Extracto
metástasis hepática es una causa importante de mortalidad por cáncer colorrectal (CCR). Sin embargo, los mecanismos que subyacen a este proceso son en gran parte desconocidos. La osteopontina (OPN) es una glicoproteína fosforilada secretada que está implicado en la migración de tumor y la metástasis. El papel de OPN en el cáncer es claro en la actualidad. En este estudio, se examinó OPN ARNm en tejidos de CRC, la mucosa normal adyacente, y las lesiones metastásicas del hígado utilizando análisis de PCR cuantitativa en tiempo real. La expresión de la proteína de OPN y sus receptores (alpha v integrina y V6 CD44) se detectó mediante el uso de una inmunohistoquímica (
IHC
) método. El papel de OPN en la metástasis de hígado se estudió en el cáncer de colon establecido SW-480 líneas celulares transfectadas con plásmidos de expresión eucariota sensoriales o antisentido-OPN por citometría de flujo y ensayo de adhesión celular Colo-205 y. la redistribución de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) se utilizó para estudiar la comunicación intercelular brecha funcional (GJIC) entre las células transfectadas con OPN. Se encontró que OPN fue altamente expresado en las lesiones hepáticas metastásicas de CRC en comparación con el tejido primario CRC y mucosa normal adyacente. La expresión de ARNm de OPN en los tejidos tumorales fue significativamente relacionados con las etapas de CRC. OPN expresión también se detectó en los hepatocitos normales circundantes lesiones metastásicas CRC. Dos receptores conocidos de OPN, alpha v integrina y las proteínas CD44v6, se expresaron con fuerza en hepatocitos de hígado normal. CRC células con expresión de OPN forzada exhiben una mayor adherencia heterotıpica con las células endoteliales y la comunicación intercelular debilitado. OPN juega un papel importante en la CRC metástasis a hígado a través de la interacción con sus receptores en los hepatocitos, disminución de la adhesión homotípica, y la adhesión mejorada heterotípicos
Visto:. Huang J, Pan C, Hu H, Zheng S, Ding L ( 2012) La osteopontina-Enhanced hepática metástasis de células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 7 (10): e47901. doi: 10.1371 /journal.pone.0047901
Editor: Natasha Kyprianou, Universidad de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 11 de mayo de 2012; Aceptado: 18 Septiembre 2012; Publicado: 24 Octubre 2012
Derechos de Autor © 2012 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo el apoyo de una Fundación de Ciencias Naturales de China (81102012; http://www.nsfc.gov.cn/), Zhejiang proyecto talentos Qianjiang (2011R10029; http://kjt.zj.gov.cn/), y la medicina Zhejiang los proyectos del fondo de investigación científica (2010ZB073; http://www.zjtcm.gov.cn/) a LD. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CRC) sigue siendo la segunda causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos [1]. Aproximadamente el 50% de los pacientes de CRC tiene metástasis en el hígado, pero sólo 10% -20% de estos pacientes puede someterse a una resección quirúrgica. La tasa de supervivencia a 5 años después de la resección quirúrgica del tumor metastásico es sólo el 30% -40% [2], [3] .Los mecanismos moleculares que subyacen a la metástasis CRC no se entienden completamente, pero evidencias recientes sugieren que la osteopontina (OPN) desempeña un papel en la la regulación de la metástasis de células de cáncer de colon [4].
OPN es un phosphoglycoprotein que se aisló originalmente a partir de matriz ósea mineralizada [5], también con frecuencia es secretada por diferentes tipos de células cancerosas, esenciales para el crecimiento y la metástasis de mama [ ,,,0],6], de próstata [7], [8], hepática [9], melanoma [10], y otros tumores [11]. señales de OPN a través de moléculas de adhesión celular, tales como integrinas y CD44 [12], [13]. Los estudios de genes de perfiles han identificado una correlación entre los tumores colorrectales avanzados y metastásicos y alta expresión de OPN [14]. Una importante influencia de OPN en el potencial metastásico es a través de la unión celular y la migración a través de proteins22 matriz extracelular. Sin embargo, no se han establecido los roles funcionales y los mecanismos subyacentes de la OPN en la metástasis colorrectal.
A continuación, se investigó el papel de OPN en la metástasis de colon al hígado y los mecanismos por los cuales OPN promueve la actividad metastásica del cáncer de colon.
Materiales y Métodos
los pacientes
muestras tumorales procedentes de 44 casos de CCR y 20 pacientes con metástasis hepáticas en el Segundo hospital Afiliado de la Universidad de Zhejiang se obtuvieron fresco de resecciones quirúrgicas con anterioridad consentimiento. La edad media de los pacientes fue de 57 años en funcionamiento, que van del 25 al 84. características patológicas incluyendo la localización del tumor, el estadio y la diferenciación se registró. En este estudio se ha obtenido la aprobación ética de la investigación humana desde el Comité de Ética del Hospital Afiliado En segundo lugar, la Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang.
Cell Cultura y
Dos líneas celulares de adenocarcinoma de colon Colo-205 y las células SW480 se obtuvieron del Instituto del cáncer de la Universidad de Zhejiang y se mantuvieron en medio RPMI-1640 con suero de ternera al 10% a 37 ° C con 5% de CO
2.
cuantitativo PCR en tiempo real
Las muestras de tejido fueron instantánea congelada inmediatamente después de la resección quirúrgica. El ARN total fue aislado utilizando Trizol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La integridad del RNA se examinó por electroforesis en gel con gel de formaldehído al 1%. 2.0 g ARN total fue transcrito inversamente con el kit de SUPER SCRIPT II RT-PCR (Invitrogen). PCR en tiempo real se realizó en un volumen final de 50 l que contenía 1 l RT transcripción, 5 M de cada cebador, 0,5 unidades de ADN polimerasa AmpliTaq (Invitrogen). Como un control positivo interno, en tiempo real el análisis de PCR se realizó en el gen GAPDH en paralelo. Se utilizaron los siguientes cebadores: cebador directo 5 'OPN-CAA ATACCCAGATGCTGTGGC-3'; cebador inverso 5'-OPN TCCTGGCTGTCCACATGGTC-3 '; GAPDH cebador directo 5'-CTTAGCACCCCTCCCCAAG-3 '; GAPDH cebador inverso 5'-GATGTTCTGGAGAGCCCCG-3 '. OPN sonda TaqMan 5'-TGACCCTACTCAGAAGCAGAATCTCCTAGCC-3 '; sonda GAPDH TaqMan 5'-CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA-3 '. Las amplificaciones por PCR se llevaron a cabo en un formato de placa de reacción de 96 pocillos y las señales de fluorescencia se detectaron con un PE Applied Biosystems 7700 Sequence Detector (Perkin-Elmer). Las señales de fluorescencia se tradujeron a C
valores de T (umbral de ciclo; correspondiente al número de ciclo en el que se detectó un aumento significativo en la señal de fluorescencia primero). El nivel de expresión de ARNm de OPN OPN = C
valor T /GAPDH C
T valor.
Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en geles de agarosa y teñido con bromuro de etidio y se fotografiaron. Los productos de PCR del tamaño esperado se clonaron en un vector pGEM-T-Easy (Promega) y se confirmaron las secuencias de los plásmidos resultantes.
antisentido y sentido-OPN Los plásmidos de expresión eucariota
para obtainan anti-sentido plásmido de expresión de OPN, que generó un fragmento de ADNc de 201 pb (210-368) utilizando PCR con los cebadores OPN como se mencionó anteriormente. a continuación, el fragmento de ADNc se clonó en el
EcoR I
sitio de la pcDNA 3.1 (+). La dirección inversa del cDNA clonado se confirmó por secuenciación de ADN (El vector se designa OPN-antisentido).
El marco de lectura abierto (ORF) de OPN se obtuvo por RT-PCR. OPN imprimación F: 5'-CCG CAC AAG GAA TCA AAC CT - 3 ', R: 5'-CTC CTT TTA ATT GAC CTC AG - 3'. Los 974 bp productos de PCR se clonaron en un vector pGEM-T-fácil y se secuenciaron en ambas cadenas utilizando el ABI PRISM ™ 377 DNA Sequencer (Perkin-Elmer). El ORF de la OPN a continuación, se clonó en un vector de expresión eucariota pcDNA 3.1 (+) para generar pcDNA 3,1-OPN (ORF). (El vector se designa OPN-sentido).
líneas celulares de expresión estable
Los plásmidos de OPN-antisentido, OPN-sentido y pcDNA3.1 (+) se linearlized con
Bgl ?
la digestión durante 4 horas. transfección de ADN se realizó usando el reactivo de transfección Superfect (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de 48 horas, se seleccionaron las células transfectadas con G418 durante 3 días. Los clones seleccionados se agruparon y se expandieron. Las líneas celulares establecidas se confirmaron con la RT-PCR y análisis de perno occidental.
In Situ
ARNm hibridación (
ISH
): perfil
sondas específicas complementarias, el ARNm de OPN fueron diseñados sobre la base de GenBank J04765 (ARNm de osteopontina humana, cds completos). Estas secuencias de oligonucleótidos tienen 100% de homología con el gen de OPN y una homología mínima con otras secuencias de genes de mamíferos como buscado en GenBank por explosión. DIG Kit RNA Label (SP6 /T7) (Roche) se utilizó para generar tanto sentido y antisentido. tejidos incluidos en parafina se seccionaron a 4 μ m. Los portaobjetos se desparafinaron y se trataron con 0,2% M. HCl durante 20 min. Después de digestión con proteinasa K, los portaobjetos se incubaron con solución de pre-hibridación (que contiene 500 mg /ml de poli (A)) a 42 ° C durante 30 min en una cámara de humedad. La solución se sustituyó por solución de hibridación (que contiene 0,3 mg /ml sentido o sonda de ARN sola hebra anti-sentido, respectivamente, 50% de formamida, 10% sulfato de dextrano, y 2 x SSC), y se hibridó a 42 ° C durante la noche. Después se lavó con 2 x SSC y 1 x SSC durante 15 min sucesión, los portaobjetos se bloquearon con PBS que contiene 5% de albúmina de suero bovino durante 10 min, se incubaron con el ratón-anti-digoxina anticuerpo marcado con biotina durante 30 min y luego con phosphoesterase alcalina -affinitin para 30 min. NBT-BCIP se utilizó para manchar los portaobjetos en tampón de sustrato pH 10. Después de la deshidratación, los portaobjetos se montaron con medio de montaje acuoso (Sigma).
Análisis Inmunohistoquímica
rata anti-humano anticuerpo monoclonal osteopontina (Chemicon, Billerica, MA) se utilizó para
IHC
. Todas las secciones (5 micras de espesor) a partir de bloques de parafina de tejido fijados con formol se montaron en portaobjetos de vidrio recubiertos con gelatina. Para mejorar la exposición al antígeno, las diapositivas fueron tratados con 1 × EDTA a 98 ° C durante 10 minutos para recuperar el antígeno. Los portaobjetos se incubaron con solución de bloqueo de peroxidasa endógena para inhibir la peroxidasa endógena, después se incubaron con el anticuerpo primario (ya sea anti-OPN anticuerpo monoclonal de ratón (Akm2A1; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a una dilución de 1:200, o anticuerpo monoclonal de la integrina alpha v (P2W7; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a una dilución de 1:200, o anticuerpo monoclonal CD44v6 (MAB-0038; Maixin, Fujian, china) a una dilución de 1:100) a temperatura ambiente por 60 min. Después se enjuaga con solución salina tamponada con Tris, los portaobjetos se incubaron durante 15 min con el anticuerpo secundario conjugado con biotina, se lavaron y después se incubaron con la enzima conjugado HRP (peroxidasa de rábano picante) -estreptavidina. Recién preparado DAB (Zymed, South San Francisco, CA) se utilizó como sustrato para detectar HRP. Por último, las diapositivas se counterstained con hematoxilina y se montaron con medio de montaje acuoso.
ensayo de adhesión celular
monocapa Colo-205 células y células SW-480 se mantuvieron en placas de 35 mm Ø y medio normal hasta 70% -80% de confluencia. células unidas fueron entonces superpuestos en la monocapa de células, se mezclaron bien y se incubaron durante diferentes períodos de tiempo.
se contaron las células flotantes fueron recogidos después de una incubación de 10 min, 20 min, 30 min y 40 min, y el número utilizando un hemocitómetro. A continuación, se calcula el coeficiente de adhesión celular: relación de adherencia = (suma de las casillas añadido- células suspendidas) /suma de las celdas de muestras. ensayo de adhesión Homotipica se realizó con las mismas líneas de células, cada una de ellas entre las células endotelio de los vasos ombligo células ECV 304 se utilizó en el ensayo de adhesión, respectivamente heterotıpica.
Análisis de citometría de flujo
1 × 10
6 /ml muestras de células se suspendieron a fondo en PBS, se mezcló con 20 l de anticuerpo CD44-FITC, controlado con 20 l IgG1 /anticuerpo 2a, de células se incubaron con Ab a TA durante 20 min. Enjuagado con PBS, se mezcló con 1% paraformal-dehído, entonces detectada con FAC Scan (empresa BD, Cell Quest software TM Versión 3.3).
Redistribución-Gap después de fluorescencia photobleaching (FRAP-Gap) Método
Las células de 80% de confluencia fueron examinados para la redistribución de la fluorescencia después de photobleaching. Las células se enjuagaron con Hanks (Ca
2 +, Mg
2 +), se incubaron 15 min con 10 mg /ml 5 (6) de diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) en 37 ° C, 5% de CO
2 . Después de enjuagado por PBS, se seleccionó una célula adyacente a otras células y su fluorescencia se photobleached bajo LEICA TCS-SP microscopio láser co-enfoque (Argon rayo láser de iones, 518 nM, programa /lampse Tiempo para photobleaching y escanear, software Fisiología para una imagen y datos). Las imágenes digitales de la emisión fluorescente excitada por pulsos láser débiles se registraron a intervalos regulares durante 12 minutos (tiempo de exploración 1 minuto antes y después de photobleaching) y se almacena para su posterior análisis. En cada experimento, una etiqueta, célula aislada se dejó sin blanquear como referencia para la pérdida de fluorescencia debido a la exploración repetida y las fugas de colorante, y una, célula blanqueada aislado sirvió como control.
Análisis estadístico
Los datos se expresan como media ± SEM. para muestras relacionadas
t
prueba, para muestras independientes
t
de prueba y unidireccional ANOVA se utilizaron. Los cálculos se realizaron utilizando el software SPSS 13.0.
P
los valores inferiores a 0,05 se consideraron significativos.
Resultados
Expresión de OPN en la Primaria CRC, el CRC metastásico lesiones en el hígado y los tejidos normales
Based en tiempo real cuantitativa valores PCR, C
T están en proporción inversa al valor de registro de los números de copias originales de secuencia diana. Se encontró que OPN mRNA se expresó en 44 casos de tejidos de CRC pero a diferentes niveles; la máxima C
valor T fue de 1,47 y el valor mínimo fue de 0,85, ±
s
= 1,15 ± 0,14. Cuando se combina con las muestras normales adyacentes, la máxima C
valor T fue de 1,75 y el valor mínimo fue de 0,94, ±
s
= 1,32 ± 0,18. (Para muestras relacionadas
t
prueba,
t = 5,81
,
P
= 0,000). La OPN expresión de ARNm se incrementó significativamente en el tejido CRC primaria en comparación con los tejidos normales vecinos.
ISH
, la mancha positiva presenta azul-púrpura bajo el microscopio. El ARNm OPN, que indica una señal positiva, se encontró en el citoplasma de las células de CRC en las lesiones primarias (× 400). b, La mancha en los tejidos normales adyacentes colorrectal fue negativo (x400). c, OPN ARNm se encontró en el citoplasma de las células del tejido CCR metastásico del hígado. Los tejidos hepáticos normales adyacentes manchas negativo (× 100).
En 20 de los tejidos examinados metástasis hepática de CRC, la máxima C
valor de T era 1,30 y el valor mínimo fue de 0,92, ±
s
= 1,07 ± 0,10. En comparación con el cáncer primario, la expresión de ARNm de OPN en los tejidos hepáticos metastáticos fue mayor (para muestras independientes
t
prueba,
t = 2,12
,
P = 0,038
).
Con base en el estadio de Dukes, siete de un total de 44 pacientes con CRC se encontraban en la fase a y el ARNm de OPN significa C
valor de T fue 1.49 ± 0.38, 1.21 ± 0.28 para la etapa B (17 pacientes), 1,11 ± 0,29 para la etapa C (18 pacientes), y 0,92 ± 0,32 para la etapa D (2 pacientes). El nivel de expresión de ARNm de OPN en los tejidos de CRC en etapa temprana fue significativamente más alto que el que en la etapa avanzada (ANOVA de una vía,
P = 0,031
).
A continuación, utilizamos
ISH
análisis para evaluar adicionalmente la expresión de ARNm de OPN y localización. En este análisis, el positivo aparece azul-púrpura bajo el microscopio. OPN mRNA, que aparece coloración de la señal, se encontró en el citoplasma de las células de CRC, tanto en las lesiones primarias y tejido metastásico del hígado. La señal de tinción no se detectó en colorrectal normal adyacente y los tejidos normales del hígado (
Fig. 1
).
El uso de un método inmunohistoquímico, se confirmó, además, que la proteína OPN fue expresada en el citoplasma de CRC células, tanto en la lesión primaria y tejidos metastásicos. Las manchas positivas de color marrón también se encontraron en hepatocitos normales de todo el tejido metastásico. colorrectal tejidos normales adyacentes no presentan ninguna señal. Como control, las proteínas se tiñen de OPN en los tejidos hepáticos normales y sin metástasis CRC
(
Fig. 2
)
.
IHC
, proteínas OPN (tinción positiva marrón) se localizaron en el citoplasma de las células de CRC en lesiones primarias (x200). b colorrectal tejidos normales adyacentes fueron negativos (x200). c mancha positiva se encuentra tanto en las células de CRC y los hepatocitos normales adyacentes en los tejidos metastásicos del hígado (x100). d Como controles, las proteínas de OPN manchar en los tejidos normales del hígado sin CCR metástasis fue negativo (x100).
Expresión de receptores alpha v OPN-integrina y CD44v6 tinción normal en hepatocitos
OPN tiene ha demostrado que interactúan con un número de diferentes integrinas a través de la secuencia RGD, incluyendo αvβ3, αvβ1 y αvβ5. CD44v6 es una variante de empalme de CD44 (CD44v) también podría unirse a OPN y es probable que promueve la adhesión de células de cáncer al endotelio vascular y las membranas de base, a continuación, aumenta la invasión y metástasis de carcinomas de colon. Para verificar estos receptores en hígado normal, que ensayaron para la integrina αvβ1 y CD44v6 por IHC. Se encontró que tanto αvβ1 integrina y CD44v6 se tiñeron positivamente en los hepatocitos en los tejidos normales del hígado
(
La Fig. 3
).
IHC
, proteínas integrina alpha v (tinción positiva marrón) se localizaron en el citoplasma de los hepatocitos (× 400). b, proteínas CD44v6 (tinción positiva marrón) se localizaron en el citoplasma de los hepatocitos (× 400).
La expresión de CD44 en la membrana celular mediante citometría de flujo
CD44 juega un papel importante en adhesión célula-célula, interacción célula-sustrato, homing de linfocitos, y la metástasis tumoral. Estudios recientes han demostrado que la alta expresión de CD44 en ciertos tipos de tumores se asocia con la propagación hematógena de células cancerosas.
detectó la expresión de CD44 en líneas celulares transferidos usando citometría de flujo. Se encontró que después de la baja regulación de la expresión de OPN, la expresión de CD44 en las membranas celulares Colo-205-OPN-antisentido se redujo de 54,28 ± 0,11 0,24 ± a la 35.35 en Colo-205,
P Hotel & lt; 0,01. Por el contrario, el valor se incrementó en 480- SW-OPN células de sentido en el que la expresión de OPN son regulados hasta de 2,65 ± 0,21 a 33,12 ± 0,15,
P
. & Lt; 0,01
heterotıpica adhesión celular
la adhesión celular homotipica y es un factor importante en la metástasis del cáncer. La separación de las células cancerosas de los tumores de los padres es un evento inicial en la metástasis y se relaciona con la adhesión homotipica decreciente. Una vez que las células tumorales escapan del tumor primario, que interactúa con la membrana basal de acogida preexistentes en una diversidad de etapas durante la cascada metastásica. adherencia heterotıpica ayuda a las células cancerosas completa de todo este proceso.
Hemos detectado la homotipica y capacidad de adhesión heterotıpica en Colo-205-OPN-antisentido y SW-480-OPN-sentido por separado. células de endotelio de los vasos ombligo ECV 304 se utilizó como células diana en la adhesión heterotıpica. capacidad de adhesión Homotipica se mejoró después de la transfección de OPN-antisentido en Colo-205, pero se debilitó en SW-480-OPN-sentido. Por el contrario, la capacidad de adherencia heterotıpica se debilitó en Colo-205-OPN-antisentido, pero se mejoró en SW-480-OPN-sentido.
(datos no mostrados)
.
Comunicación intercelular brecha ocasiones (GJIC) con Gap-FRAP
GJIC consiste en el intercambio intercelular de moléculas de bajo peso molecular, y es el único medios para el contacto directo entre citoplasmas de las células animales adyacentes. Alteraciones de la GJIC se han asociado con muchas condiciones patológicas, tales como la carcinogénesis o enfermedad hereditaria [15], también pueden facilitar la liberación de una célula neoplásica potencialmente desde el control de los tejidos circundantes, dando lugar a la promoción de tumores [16].
se utilizó brecha-FRAP para medir la GJIC en OPN células transfectadas (SW-480-pcDNA3.1 (+) - OPN), mientras que Colo-205 eran células semi-suspensión que no fueron apropiados para este método. el intercambio de señales de las células se deteriora y se inhibió la función GJIC. En comparación con las células control (células SW-480-OPN transfectadas vector, SW-480-pcDNA3.1 (+)), la fluorescencia se redistribuye no así en las células SW-480-OPN-sentido después de que ambos 5 minutos y 10 minutos de photobleaching. Después de 5 minutos de photobleaching, el porcentaje de redistribución después de fluorescencia photobleaching (FRAP%) fue 24.65 ± 4.08% en SW-480-pcDNA3.1 (+) - OPN en comparación 44.74 ± 6.23% en SW-480-pcDNA3.1 (+ ) (
t = 17,07
,
P Hotel & lt; 0,001), y después de 10 minutos, el FRAP% seguía ser inhibida a 25,98 ± 4,48% en SW-480-pcDNA3.1 ( +) - OPN mientras se redistribuía a las 64.92% ± 5.39% en las células SW-480-pcDNA3.1 (+) (
t
= 35.16,
P Hotel & lt; 0,001) (
La Fig. 4
). Estos resultados indican que la OPN puede inhibir la función de la GJIC y alteraciones en el intercambio de señales entre estas células SW-480 transfectadas.
intensidad de fluorescencia uniforme antes de photobleaching en SW-480-pcDNA3.1 (+). a2, debilitado intensidad de fluorescencia después de photobleaching en SW-480-pcDNA3.1 (+). a3, la redistribución de la fluorescencia después de 10 minutos en el SW-480-pcDNA3.1 (+). b1, la intensidad de fluorescencia uniforme antes de photobleaching SW-480-pcDNA3.1 (+) las células de OPN. b2, debilitado intensidad de fluorescencia después de photobleaching SW-480-pcDNA3.1 (+) las células de OPN. b3, la redistribución de fluorescencia débil después de 10 minutos de OPN células SW-480-pcDNA3.1 (+). C, el porcentaje de redistribución después de fluorescencia photobleaching (FRAP%) en SW-480-pcDNA3.1 (+) y células de OPN SW-480-pcDNA3.1 (+). Después de 5 minutos de photobleaching, el porcentaje de redistribución después de fluorescencia photobleaching (FRAP%) 24.65 ± 4.08% en SW-480-pcDNA3.1 (+) en comparación -OPN 44,74 ± 6,23% en SW-480-pcDNA3.1 (+) (
t = 17,07
,
P Hotel & lt; 0,001), y después de 10 minutos, el FRAP% seguía ser inhibida a 25,98 ± 4,48% en SW-480-pcDNA3.1 (+ ) -OPN mientras se redistribuía a las 64.92% ± 5.39% en las células SW-480-pcDNA3.1 (+) (
t
= 35.16,
P
. & lt; 0,001)
Discusión
cáncer de colon humano afecta a cerca de 150.000 pacientes y 60.000 muertes en los Estados Unidos por año. El hígado es el sitio primario de colon extra para CRC metástasis y representa la localización más frecuente y la presentación clínica de la enfermedad recurrente en pacientes que no responden al tratamiento locoregioal [17]. Hay pocos marcadores tumorales que tienen utilidad clínica en el tratamiento de CRC metástasis. Incluso la aplicación del marcador más ampliamente utilizado, el antígeno carcinoembryoni (CEA), recientemente se ha puesto en duda [18]. OPN es un gen candidato de la metástasis en el CCR. Con la aplicación de la tecnología de la expresión génica y la expresión de perfiles muestra colectiva [19], [20] de perfiles, OPN ha sido identificado como el principal candidato marcador clínico de la progresión del CRC. Por ello, investigó el papel de OPN en la regulación de la metástasis hepática de los órganos diana.
Usando cuantitativa en tiempo real, se verificó que la OPN fue altamente expresado en las lesiones hepáticas metastásicas de CRC en comparación con el tejido primario CRC y la mucosa normal adyacente. Además, la expresión de mRNA de OPN en los tejidos tumorales fue significativamente relacionados con las etapas de CRC. Estos resultados implican que la OPN es un marcador potencial para la invasión tumoral y la metástasis hepática de CRC.
Notablemente, OPN ARNm se encontró en el citoplasma de las células de CRC por
in situ
la hibridación, pero no en sus tejidos normales adyacentes o en los tejidos circundantes normales del hígado. ensayo inmunohistoquímico mostró que la proteína OPN también existe obviamente en el citoplasma de los hepatocitos normales adyacentes que rodean los tejidos de CRC, y que la expresión de la proteína OPN en el tejido hepático normal es negativo. Sin embargo, hemos detectado dos receptores de OPN, integrinαv y CD44v6, en el tejido hepático normal. Por lo tanto, la hipótesis de que cuando las células tumorales CRC salen de lesiones primarias, la vena portal, que es una vena circumfluence necesario, permite que las células cancerosas pasen a través del hígado. Las células tumorales que contienen OPN podría acumularse en el hígado a través de una interacción entre un ligando y un receptor.
Hemos examinado dos líneas celulares diferentes para investigar el papel de OPN en la regulación de la metástasis. La línea de células Colo-205 se transfectó con un plásmido eucariótico OPN-antisentido para inhibir la expresión de la proteína OPN en esta línea celular. células SW-480 se transfectaron con un plásmido eucariótico OPN-sentido, de modo que la proteína OPN se expresa en esta línea celular.
Después de la transfección de células, las células transfectadas antisentido Colo-205-OPN agrupados (datos no mostrados ), la adhesión homotípica se mejoró en estas células en comparación con el Colo-205-pcDNA3.1 (+). Sin embargo, la capacidad de adhesión se debilitó en células SW-480-OPN de sentido, y la movilidad se mejoró en estas células que expresan OPN (datos no mostrados). Al mismo tiempo, se determinó la adherencia heterotıpica con ECV304 como células diana, capacidad de adhesión heterotıpica se debilitó en las células Colo-205-OPN-antisentido y se mejoró en las células SW480-OPN-sentido. Estos resultados sugieren que OPN disminuye la adhesión entre las células homotipica CRC y mejora la capacidad de adhesión entre las células heterotípicos CRC y células del endotelio.
invasión y metástasis son características importantes de los tumores malignos. Todo el proceso de metástasis incluye la adhesión de la angiogénesis, la degradación, el movimiento y la reinserción [21]. factores de adhesión están implicados esencialmente en el proceso. OPN es probablemente uno de los numerosos factores pronósticos relacionados con la metástasis de CCR.
Debido a OPN, capacidad de adhesión homotipica se debilita en las células CRC y las células de apartarse de sitio primario con mayor facilidad, y entrar en la circulación sanguínea. El primer paso de la metástasis es inicio. Sin embargo, las células de CRC son más fácilmente para invadir ECM (la matriz extra celular) cuando se mejora la adhesión heterotípicos. Estos dos pasos son importantes para la metástasis en el cáncer maligno.
GJIC se ha especulado que ser un si no suficiente, función necesaria, biológica de las células de metazoos en la regulación del control del crecimiento, la diferenciación y la apoptosis de las células progenitoras normales [22 ]. La comunicación intercelular en muchos órganos se mantiene a través de canales de salida brecha intercelulares compuestas de conexinas, una gran familia de proteínas con un número de isoformas. Este GJIC permite la propagación de los potenciales de acción (por ejemplo, en el cerebro, corazón), y la transmisión de las pequeñas moléculas que pueden regular el crecimiento celular, la diferenciación y la función. Este último ha demostrado estar involucrados en el crecimiento del cáncer: reducción de la GJIC menudo está asociado con un mayor crecimiento del tumor o con el proceso de desdiferenciación. la redistribución de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) se adoptó para observar la recuperación de la intensidad de fluorescencia en las células blanqueados y por lo tanto para estimar la comunicación intercelular por uniones comunicantes.
En nuestro estudio, la redistribución de la fluorescencia después de photobleaching fue debilitado en SW-480 - OPN células de sentido. función de la GJIC se inhibió y el intercambio de señales se deteriora, así que estas células tumorales se separan más fácilmente de las lesiones primarias para iniciar la primera etapa de la metástasis dicho sea de paso.
Sobre la base de estudios de los mecanismos correlacionados entre la expresión de OPN y la metástasis en combinación con las literaturas pertinentes, se llegó a la conclusión de que un mecanismo potencial de OPN promover CRC metástasis hepáticas es el siguiente: las células CRC expresan OPN, la capacidad de homogeneidad adherencia se reducen, la función de GJIC se inhibe, se incrementa la capacidad de invasión y movimiento, lo cual hace que sea fácil para las células CRC apartarse de lesión primaria, entrar en la circulación e iniciar el procedimiento de metástasis. Al mismo tiempo, debido a la OPN, la expresión de CD44, un factor relacionado con la metástasis, también se incrementa. La adhesión entre las células heterotípicos CRC, ECM y célula endotelial vascular es mayor. En el curso de refluence vena portal, OPN permite que las células de cáncer para invadir los vasos periféricos, estableciéndose y la plantación en el hígado. Por otra parte, se encontró que los receptores de OPN, CD44v6 y alpha v integrina en el hígado. La interacción entre ligandos y receptores podría explicar el hígado-adherente de las células de CRC.
Estos resultados sugieren que OPN es uno de los factores importantes en la infiltración de tumor y la metástasis. El efecto sobre homotipica y adhesión en las células heterotıpica CRC de OPN es esencial en el proceso de metástasis hepática.
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos con el Dr. Jiaping Peng y el Dr. Xiaoming Fang, por su inestimable asesoramiento científico durante el estudio.