acumulación de poliaminas dcSAM, que inhibe las reacciones de metilación.
metilación del ADN de las islas CpG y la modificación de histonas, en particular metilación y acetilación de residuos de lisina de la histona colas están estrechamente correlacionada para regular la expresion genica. acetilación de la histona está generalmente correlacionada con la activación transcripcional pero metilación de histonas regula la activación o represión transcripcional dependiendo del sitio de la lisina metilación [12]. metilación de las histonas lisina se produce en seis residuos de lisina de las colas de las histonas H3 (K4, K9, K27, K36, K79) y H4 (K20) [13], [14]. Cada una de estas lisinas puede ser mono-, di- o trimetilada [13]. La metilación de H3K4, H3K36 y H3K79 se asoció principalmente con la activación transcripcional mientras que la metilación de H3K9, H3K27 y H4K20 se produce principalmente en asociación con el silenciamiento transcripcional [15], [16]. La relación de interdependencia entre la metilación del ADN y metilación de las histonas es uno de los temas de interés en la regulación de genes. H3K9 metilación y la metilación del ADN están estrechamente asociados en la heterocromatina y reprimidos transcripcionalmente euchromatic regiones. evidencias crecientes dio a conocer que la citosina metilación del ADN coexiste con la metilación H3K9 represiva porque metiltransferasas de ADN, proteínas metil-CpG vinculante (MECP2), y protein1 heterocromatina (HP1) reclutan H3K9 metiltransferasa específica para la metilación de residuos de histonas lisina [17] - [19]. Este mecanismo se invierte en algunos sistemas [20]. H3K9 metilación es un requisito previo para la metilación del ADN [21] - [24]. Nuestra hipótesis es que la acumulación de dcSAM por la expresión ectópica OAZ conduce a la hipometilación del ADN del genoma y colas de las histonas y la hipometilación del ADN del genoma y colas de las histonas la expresión o de transactivates los genes implicados en el ADN de doble filamento romper la reparación. Los datos genómicos sirven como una base para entender la interrelación entre el factor de transcripción y vías basado cromatina. En el presente estudio, hemos examinado y verificado OAZ mediada hipometilación global del ADN del genoma y las histonas H3 y H4 colas.
Resultados
actividad de la ODC
OAZ proteína promueve la degradación de ornitina descarboxilasa (ODC), la proteína y la reducción de la actividad enzimática ODC. Para examinar si la proteína OAZ transcrito y traducido del transfectante OAZ (UM1 PMT /CB6
+ HuFSAZ-peso) es una proteína biológicamente activa, se realizó el ensayo de actividad de la enzima ODC como se describe anteriormente [10]. La actividad ODC en el transfectante OAZ con ZnSO
4 de tratamiento de la actividad de la enzima ODC exhibido reducida (1629,0 ± 61,7 /picomoles CO
2 por hora por miligramo de proteína) por 72,6% en comparación con la de la transfectante simulado vector (UM 1pMT /CB6
+) tratados con ZnSO
4 (5930,0 ± 110,7 /picomoles CO
2 por hora por miligramo de proteína) (p & lt; 0,05). La actividad de la ODC en el transfectante OAZ sin ZnSO
4 de tratamiento disminuyó (4944.1 ± 414,6 /picomoles de CO
2 por hora por miligramo de proteína) en un 30,3% en comparación con la del transfectante de vectores maqueta sin ZnSO
4 tratamientos (7084.7 ± 284.1 /picomoles de CO
2 por hora por miligramo de proteína) (Fig. 2). Esto es probablemente debido a la fuga de la expresión génica inducida por la cantidad de trazas de Zn
2 + suplementado en el medio de cultivo. La reducción de la actividad de la ODC en el transfectante OAZ confirmó que la proteína inducida por OAZ ZnSO
4 de tratamiento era la proteína biológicamente funcional.
actividad ODC (picomoles de CO
2 por hora por miligramo de proteína) de la de los padres UM1, se midió el transfectante vectores maqueta y transfectante OAZ con y sin ZnSO
4 tratamiento. Se realizó la cuantificación por triplicado. los valores de actividad de ODC corregidos se obtuvieron restando el valor para el blanco. actividad de la ODC de OAZ transfectante sin ZnSO
4 el tratamiento fue suprimida debido a trazas de fugas ZnSO
4 en medio de cultivo de la expresión génica causada OAZ.
nivel intracelular de poliaminas y metabolitos
Se anticipó que la reducción de la actividad enzimática ODC condujo a la disminución de la piscina poliamina y la posterior alteración de nivel intracelular de metabolitos de poliamina. Hemos cuantificado intracelular ODC, poliaminas y metabolitos nivel mediante análisis por HPLC como se describe anteriormente [5]. La expresión ectópica de OAZ el regulado el nivel de proteína de la ODC 51ng /10
6 células a 8,4 ng /10
6 células. Como se preveía, los niveles de poliaminas disminuyeron dramáticamente como resultado de la supresión de la actividad de la ODC. nivel de putrescina disminuyó de 9 ng /10
6 células a 1,3 ng /10
6 células. espermidina nivel disminuyó de 15,1 ng /10
6 células a 0,2 ng /10
6 células. nivel de espermina se redujo de 72,8 ng /10
6 células a 1,0 ng /10
6 células (Fig. 3A). S-adenosilmetionina (SAM), que es un donante de metilo para todas las reacciones de metilación, era bastante constante a través de los experimentos. La cantidad intracelular de SAM fue de 17.8 ng /10
6 células en el transfectante OAZ y 14,3 ng /10
6 células en el transfectante vector de simulacro. El nivel intracelular de dcSAM en el transfectante de control de vectores maqueta fue de 1,22 ng /10
6 células pero aumentó drásticamente a 87,9 ng /10
6 células en el transfectante OAZ. El nivel intracelular de S-adenosylhomocystein (SAH) también aumentó de 0,66 ng /10
6 células a 3,76 ng /10
6 células (Fig. 3B).
piscina de poliaminas se agotan (A ) pero dcSAM y SAH, que eran inhibidores potenciales de reacciones de metilación, el aumento de (B) en el transfectante OAZ tratados con ZnSO
4. nivel celular de la SAM fue constante a través de los experimentos (B).
estado de metilación de ADN del genoma
Como ya hemos publicado, expresión ectópica de OAZ en el hámster queratinocitos orales malignas inducidas hipometilación mundial de sitios CCGG del genoma de ADN [10]. En el presente estudio, se examinó si la misma hipometilación fue inducida por la OAZ humana en la línea celular de cáncer oral humana. El nivel de citosinas metiladas en sitios CCGG se cuantificó midiendo la radiactividad dentro de los dos puntos principales, 5 '[
32P] dCMP y 5' [
32P] dm
5CMP por recuento de centelleo líquido. El resultado de la cuantificación se muestra en la Fig. 4 como porcentaje del dm
5CMP. El transfectante OAZ con y sin tratamiento ZnSO
4 exhibió que 26,0% y 40,6% de las secuencias eran CCGG metilado, respectivamente. Las células UM1 parentales con y sin ZnSO
4 tratamiento, y el transfectante vectores maqueta con y sin ZnSO
4 tratamiento exhibió un 48,7% y un 50,2%, y el 40,4% y el 40,9% de la citosina interna fue metilado, respectivamente. Este resultado indica la expresión ectópica de OAZ se asocia con la desmetilación del ADN de todo el genoma en la línea celular de cáncer oral humana. El ADN genómico de la transfectante OAZ es de aproximadamente 60% menos metilado que la del transfectante vector mock.
nivel de metilación global de 5'-metil-CMP (dm5'dCMP) y 5'dCMP en el ADN del genoma de la UM1 células parentales, el vector maqueta y transfectante OAZ se midió por recuento de centelleo.
32P marcado dm
5CMP y CMP fueron producidos por escisión de los respectivos ADN del genoma con las enzimas de restricción
Msp
y su isoesquizómero sensible metilación
Hpa
II y eran separados en una cromatografía en capa fina.
estado de metilación de las histonas H3 y H4 colas
estado de metilación de los residuos de lisina de las histonas H3 y H4 colas enlaces a formación de eucromatina transactivo o transrepressive heterocromatina dependiendo de metilación sitio. El agotamiento de la piscina de poliaminas por OAZ condujo a la acumulación de dcSAM, que actúa como inhibidor competitivo de la SAM en las reacciones de metilación. Se anticipó acumulación de dcSAM mediada hipometilación global del residuos de lisina de las histonas H3 y H4 colas. Como el primer criterio de selección para explorar una posible relación entre la acumulación de dcSAM y alteración del estado de metilación de las histonas mundial, se analizaron los cambios globales en el estado de metilación de H3 y H4 histne por el Western Blot. Se utilizaron anticuerpos contra Dieciséis mono-, di- y tri-metilación de residuos de lisina específicos de la histona H3 y H4. Hemos podido observar una disminución significativa en el nivel global de la histona H3 Lys-9 dimethylation (H3K9me2), H3K27me1, H3K27me2, un H3K27me3 41,6, 14,3, 16,4 y 17,5%, respectivamente, en el transfectante OAZ (Fig. 5A y B). La intensidad de señal de la histona H3 fue constante entre todas las muestras cargadas. Por el contrario, otros doce anticuerpos para las histonas H3 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3, H3K9me1, H3K9me3, H3K36me1, H3K36me2, H3K36me3, H3K79me2) y H4 (H4K20me1, H4K20me2, H4K20me3) no mostraron ninguna diferencia significativa entre el transfectante OAZ y la maqueta vector transfectante (Fig. 5A y B). Di-metilación de la histona H3K9 es una marca de la heterocromatina constitutiva y la represión de genes. La hipometilación de H3K9me2 representa un cambio de estado de la cromatina de heterocromatina que eucromatina, lo que significa también la actividad transcripcional de los genes cambios de estado represivo a estado activo. Esta desmetilación de H3K9me2 por OAZ especula activación de los genes relacionados con la diferenciación [10] y el ADN de doble filamento romper la reparación [25].
hipometilación significativa de H3K9me2 se muestra en el transfectante OAZ tratados con ZnSO
4 . estado de metilación de otros residuos de lisina de la histona H3 y H4 colas no se alteró. Histona H3 y H4 proteínas (17 kDa y 10 kDa, respectivamente) también se transfirió a la misma membrana después de quitar para controlar la misma cantidad de carga de proteína en cada carril. Sólo mostramos H3K9, H3K27 y H4K20 resultados debido a la metilación de estas colas de histonas funciona como represor transcripcional (A). El valor denota la intensidad relativa de las bandas de proteínas histonas metiladas de los transfectantes Oaz a la de los transfectantes del vector simuladas después de ser normalizada a las bandas PAN H3 y H4. La intensidad del control (transfectante vectores maqueta sin ZnSO
4 tratamiento) se consideró como 100 y otras señales se expresaron como valor relativo (B).
El nivel de expresión de DNMTs y G9a
Se examinó en primer lugar si OAZ altera el nivel de expresión de ARNm de DNMTs y G9a de QRT-PCR. Convencional RT-PCR se realizó antes de la qRT-PCR para confirmar que el conjunto de cebadores fue capaz de amplificar solo amplicón. Se confirmó estos cebadores de PCR podrían amplificar una sola banda crujiente después de 35 ciclos de reacción de PCR (datos no mostrados). Las posteriores QRT-PCR resultados revelaron que la expresión OAZ o ZnSO
4 tratamiento no afectó el nivel de expresión de DNMT1, 3A, 3B y ARNm G9a (p & lt; 0,01) (Fig. 6). OAZ mediada hipometilación global del ADN del genoma y la histona H3K9me2. DNMTs 1, 3A, 3B y /GLP complejo histona Metiltrasferasa G9a están implicados en la metilación del ADN del genoma y la histona H3K9me2, respectivamente. La hipótesis de que la hipometilación de las colas de la histona era uno de los objetivos pleiotrópicos de hipometilación mediada por dcSAM, y todas las lisinas metiladas de colas de las histonas se hypomethylated pero de hecho, sólo se H3K9me2 hypomethylated. Este resultado inesperado nos llevó a examinar el nivel de proteínas de DNMTs y G9a. La metilación de H3K9 el mamífero es catalizada por G9a /GLP complejo histona metiltransferasa. Los análisis de Western blot reveló el nivel de proteínas de DNMT3B (Fig. 7) y G9a (Fig. 8) fue significativamente las reguladas pero el nivel de proteína de DNMT1 y 3A no fue alterada en el transfectante OAZ. Este resultado indica que la hipometilación global del ADN del genoma y las colas de la histona es causada por no sólo por un efecto pleiotrópico de dcSAM pero de manera específica trabaja para hipometilar colas de ADN del genoma y las histonas
.
nivel de expresión de estos ARNm no se alteró por OAZ. El resultado de la PCR se normalizó usando la señal de beta-actina. Señal del mando (transfectante vectores maqueta sin ZnSO
4 tratamiento) se consideró como 100 y otras señales se expresaron como valor relativo.
Los extractos nucleares se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos anti-DNMTs. el nivel de proteína de DNMT1 (183 kDa) y DNMT3A (101 kDa) era constante, pero el nivel de proteína de DNMT3B (110 kDa) se redujo significativamente en el transfectante OAZ tratados con ZnSO
4. Las bandas fain aparecieron en el DNMT3A y borrones DNMT3B son isoformas de DNMT3A y 3B. Oct-1 (89 kDa) se utiliza para controlar la cantidad igual de carga de proteína en cada carril.
Los extractos nucleares se sometieron a inmunotransferencia con el anticuerpo anti-G9a. La expresión de la proteína G9a (140 kDa) se redujo en el transfectante OAZ tratados con ZnSO
4.
actividad enzimática DNMT
Se utilizó poli (de-dC) poli ( dI-dC) como sustrato para el ensayo de actividad enzimática DNMT. actividad de la enzima DNMT se determinó midiendo la incorporación de la etiqueta en poli sustrato (dI-dC) de poli (dI-dC). poli metilo (dI-dC) de poli (dI-dC) producción fue suprimida por ~ 65% en el transfectante OAZ con ZnSO
4 de tratamiento en comparación con los del transfectante de control y el transfectante OAZ sin ZnSO
4 de tratamiento ( P & lt; 0,01) (Fig 9).. Este resultado reveló que la disminución de la proteína DNMT3B suprime la parte de la actividad total DNMT y esta disminución de la actividad DNMT se correlaciona con la baja regulación de la proteína DNMT3B por OAZ.
Se realizó ensayo de la actividad total DNMT. DNMT actividad se redujo en un ~ 65% en el transfectante OAZ tratados con ZnSO
4. Este resultado se correlaciona con el resultado de transferencia Western de DNMT3B.
Discusión
Nos han informado de que la expresión ectópica de OAZ en las células cancerosas orales hámster dio como resultado la hipometilación global del genoma de ADN [10 ] e inducida o hasta reguladas expresión de los genes relacionados con el ADN de doble filamento romper la reparación de las células de cáncer oral humana [25]. metilación aberrante de islas CpG en la región promotora inactiva transcripción de genes [26] - [28]. Las modificaciones covalentes de las histonas colas también juegan un papel importante en la transcripción, la replicación del ADN, romper la reparación del ADN y la condensación de la cromatina en la mitosis [29]. Entre estas modificaciones de las histonas, metilación y acetilación de la histona colas están involucrados en la regulación de la transcripción de genes [30], [31]. En el presente estudio, se analizó el estado de metilación de ADN mundial de los residuos de lisina y el genoma de las colas de las histonas en células de cáncer orales humanos en la ausencia o presencia de la expresión OAZ. La inhibición de la síntesis de poliaminas por OAZ acumula anormalmente alto nivel de dcSAM, que actúa como un inhibidor competitivo de
S- adenosilmetionina
prácticamente en todas las reacciones de metilación. Predijimos acumulación de hipometilación inducida dcSAM de los residuos de cisteína de las islas CpG y alterados marcas de metilación de residuos de lisina de la histona colas. residuos de citosina de sitios CCGG en el genoma de ADN fueron hypomethylated globalmente como se había anticipado, pero sólo se H3K9me2 hypomethylated entre los residuos de lisina methylable de colas de las histonas. Estos resultados nos llevó a examinar el nivel de proteínas de ADN metiltransferasas (DNMTs) y G9a metiltransferasa H3K9me2-específica. Nuestros resultados mostraron Western Blot nivel de proteína de DNMT3B y G9a se había reducido regulado en los transfectantes Oaz. los patrones de metilación del ADN se establecen y mantienen mediante la coordinación de las metiltransferasas de ADN, DNMT1, DNMT3A y DNMT3B. DNMT1 persigue mantenimiento de patrón de metilación después de la replicación de ADN, mientras que DNMT3A y DNMT3B son principalmente responsables de la metilación de novo [32] y el mantenimiento de la metilación en ciertas regiones del genoma de ADN durante la embriogénesis y el desarrollo [33]. el agotamiento DNMT3B en líneas celulares de cáncer humano reactivó la expresión de genes silenciados metilación, pero no indujo desmetilación global por satélite o juxtacentromeric [34]. El agotamiento de DNMT3B por OAZ podría promover la desmetilación del ADN específica de secuencia e inducida o regulada hasta la expresión de genes relacionados con la reparación de roturas de ADN, pero la acumulación de dcSAM también contribuyó al azar, desmetilación del ADN global.
G9a histona metiltransferasa , que methylates única H3K9 histonas, también es un jugador importante del silenciamiento de los genes [35] y es esencial para la embriogénesis temprana para regular la expresión de genes de desarrollo [36]. La metilación de H3K9me2 mediada por G9a altera la estructura de la cromatina de eucromatina a heterocromatina relajado compacto y reprime un número de expresión de genes [36] - [38]. La metilación de H3K9 se ha conocido asociar con la hipermetilación de las islas CpG del promotor en las células del cáncer [39], [40]. la metilación del ADN y la metilación H3K9 estrechamente cooperan para regular la expresión génica. H3K9 metilación es un requisito previo para la metilación del ADN [21] - [23] y la metilación H3K9 se requiere para la metilación del ADN [22], [23]. G9a metilación del ADN mediada no requiere su actividad catalítica [41], lo que sugiere que puede tener funciones adicionales en la dirección de la metilación del ADN, tales como el reclutamiento de DNMTs [42]. proteína G9a se une a DNMT1 y conduce a una mayor ADN y las histonas metilación [43]. proteína G9a también recluta y se une a las proteínas y DNMT3A DNMT3B a través de su ankyrin (ANK) de dominio [44], y los ubica a los sitios de la replicación del ADN. H3K9me2 juega un papel igualmente importante en el silenciamiento de genes en eucromatina y posterior metilación de novo de ADN de genes de línea embrionarias y germinales durante el desarrollo normal [41], y es necesario para el mantenimiento de la metilación del ADN en retrotransposones endógenos, loci impreso, y otros genes en diferenciada las células [45]. Li et al y Deng et al informaron de la inhibición de la metilación del ADN del genoma global con 5-Aza-2 'desoxicitidina (5-Aza-CdR) disminuyó la expresión de la proteína de DNMT1 y DNMT3B [46], [47]. Wozniak et al informaron de que el tratamiento con 5-Aza-CdR hypomethylated H3K9me2 mundial en células de cáncer de mama humano por nivel de proteína G9a abajo de la regulación [48]. Estos datos sugieren que la desmetilación del ADN puede ser una señal que dirige la desmetilación de H3K9 durante la replicación del ADN.
Es un resultado extraño que la acumulación de dcSAM no alteró estado de metilación de residuos de lisina de la histona colas distintas de H3K9me2 porque inhibición de la metilación por dcSAM parece un efecto pleiotrópico. Los factores de transcripción también tienen efectos pleiotrópicos, pero su actividad está estrechamente regulada por elementos cis y trans-actuando para regular la expresión génica en tejido-, etapa- de desarrollo, y de manera específica de la enfermedad. Creemos que la inhibición de la metilación por dcSAM no es forma pleiotrópicos pero también está regulada por elementos cis y tras-de actuación adicionales en los sitios diana específicos de los genes y las colas de las histonas. El mecanismo molecular preciso que subyace a la baja regulación de proteínas y DNMT3B G9A por OAZ sigue siendo difícil de alcanzar. Se propone un mecanismo molecular potente que la proteína OAZ directa o indirectamente se une a DNMT3B y /o proteínas G9a y promueve su degradación. proteína OAZ se ha conocido para unirse a diversas proteínas y promueve su degradación [7] - [9], [49] - [51]. La corriente de nuestro resultado pone de relieve la compleja relación de metilación de las histonas y la susceptibilidad a la metilación del ADN. Estas evidencias sugieren que la expresión de genes relacionados con la reparación del ADN [25] puede ser activado por la desmetilación de las islas CpG y H3K9me2 dentro de las regiones reguladoras.
Materiales y Métodos
Cultivo celular
línea humana por vía oral de células cancerosas, UM1 [52] y el OAZ transfectante inducible por zinc (pMT /CB6
+ HuFSAZ-peso) y el transfectante simulacro de vector (UM1 pMT /CB6
+) se cultivaron como descrito anteriormente [25]. La expresión del gen de OAZ PMT /CB6
+ HuFSAZ-peso fue inducida por 100 M ZnSO
4 de tratamiento y se recogieron las muestras de proteínas después de una semana de tratamiento ZnSO
4.
la actividad de ODC ensayo
Para comprobar si la proteína OAZ traducido del transfectante OAZ era biológicamente activa de proteínas en las células U1, se ensayó la actividad enzimática ODC como se describe anteriormente [10]. En pocas palabras, la actividad de la ODC se cuantificó la liberación de [
14C] CO
2 durante la conversión catalizada por la ODC de L-ornitina a putrescina. La mezcla de reacción contenía 50 l de lisado de células preparados a partir del transfectante OAZ y transfectante vector mock con y sin ZnSO 4 de tratamiento, 75 l de 100 mM de glicil-glicina (pH 7,2), 0,2 mM de fosfato de piridoxal, ditiotreitol
4 mM , 0,4 mM de L-ornitina, y 0,25 Ci [
14C] l-ornitina. Las reacciones se llevaron a cabo a 37 ° C durante 2 horas y se terminó por calentamiento a 85 ° C durante 5 min. [
14C] CO
2 fue atrapado con papel de filtro Whatman de 3 mm manchado ingenio 10 l de 10% p /v de KOH y se cuantifica por contador de centelleo. Se realizaron ensayos por triplicado. muestra de control fue el blanco que contiene tampón de lisis en lugar del sobrenadante. los valores de actividad de ODC corregidos se obtuvieron restando los valores de blanco y se declararon como picomoles de CO
2 por hora por miligramo de proteína. El análisis estadístico se realizó mediante el análisis de ANOVA Uno de los factores.
HPLC análisis
cantidad intracelular de la ODC, poliaminas, SAM, dcSAM y HSA (S-adenosylhomecysteine) se cuantificó mediante análisis por HPLC de fase inversa . Los lisados celulares enteros del transfectante OAZ y la transfectat vector mock con y sin ZnSO
4 de tratamiento se prepararon en ácido perclórico 0,2 M. Los lisados celulares se centrifugaron a 13.000 X g durante 10 min y los sobrenadantes se sometieron a análisis de HPLC de fase inversa en una columna Supercosil LC-18-DB (4,6 × 250 mm, 5 micras de tamaño de poro) equilibrada con 0,2% de trietilamina-fosfórico ácido (pH 4,0). La elución se consiguió con 20 min de gradiente lineal desde 0 hasta 10% de acetonitrilo. Las partes alícuotas se sometieron a separación cromatográfica. Las normas para la ODC, poliaminas, SAM y SAH se adquirieron de Sigma-Aldrich. El estándar para dcSAM fue una especie de regalo del Dr. Keijiro Samejima de la Universidad Josai en Japón.
Western blot de las colas de la histona metil-
El estado de metilación de cada colas de las histonas se verificó por Western Blot . Las muestras PROTIN para análisis de Western blot de las colas de las histonas se prepararon añadiendo directamente 500 l de tampón SDS-Laemmli muestra de 100 mm en la placa de cultivo y las células fueron cosechadas por desguace con un policía de goma. Las células recogidas se hirvieron durante 15 minutos en el tampón de muestra y se centrifugan a 16.000 X g durante 30 minutos. La cantidad de proteína se estima por el número celular del cultivo replicado. Las proteínas extraídas equivalentes a 1 × 10
5 - 5 × 10
5 células fueron cargadas y separadas en 15% de gel de SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de PVDF, se bloquearon con 5% de leche en tampón TBS-T y borró con cada anticuerpo a una dilución recomendada por los fabricantes. Las señales fueron desarrollados con Pierce SuperSignal® West Pico Substrato quimioluminiscente y autografiados en la película. Para eliminar posibles artefacto causado por el zinc, repetimos los mismos experimentos usando los tarsnfectants-hOAZ PCI-neo (PCI-neo-hOAZ-UM1). Los anticuerpos utilizados en este estudio se adquirieron de Upstate Biotechnology. Los anticuerpos y sus números de catálogo son; H3 pan-histona (07-690), H4 pan-histona (05-858), H3K4me1 (07-436), H3K4me2 (07-030), H3K4me3 (07-473), H3K9me1 (07-450), H3K9me2 ( 07-441), H3K9me3 (07-442), H3K27me1 (07-448), H3K27me2 (07-452), H3K27me3 (05-851), H3K36me1 (05-800), H3K36me2 (07-369), H3K36me3 (05 -801), H3K79me2 (05-835), H4K20me1 (05-735), H4K20me2 (07-367), H4K20me3 (07-463). Los anticuerpos secundarios utilizados eran de cabra marcado con HRP anti-IgG de ratón (PerkinElmer, NEF822001EA) y de cabra marcado con HRP IgG anti-conejo (PerkinElmer, NEF812001EA). La intensidad de cada banda se midió y analizó utilizando el software ImageJ proporcionada por el NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/).
ensayo de PCR cuantitativa en tiempo real de DNMTs y G9a
El nivel de expresión de ARNm DNMTs y G9a se cuantificó por cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR). ARN total fue aislado de la OAZ y los transfectantes del vector simuladas utilizando el reactivo TRIzol® (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los cebadores de PCR se diseñaron usando el software Mac Vector versión 7.2 basado en las secuencias de ADNc que fueron descargados de la base de datos NCBI. Las reacciones de QRT-PCR se realizaron utilizando un LightCycler con el kit LightCycler Comienzo Acelerado principal DNA SYBR Green I. La amplificación del cDNA de la muestra se controló con el colorante de unión de ADN fluorescente SYBR Green en combinación con un sistema de detección de secuencia ABI 5700. β-actina se utilizó como control endógeno para la normalización. Las secuencias de cebadores de PCR, la temperatura óptima de recocido y tamaños de amplificación se enumeran en la Tabla 1. El análisis estadístico se realizó mediante el análisis de ANOVA Uno de los factores.
Western blot de las proteínas y DNMTs G9A
el extracto nuclear se preparó a partir del OAZ y los transfectantes del vector simulacros con Ne-PER® nucleares y citoplasmáticas de extracción Reactivos (Thermo Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Cincuenta mg de extracto nuclear de cada muestra se cargó y se separó en 5% de gel de SDS-PAGE y la proteína se transfirió a una membrana de PVDF. El Western Blot posterior se realizó como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos utilizados para este estudio fueron un anticuerpo policlonal de conejo anti-humano DNMT1 (Abcam, ab19905, 1:500), un anticuerpo anti-ratón DNMT3A de conejo policlonal (Abcam, ab23565, 1:200), un anticuerpo policlonal de conejo anti-ratón anticuerpo DNMT3B (Abcam, ab16049, 1:300) y un anticuerpo anti-G9a humano policlonal de conejo (Upstate Biotechnology, 07-551,1:1,000). La misma cantidad de carga de la muestra se controló y se confirmó mediante Oct-señal -1 utilizando un anticuerpo policlonal de conejo Oct-1 anti-humano (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-232, 1:1,000)
enzima DNMT. ensayo
actividad enzimática DNMT actividad se determinó por el método de Belinsky et al, con modificaciones menores [53]. El lisado celular se preparó en tampón de lisis por congelación-descongelación tres veces y se centrifugó para eliminar los restos celulares. lisado celular que contiene 20 g de proteína (125 l) se mezcló con 125 l mezcla de reacción (Tris HCl 20, pH = 7,4, 25% de glicerol, EDTA 5 mM, DTT 1 mM, 5 Ci [metil-3H] -S-adenosil -L-metionina, 4 g de poli [dI-dC] poli [dI-dC], 25 mg de BSA) y se incubó durante 2 horas a 37 ° C. Las reacciones se detuvieron y el ADN se extrajo con fenol: método de extracción chrolform. La solución acuosa se complementó con 0,1 N NaOH y se incubó durante 2 horas a 50 ° C. La mezcla de reacción se neutralizó con HCl 1N. ADN se precipitó con 20% TCA y atrapado en el filtro de G /C. La radiactividad se contó con un contador de centelleo.