Extracto
TP53 es el gen más frecuentemente mutado en cáncer de cabeza y cuello (CECC), con mutaciones están asociadas con la resistencia a la terapia convencional. La restauración de la función de p53 normal, previamente se ha investigado mediante el uso de RITA (reactivación de p53 y la inducción de la apoptosis de las células tumorales), una pequeña molécula que induce un cambio conformacional en p53, lo que lleva a la activación de sus objetivos de abajo. En el presente estudio se encontró que de hecho RITA ejerce efectos significativos en las células HNSCC. Sin embargo, en este modelo, se encontró que un resultado significativo del tratamiento RITA se aceleró la senescencia. senescencia RITA-inducida en una variedad de orígenes de p53, incluyendo las células p53 nulos. Además, la inhibición de la expresión de p53 no parece inhibir significativamente la senescencia inducida por RITA. Por lo tanto, este fenómeno parece ser parcialmente independiente de p53. Además, la senescencia inducida por RITA parece estar mediada en parte por la activación de la respuesta al daño del ADN y SIRT1 (información silencioso regulador T1) inhibición, con un efecto sinérgico visto por la combinación de radiación o la inhibición de SIRT1 ionizante con el tratamiento RITA. Estos datos apuntan hacia un nuevo mecanismo de función RITA, así como indicio de su posible beneficio terapéutico en HNSCC
Visto:. Chuang HC, Yang LP, Fitzgerald AL, Osman A, Woo SH, Myers JN, et al . (2014) La p53 de Reactivación de moléculas pequeñas RITA induce la senescencia en células de cáncer de cabeza y cuello. PLoS ONE 9 (8): e104821. doi: 10.1371 /journal.pone.0104821
Editor: Arianna L. Kim, Columbia University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: April 2, 2014; Aceptado: July 16, 2014; Publicado: 13 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Chuang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Texas MD Anderson de cabeza y cuello premio de desarrollo de cáncer SPORE Carrera (SA). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las mutaciones en
TP53 ¿Cuáles son una alteración genética común presente en muchos tipos de tumores sólidos, incluyendo carcinoma de cabeza y cuello de células escamosas (HNSCC) [1], [2]. Nuestro grupo y otros han demostrado que
TP53
mutaciones se asocian con una mayor resistencia a la radiación y la quimioterapia en las líneas celulares CECC
in vitro Opiniones y con malos resultados en pacientes con CECC [3] - [5 ]. Desafortunadamente, las estrategias terapéuticas para reintroducir p53 de tipo salvaje (wt) por tumores han sido un desafío logístico [6], y por lo tanto las estrategias se están estudiando para el tratamiento terapéutico de re-activación de p53 endógeno en lugar [7] - [10]. Un compuesto de interés, RITA (reactivación de p53 y la inducción de la apoptosis de las células tumorales), es una pequeña molécula que se une a la N-terminal de la proteína p53 e induce un cambio conformacional que puede conducir a la restauración de la función normal de p53 [11] , [12]. RITA puede activar p53 objetivos de abajo, tanto en peso p53 [13], [14] y las células mutantes de p53 (mt) [15] en una variedad de modelos.
Se piensa
RITA para actuar principalmente a través de la inducción de la apoptosis y, de hecho RITA, solo o en combinación con cisplatino, puede inducir la apoptosis en muchas líneas celulares HNSCC [16], [17]. Sin embargo, este efecto no es universal. Las líneas celulares que expresan p53 en peso, pero no se someten a la apoptosis en respuesta al tratamiento RITA incluyen la línea celular HNSCC JHU-028 [17], el osteosarcoma humano línea celular SJSA y la línea celular de carcinoma de colon humano RKO [18].
la apoptosis no es el único destino celular después de la activación de p53. Numerosos estudios han encontrado que la activación de p53 en respuesta a una variedad de estímulos en células de cáncer conduce a la senescencia acelerada [7]. Aunque el resultado final de la celda después de que entre la senescencia no es clara, varios estudios han relacionado la inducción de la senescencia con la respuesta a los agentes terapéuticos. Hemos observado que la radiación [3] y el cisplatino [4] inhibió el crecimiento celular mediante la inducción de la senescencia en células p53 HNSCC WT. En consonancia con esta observación, se encontró que las células que expresan p53 HNSCC MT para ser resistente a la radiación o cisplatino, en gran parte debido a la falta de una respuesta de la senescencia. Se observó además que muchas de estas mismas líneas celulares también son resistentes a la apoptosis inducida por el tratamiento [3], [4]. Por lo tanto, al menos en este modelo, la inducción de la senescencia parece reflejar un resultado de tratamiento favorable.
El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de RITA en la supervivencia, la proliferación y la inducción de senescencia en varios HNSCC humana líneas celulares. Se buscó además de comprender los mecanismos por los cuales se producen estos efectos.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
Las líneas celulares HNSCC utilizados en este estudio fueron generosos regalos del Dr. Jeffrey Myers (El Centro de cáncer de Texas MD Anderson y se han caracterizado previamente [19]. HN30 y líneas de células HN31 se derivaron de un tumor primario y los ganglios metástasis ganglionares de la faringe carcinoma de células escamosas, respectivamente. todo el exoma de estas dos líneas celulares ha sido secuenciado para un proyecto independiente y, con la excepción de TP53, no se observaron otras mutaciones discordantes entre las dos líneas celulares. la línea celular de PCI-13 se deriva de un carcinoma de células escamosas de la cavidad oral. Todas las líneas celulares se mantuvieron en Dulbecco medio de Eagle modificado que contiene 10% de suero fetal bovino, penicilina /estreptomicina, glutamina, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales y vitaminas. Las técnicas para la forma estable derribando p53 en las células HN30 (que tienen p53 en peso) y células HN31 (que tienen p53 MT) son descrito en otra parte [3]. células PCI-13, que no tienen p53 endógeno, fueron diseñados para expresar
TP53
constructos de sobreexpresión (p53 en peso, A161S, G245D), que se genera y se inserta en un vector retroviral pBabe que contiene una inserción puromicina resistencia ( pBabe-puro; Addgene) mediante el uso de técnicas de clonación estándar. células HN31 fueron transfectadas con ARN corto horquilla (shRNA) específico para SIRT-1 (información silencioso regulador T1) o control mezclado shRNA a través de vectores lentivirales que contienen el gen puromicina resistencia de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. control de las células transfectadas lentiviral (HN31-C2) y su shRNA, estable contraparte SIRT-1-desmontables (HN31-S19) se aislaron mediante inmunotransferencia después de clones fueron seleccionados. β-actina se utilizó como control interno de carga.
anticuerpos y inmunotransferencia
Las proteínas y los niveles de expresión de proteínas fosforiladas se evaluaron por inmunotransferencia de lisados de células enteras a partir de células tratadas o no tratadas con RITA. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: p53 (DO-1) y fosfo-serina 15 de p53 de Santa Cruz Biotechnology; p21 de Calbiochem; p-p53 (Ser-15), modulador de p53 upregulated de la apoptosis (PUMA), murino doble minuto2 (MDM2), una kinasa de control 2 (Chk2), fosforilada Chk2 (p-Chk2, Thr68), SIRT1, y β-actina de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). De cabra anti-ratón y anti-conejo anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante se compraron de Señalización Celular y Santa Cruz Biotechnology, respectivamente.
Reactivos
RITA se adquirió de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI ) y la estaurosporina inhibidor de proteína quinasa se adquirió de Sigma (St Louis, MO). El inhibidor de SIRT1 Tenovin-6 se obtuvo de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX). RITA se disolvió en 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración madre de 50 mM y se almacena como alícuotas hasta su uso. La estaurosporina y Tenovin-6 se disolvieron en 100% de DMSO y agua, respectivamente, a las concentraciones stock de 1 M y se almacena como alícuotas hasta su uso.
ensayos de supresión del crecimiento
El ensayo de viabilidad celular ha sido descrito anteriormente [20]. Brevemente, las células 2000 /pocillo se sembraron en placas de 96 pocillos, se trataron con varias concentraciones de RITA por hasta 72 horas, y la viabilidad fue evaluada con un ensayo MTT. Para el ensayo de colonias de la formación de [3], las células HNSCC se sembraron en placas de 6 pocillos durante 24 horas, se trató con RITA, y se cultivaron durante 10-14 días. Las células se fijaron en una solución de formol /10% 3% violeta cristal y las colonias que contienen más de 50 células se contaron con el software ImageJ.
La senescencia-associated- β-galactosidasa tinción
La senescencia asociada- ß-galactosidasa (SA-β-gal) tinción se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Cell Signaling Technology). Brevemente, las células HNSCC se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con RITA a diversas concentraciones durante diversos tiempos (por lo general 5 días), después de lo cual se fijaron las células durante 10 minutos y se tiñeron para la actividad de SA-β-gal durante la noche a 37 ° C. Aplanadas y las células de color azul-tinción fue evaluado como senescentes y se presenta como un porcentaje del total de células observadas por campo de alta potencia.
Los análisis estadísticos
Los datos se agruparon para el análisis de varios experimentos independientes, y ensayos basados en células se realizaron por triplicado. Estudiante de dos colas de
t
se utilizaron pruebas para evaluar las diferencias en la senescencia y para otras comparaciones de grupos no apareados. Para todas las comparaciones,
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Efectos de RITA en p53 y p53 proteínas asociadas a
Se utilizó. un par de líneas de células isogénicas HNSCC, uno con p53 en peso (HN30) y el otro con MT p53 (HN31), para probar el efecto de RITA en la expresión y la fosforilación de p53 y otras proteínas relacionadas. RITA indujo fuertemente la fosforilación de p53 y p21 después de 12 horas en las células HN30 y después de 24 horas en las células HN31 (Fig. 1A). los niveles de proteína puma también fueron elevados después de 24 horas de exposición a RITA en ambas líneas celulares. Los aumentos en la expresión de p53, fosforilación de p53, y la expresión PUMA a las 24 horas eran dependiente de la dosis (Fig. 1B). Estos resultados indican que RITA puede activar abajo objetivos de la señalización de p53 en estas líneas celulares isogénicas con p53 en peso o MT.
(A y B) HN30 (p53 de tipo salvaje) y HN31 (p53 mutado) de cabeza y cuello las células de cáncer se trataron con RITA durante los tiempos indicados (a) y dosis (B) y la expresión de p53 y de sus objetivos se evaluaron por inmunotransferencia. (C) Las células fueron tratadas con RITA (0,1 M-20 M) durante 72 horas y se evaluaron a través de ensayo de MTT. Los datos se expresan como medias ± S.E de tres experimentos. Las células HN30 y HN31 (D) fueron tratadas con RITA a las dosis indicadas durante 10-14 días, tras los cuales se hayan fijado colonias, manchado, y cuantificadas. se muestran imágenes representativas de tres experimentos con resultados similares. Los datos cuantitativos se expresan como medias ± S.E de tres experimentos. * - Indica p & lt; 0,05 frente al control sin tratar
RITA inhibe el crecimiento de líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello
Varios estudios han RITA que puede inducir la muerte de células tumorales [15], [. ,,,0],18]. Inicialmente, hemos probado si RITA puede suprimir el crecimiento de células HN30 y HN31. El uso de un ensayo de proliferación celular a corto plazo, se encontró que RITA, a concentraciones de más de 5 M, inducida por la supresión modesto crecimiento tanto en las células HN30 y HN31 después de 72 horas de tratamiento continuo (Fig. 1C). En un ensayo de formación de colonias a largo plazo, RITA fue encontrado para reducir significativamente el número de colonias formadas por las dos líneas celulares a todas las dosis ensayadas (p & lt; 0,05). (Fig. 1D)
RITA induce senescencia en la cabeza y las líneas celulares de cáncer de cuello
anteriormente puso de manifiesto que el modo dominante de la respuesta a cualquiera de las concentraciones fisiológicamente relevantes de cisplatino [4] o dosis estándar de radiación [3] en el tipo salvaje líneas celulares CECC p53 no es la apoptosis. Del mismo modo, en el modelo actual, mínima y la caspasa PARP división se observó tras la exposición a RITA (Fig. 2A). Por lo tanto, para poner a prueba la hipótesis de que la respuesta anti-proliferativa observada de células HN30 y HN31 a RITA era al menos parcialmente debido a la inducción de la senescencia, analizamos la actividad de SA-β-gal, un marcador de la senescencia celular. Se encontró que RITA afectó la morfología celular y significativamente aumento de la tinción SA-β-gal en una forma dependiente de la dosis en ambas líneas celulares (p & lt; 0.05; Fig. 2B), lo que indica que el tratamiento RITA llevó a la senescencia acelerada en estas líneas celulares isogénicas.
(a) PARP y caspasa 3 división fueron examinados a través de Western Blot después de la exposición de las células a RITA a 1 M durante los períodos indicados. P, estaurosporina (1 M durante 8 horas) se utilizó como control positivo. (B) HN30 y células HN31 sembraron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos se trataron con las concentraciones indicadas de RITA durante 5 días, después de lo cual fueron fijadas y teñidas de asociada a la senescencia -β-galactosidasa (SA-β-gal) la actividad de las células . se muestran imágenes representativas de tres experimentos con resultados similares. En cada pocillo tratado o no tratado, se hicieron cinco selecciones campo aleatorio y el número de células con morfología senescente y con tinción de azul fueron contados bajo 20 aumentos (Olympus IX71). * - Indica p & lt; 0,05 frente al control sin tratar
estado de p53 y la inhibición del crecimiento mediada por RITA en líneas celulares HNSCC
A continuación, para investigar si la senescencia inducida por RITA depende del estado de p53. , se trataron las líneas celulares estables-p53 desmontables HN30-shp53 y HN31-shp53 con RITA y encontramos que desmontables de expresión de la proteína p53 reduce notablemente tanto la expresión como la fosforilación de p53 (Fig. 3). Sin embargo, la expresión de p21 de línea de base se mantuvo sin cambios en las células HN30 (p53 en peso) (Fig. 3A). Hemos encontrado además que la inhibición de p53 tenía sólo un efecto parcial de rescate en la inhibición del crecimiento inducida por RITA y la formación de colonias en las células HN30, y no tuvo ningún efecto significativo sobre rescate células HN31 (Fig. 3B). Por otra parte, desmontables p53 no afectó a la senescencia inducida por RITA en cualquier tipo de células con p53 desmontables (Fig. 3C).
(A) Los niveles de p53 total y fosforilada y p21 se midieron en HN30 y HN31 lentiviral- células transfectadas de control y su ARN corto horquilla, p53-estable-desmontables homólogos después del tratamiento con 1 mM RITA durante 72 horas. β-actina se utilizó como control interno de carga. (B) HN30 y HN31 lentiviral transfectadas las células de control y sus homólogos de p53-estable-desmontables fueron tratadas con RITA a las dosis indicadas durante 10-14 días, tras los cuales se hayan fijado colonias, manchado, y cuantificadas. se muestran imágenes representativas de tres experimentos con resultados similares. Los datos cuantitativos se expresan como medias ± S.E de tres experimentos. En todas las líneas celulares (control y sh53), el tratamiento RITA llevó a significativamente (p & lt; 0,05) disminuyó la formación de colonias en todas las dosis probadas. control de las células transfectadas lentiviral (C) HN30 y HN31 y sus homólogos de p53-estable-desmontables se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos y se trataron con las concentraciones indicadas de RITA durante 5 días, después de lo cual fueron fijadas y teñidas de células senescencia asociado -β-galactosidasa (SA-β-gal). se muestran imágenes representativas de tres experimentos con resultados similares. Con la excepción de 0,1 M en HN30-shp53, todas las dosis de RITA en todas las líneas celulares dieron lugar a significativamente (p & lt; 0,05) el aumento de SA-β-gal en comparación con el control sin tratar. No se observaron diferencias significativas entre el control y shp53 en cualquiera de las líneas de células.
A continuación, hemos probado si la reconstitución de p53 y p53 en peso tm en células PCI-13 p53 nula sería conferir susceptibilidad a RITA. Para estos experimentos, pBabe (control de vectores), p53 en peso, y los A161S y los constructos de p53 mutante G245D se reintrodujeron en células PCI-13 para producir los PCI-13-pBABE, PCI-13-WT, PCI-13-A161S y líneas celulares PCI-13-G245D. En contraste con las células p53 positivas, p53 y p53 fosforilada no se detectaron en las células de control pBabe PCI-13 (Fig. 4A). Además, p21 se expresó sólo por el peso de las células que expresan y por una de las células que expresan p53 mt (PCI-13-A161S). Células
(A) PCI-13 (p53 nula) que expresan el control de vectores o las construcciones p53 indicados fueron tratadas con RITA 2,5 M durante 72 horas después de lo cual se prepararon y niveles de p53 total y fosforilada lisados de proteínas y p21 se evaluaron por Western Blot. β-actina se utilizó como control interno de carga. (B) PCI-13 células que expresan los constructos indicados se sembraron en placas de 6 pocillos, se trató con RITA a las concentraciones indicadas, y se contaron en un ensayo clonogénico. Con la excepción de las células pBABE tratados en 0,25 M, todas las líneas celulares a todas las concentraciones ensayadas de RITA exhibieron disminuyó significativamente la formación de colonias en comparación con el control no tratado (p & lt; 0,05). (C) 13-PCI células que expresan los constructos indicados se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos y se trató con 0,25 M de RITA después de lo cual se fijaron y se tiñeron para la senescencia asociada -β-galactosidasa (SA-β-gal) células actividad . se muestran imágenes representativas de tres experimentos con resultados similares. Todas las líneas celulares exhiben una mayor significativamente tinción SA-β-gal en comparación con el control no tratado (p & lt; 0,05).
A largo plazo ensayo de formación de colonias (Fig. 4B) y SA-β-gal tinción (Fig. 4C) mostró que el crecimiento de células RITA inhibió significativamente y la senescencia inducida en todas las líneas celulares de PCI-13 independientemente del estado de p53, incluyendo la línea parental p53-null (p & lt; 0,05). Por lo tanto, no parece que la presencia de la proteína p53 que se requiere para RITA para ejercer sus efectos.
inducida por RITA respuesta al daño del ADN en líneas celulares HNSCC se asocia con la regulación a la baja de SIRT1
Rita es también se sabe que induce la respuesta al daño de ADN [21], [22]. Checkpoint quinasa 2 (Chk2) es un importante objetivo de aguas abajo de la respuesta al daño de ADN y conduce a la detención del ciclo celular, apoptosis, o la senescencia. Cabe destacar, que se activa Chk2 puede inducir la senescencia independiente de p53 en las células del cáncer [23], [24]. Estos resultados, con nuestro hallazgo de que RITA inhibe el crecimiento celular HNSCC y puede inducir la senescencia, incluso en ausencia de p53, nos llevó a investigar el efecto de RITA sobre la expresión de Chk2 y el estado de fosforilación. Se encontró que la proteína Chk2 se fosforiló en su sitio de activación, Thr68, después de la exposición a Rita en HN30, HN31 y células PCI-13, independientemente del estado de p53 (Fig. 5A).
(A) HN30 o HN31 células transfectadas con el control lentiviral o ARN corto horquilla, los constructos de p53-estable-desmontables se trataron con 1 M RITA 1 durante 72 horas, después de lo cual se prepararon y niveles de Chk2 total y fosforilada lisados de proteínas evaluada por inmunotransferencia. Derecha: células PCI-13 transfectadas con las construcciones indicadas fueron tratados con 2,5 M RITA durante varios periodos, después de lo cual se prepararon y niveles de Chk2 total y fosforilada la proteína lisados fueron evaluados. (B) HN30, HN31, y 13-PCI células con las construcciones indicadas p53 fueron tratadas con RITA para los períodos indicados, y los lisados se evaluaron para la expresión de la proteína SIRT1 por el Western Blot. β-actina se utilizó como control interno de carga. las células (C) HN31 establemente transducidas con vectores lentivirales de control (C) o SIRT1 shRNA (S) se ensayaron inicialmente para la inhibición de SIRT-1 de expresión. clones representativos fueron tratados con 2,5 M RITA durante 72 horas, después de lo cual fueron extraídos y analizados por Western Blot las proteínas indicadas. células (D) HN31 establemente transducidas con vectores lentiviral control (C2) o SIRT1 shRNA (S19) se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 6 pocillos y se trataron con las concentraciones indicadas de RITA durante 5 días, después de lo cual fueron fijadas y teñidas de senescencia células actividad -asociado -β-galactosidasa (SA-β-gal). se muestran imágenes representativas de tres experimentos con resultados similares. * - Indica significativamente mayor en comparación con el control de vectores a la dosis indicada (p & lt; 0,05). células (E) HN31 se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con RITA (0,25 M) con o sin Tenovin 6 (0,125 o 0,25 M) durante 10 días, tras los cuales se hayan fijado colonias, manchado, y cuantificadas. * - Indica disminuyó significativamente en comparación con el grupo que sólo Tenovin 6 a la dosis indicada. Se normalizaron los datos a cualquiera de solo vehículo o de tratamiento RITA condiciones. se muestran imágenes representativas de tres experimentos con resultados similares. Los datos se expresan como medias ± SE de tres experimentos.
A continuación, debido a Chk2 parece activar la senescencia celular mediante la inhibición de SIRT1 [25], y debido a la precipitación o la inhibición de la actividad de SIRT1 también puede inducir la senescencia similar detención del crecimiento en ausencia de p53 funcional [26] - [28], se evaluó la expresión de SIRT1 y encontró que RITA condujo a la disminución de la expresión de SIRT1 en todas las líneas celulares evaluadas, independientemente del estado de p53 (Fig 5B).
Para probar más este efecto, se evaluó si el agotamiento de SIRT1 por shRNA mejoraría el efecto biológico de RITA. Se encontró que la inhibición mediada por shRNA de SIRT1 disminución de los niveles de proteína SIRT1 y el aumento de los niveles de Chk2 fosforilados después de la exposición a RITA (Fig. 5C). Por otra parte, el tratamiento RITA sustancialmente mejorada tinción SA-β-gal en las células HN31-S19 (SIRT1 desmontables) en comparación con HN31-C2 células (control de transfección) (Fig. 5D). Finalmente, la combinación de RITA y el inhibidor de SIRT1 Tenovin 6 produjeron un crecimiento celular efecto inhibición sinérgica (Fig. 5E). En conjunto, estos resultados sugieren que RITA puede inhibir la expresión de SIRT1 y que este efecto contribuye a la senescencia inducida por RITA.
RITA aumenta la radiosensibilidad de los mutantes de p53 expresión HNSCC
Sobre la base de nuestra anterior conclusión que radiosensibilidad de las células HNSCC está fuertemente relacionada con su capacidad para someterse a la senescencia después de la irradiación, específicamente que las células MT p53 HN31 son resistente a la radiación y tienen niveles bajos de la senescencia inducida por la radiación, y nuestros resultados actuales que RITA disminución de la viabilidad y aumentó la senescencia en células HN31, se investigó si RITA podría actuar como un radiosensibilizador. Se encontró que el pretratamiento de las células HN31 con RITA durante 24 horas seguido de la irradiación como resultado una inhibición sinérgica del crecimiento de células, cuando se compara la IC80 (Fig. 6A). En concreto, el mutuamente no exclusiva índice combinatoria (IC) se calculó usando el método de Chou & amp; Talalay [29]. La combinación de RITA y la radiación resultó en un CI de 0,50, con un IC de menos de 1 indica sinergia.
células (A) HN31 se sembraron a 1000 células /pocillo en placas de 6 pocillos, se trató con RITA durante 24 horas, y se trató con 2 Gy de radiación. El número de colonias se contaron y se usan para calcular la fracción superviviente. Los resultados se presentan como un isobolograma estándar, con la línea continua que representa un efecto aditivo y los puntos que representan la dosis que provoca una inhibición del 80% (IC80) (B) mecanismo de acción de RITA propuesto en el contexto de diferentes estado de la mutación de p53.
Discusión
Hemos encontrado en el presente estudio que RITA podría inhibir el crecimiento e inducir la senescencia en células HNSCC, incluso en ausencia de p53 o en el contexto de agotamiento de la expresión de p53, y que este fenómeno se asocia con aumento de la activación Chk2 y depende, al menos en parte en SIRT1. Estos resultados están en contraste con estudios previos que muestran que las funciones de RITA principalmente a través de la inducción de la apoptosis a través de la activación de la señalización de p53; más bien, nuestros resultados indican que RITA puede conducir a la senescencia en células HNSCC entre otros efectos, no es totalmente dependiente de la expresión de p53.
Aunque muchas de las vías de señalización implicadas en la senescencia están mediadas por p53, en particular en el contexto de fosforilación de p53, la senescencia también puede ocurrir en ausencia de esta proteína, lo que sugiere que los mecanismos independiente de p53 también puede mediar la senescencia inducida por el tratamiento de las células tumorales [30] - [34]. Por ejemplo, doxorrubicina fue mostrado para inducir un fenotipo senescente en las células Saos-2 p53 null, en SW480 y las células U251 que expresan p53 mutante, y en HeLa y 2 HEp-líneas de células, en el que la función de p53 se ha inhibido [35 ].
Otros grupos han informado de que RITA no sólo puede inducir p53 sino también inducir una respuesta concurrente daño en el DNA [21], [22]. La respuesta al daño del ADN implica dos importantes vías de señalización, el sensor quinasas ataxia telangiectasia mutada (ATM) y ataxia telangiectasia y la relacionada con Rad3 (ATR). Estas quinasas se activan las quinasas efectoras aguas abajo Chk2 y Chk1. Chk2 puede desencadenar la senescencia replicativa a través de p53 /p21 u otras vías en respuesta a la disfunción de los telómeros y el daño del ADN [36]. Recientemente, se demostró Chk2 para modular la respuesta celular a RITA [22]. Nuestros resultados que el tratamiento RITA dio lugar a un aumento de la fosforilación Chk2 independientemente del estado de p53 son consistentes con esta observación (Fig. 5).
En condiciones de estrés celular o daño en el ADN, la activación Chk2 puede conducir a una reducción de la SIRT1 expresión y la senescencia [25]. SIRT1 es una histona desacetilasa muy conservadas que se sabe que median el metabolismo celular, el envejecimiento, y la respuesta al estrés [37]. La sobreexpresión de SIRT1 se ha demostrado que inhibe la senescencia celular en una variedad de diferentes tumores malignos [38]. Además, SIRT1 se sobreexpresa en células quimiorresistentes, y la inhibición de SIRT1 puede suprimir el crecimiento tumoral en algunos modelos [27], [38] - [40]. De hecho, en el presente estudio se encontró que inhibe la expresión de SIRT1 RITA en todas las líneas celulares ensayadas, independientemente del estado de p53 (Fig. 5B). Además, el tratamiento con un inhibidor de SIRT1 o SIRT1 específica shRNA condujo a disminuciones en el crecimiento y el aumento de la senescencia en conjunción con el tratamiento RITA. Aunque la inhibición de SIRT1 se piensa para inducir la senescencia principalmente mediante la interacción con p53, al menos un grupo ha demostrado que la doxorrubicina puede inducir la senescencia en células SCC que carecen de p53 a través de la inhibición de SIRT1 [26]. Además, un grupo ha informado de que la inhibición de SIRT1 puede inducir senescencia en H1299 (p53 null) a través de disminución de la actividad en la señalización Ras /MAPK. Estas observaciones pueden proporcionar un enlace a los efectos observados de RITA, incluso en las células que carecen de la proteína p53 HNSCC. Sobre la base de los hallazgos del presente estudio, así como el trabajo de otros, proponemos que RITA induce la detención del crecimiento y senescencia por al menos dos vías diferentes (Fig. 6B). En las células p53-competente, RITA probable actúa principalmente a través de p53 objetivos canónicas, que es el efecto dominante de la droga. El resultado final de esta activación puede ser la apoptosis o senescencia en función del contexto. A la inversa, una, pero todavía menor efecto significativo sobre la viabilidad celular se ve en p53 líneas celulares defectuosas. Sin embargo, en ausencia de p53 funcional o cualquier proteína p53, RITA parece ejercer al menos algunos de sus efectos a través de la activación de la respuesta al daño del ADN y la inhibición de la expresión de SIRT1. La naturaleza exacta de esta doble función se requieren más estudios.
previamente Vinculamos respuesta a cisplatino y radioterapia con la inducción de la senescencia, lo que demuestra que las células que son más resistentes a estos medicamentos también son resistentes a la inducción de la senescencia [3 ], [4]. Aunque la conveniencia de la senescencia inducida por el tratamiento como una respuesta a las terapias utilizadas clínicamente es una cuestión de debate significativo [41], para tipos de células que son altamente resistentes a otras formas de muerte celular o detención, la senescencia puede ser un resultado terapéutico alternativo. Nuestro hallazgo de que dosis bajas de RITA (0,1-0,5) podrían sensibilizar selectivamente las células HNSCC altamente resistentes a la terapia in vitro [3] sugiere que la adición de RITA puede llegar a ser una estrategia viable para la sensibilización de los tumores a la radiación, el tratamiento más utilizado para la CECC.
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a Mei Zhao por su valiosa asistencia técnica.