Extracto
Orientación de Kras oncogénicas a las células progenitoras embrionarias que expresan nestina pancreáticas y, posteriormente, al adulto compartimento de células acinares y nestina expresando es suficiente para el desarrollo de la neoplasia intraepitelial de bajo grado de páncreas (PanIN) entre los 2 y 4 meses. Los ratones mueren alrededor de 6 meses de edad por causas no relacionadas, y por lo tanto no es posible evaluar si las lesiones progresan a carcinoma. Ahora informe que dos breves episodios de pancreatitis aguda ceruleına inducida en ratones de 2 meses de edad, hace que la progresión PanIN rápida y el desarrollo de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) a los 4 meses de edad. Estos eventos se producen con una frecuencia similar a la observada en animales donde el oncogén se segmenta durante la embriogénesis a todos los tipos de células pancreáticas. Por lo tanto, estos datos muestran que Kras impulsada PanIN originarios de un compartimento no ductal oncogénicos pueden progresar rápidamente a PDAC cuando se someten a una breve insulto inflamatorio
Visto:. Carrière C, AL joven, Gunn JR, Longnecker DS , Korc M (2011) la pancreatitis aguda acelera el inicio y la progresión de cáncer de páncreas en ratones que expresan oncogénicos Kras en el linaje de células nestina. PLoS ONE 6 (11): e27725. doi: 10.1371 /journal.pone.0027725
Editor: Wafik S. El-Deiry, Instituto de Cáncer de Penn State Hershey, Estados Unidos de América
Recibido: Junio 7, 2011; Aceptado: 23 de octubre de 2011; Publicado: 28 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Carrière et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de: El Instituto Nacional del cáncer: CA- R37-075059 a Murray Korc y CA-127,095 a Catalina Carrière; La Fundación Lustgarten para la Investigación del Cáncer de páncreas con Catalina Carrière. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) representa más del 95% de todas las neoplasias pancreáticas exocrinas y es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos, con una supervivencia media de 6 meses [1]. En los últimos 30 años, las tasas de supervivencia de los pacientes no han mejorado sustancialmente, y PDAC sigue siendo intratable en sus últimas etapas. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos enfoques para la detección precoz de la PDAC, así como nuevas terapias dirigidas a las etapas tempranas de cáncer. Los modelos de ratón de PDAC que recapitular el cáncer humano tienen el potencial para avanzar en nuestra comprensión de los primeros eventos en el desarrollo del cáncer.
PDAC es ahora reconocido que surjan en su mayor parte a través de la progresión de la neoplasia intraepitelial pancreáticas (PanIN), que van desde baja (PanIN-1A, 1B) de altas calidades (PanIN-2, -3), PanIN-3 que representa el carcinoma
In situ
y el precursor inmediato de adenocarcinoma ductal [2]. Esta progresión histológica se correlaciona con la acumulación de alteraciones genéticas de los que las mutaciones que conducen a la activación constitutiva de KRAS son los primeros y más común (95%) [3]. Los primeros modelos de ratón de la PDAC relevantes fueron generados por la orientación de una forma condicional mutado
Kras
alelo (
Kras
G12D
) para progenitores pancreáticos tempranas (usando Pdx1 y PTF1A promotores) y, posteriormente, a todos tipos de células pancreáticas [4], [5]. Estos modelos recapitulan fielmente el espectro completo de la progresión PanIN desarrollo humano y el cáncer de páncreas, lo que demuestra que Kras oncogénicos expresión es suficiente para la iniciación PDAC. Para delinear las células de origen del PDAC, varios modelos fueron desarrollados posteriormente en Kras mutado fue dirigida a las poblaciones de células embrionarias o adultas más restringidas. Se utilizó un controlador nestina-Cre para apuntar Kras
G12D a células acinares y (nestina-Cre; LSL-Kras
G12D o N ratones /K) nestina expresar (Fig. 1A), mientras que otros dirigidos Kras oncogénicos a la acinares o sólo las células acinares /centroacinares con diferente elastasa-Cre y conductores mist1-Cre [6], [7], [8], [9]. En todos estos modelos, se pudieron observar la iniciación y la progresión PDAC, demostrando que PDAC puede tener un origen no ductal en ratones. Aunque un estudio reciente sugiere que PDAC podría iniciar en el compartimiento endocrino, se ha demostrado que el promotor usado en este estudio también podría apuntar a una pequeña fracción de las células acinares [10], [11]. En todos los modelos en los que oncogénico Kras se activó durante la embriogénesis, PanINs bajo grado desarrollados, generalmente progresa en 8-12 meses de lesiones de alto grado y PDAC. No fuimos capaces de observar la progresión a PDAC en ratones N /K, ya que generalmente mueren en torno a la edad de 6 meses, a partir de las complicaciones del sistema nervioso central.
(A) Esquema del condicional Kras
alelo G12D. En ausencia de la recombinasa Cre, solamente WT Kras se expresa; una vez Cre se expresa, la región de parada se escinde y se Kras
G12D queda expresado. (B-E) en ratones nestina Cre /R26R, LacZ tinción se observó sólo en las células acinares (B), y está ausente en células ductales (puntas de flecha) e islotes (I). (C) Superposición de LacZ inmunotinción (E) con CK19 (D) demuestra que las células ductales no están orientados. (F) Pdx1-Cre conduce a la expresión de Kras
G12D en todos los tipos de células pancreáticas mientras nestina-Cre impulsa la expresión de Kras
G12D sólo en las células acinares. Barra de escala: 20 micras
La activación de Kras
G12D en el páncreas adulto llevó a no progresar la formación de lesiones de bajo grado [7], [8], [12].. Sin embargo, después de la inducción de la pancreatitis crónica, estos animales desarrollaron lesiones de alto grado y progresaron a PDAC [7]. Estos datos son consistentes con estudios epidemiológicos que muestran que los pacientes con pancreatitis crónica tienen un riesgo 16 veces mayor de desarrollar cáncer de páncreas [13]. Aunque breves episodios de pancreatitis aguda (PA) conducen a la progresión PanIN rápida y una mayor frecuencia de PDAC en Pdx1-Cre; LSL-Kras
ratones G12D [14], [15], [16], no se sabe si también llevaría a PDAC en el modelo de ratón impulsada por nestina. Ahora muestran que los ratones N /K, cuando se somete a dos episodios de AP caerulein inducida, rápidamente se desarrollan PanINs de alta calidad que tienen la capacidad para pasar a PDAC. Este estudio confirma que la lesión pancreática aguda tiene el potencial de contribuir al desarrollo PDAC en modelos de ratón con sede en Kras y apoyar la hipótesis de que puede surgir PDAC en el linaje de células nestina.
Resultados
nestina progenitora células no dan lugar a células ductales
Hemos demostrado previamente que los progenitores pancreáticos nestina expresar embrionarias dan lugar a células acinares y no endocrinos o células centroacinares, mientras que la contribución potencial de las células ductales no estaba completamente excluida [ ,,,0],6]. Para resolver este problema, varios experimentos de rastreo de linaje se realizaron por la cría de la línea de ratón que expresa la recombinasa Cre bajo el control de elementos reguladores Nestin [17] con la línea de ratón reportera R26R. Esta última línea lleva el gen de β-galactosidasa (LacZ) bajo el control del promotor ubicuo R26 y una región de parada transcripcional rodeado por sitios LoxP (LoxP-Stop-LoxP o LSL) [18]. En los ratones dobles transgénicos, la expresión de LacZ se activa siguiente recombinación mediada por Cre en las células que expresan nestina embrionarias (enfoque similar al descrito para Kras en la Fig. 1A). Posteriormente, mediante la transmisión genética, todas las células derivadas de los progenitores nestina que expresan expresan LacZ. Secciones de todo el páncreas de los animales nestina Cre /R26R a los 2 meses de edad fueron teñidas para la actividad LacZ. Como se observó antes, el transgén nestina-Cre permitió la orientación de ~ 70% de las células acinares (Fig. 1B). Se observó tinción de LacZ sólo en estructuras acinares, nunca en el ductal, endocrino o células centroacinares (Fig. 1B) y co-inmunofluorescencia con la citoqueratina marcador ductal 19 (CK19) confirmó esta observación (Fig. 1C-E). Estos resultados demuestran que los progenitores de embriones que expresan Nestin pancreáticas no dan lugar a células ductales (Fig. 1F). La expresión de LacZ también se observa raramente en tipos de células no parenquimatosas pancreáticas, tales como células endoteliales y mesenquimales (no mostrado).
pancreatitis aguda acelera drásticamente progresión de la lesión en N /K páncreas
Entre 2 a los 6 meses, los ratones N /K desarrolló PanINs de bajo grado en un número limitado (2-10 lesiones aisladas o pequeños focos por sección), así como zonas limitadas de acinar ductal de metaplasia (ADM) (Fig. 2A-B, G) similar a lo que se observa en Pdx1-Cre; LSL-Kras
G12D (P /K) los ratones [4], [14]. Mientras que con el tiempo P /K ratones pueden desarrollar PDAC, pero a muy baja frecuencia, los ratones mutantes N /K raramente sobrevivido más allá de 6 meses debido a problemas neurológicos graves, impidiéndonos tras una posible progresión a cáncer de páncreas.
( a-F) H & amp; E tinción de 4 meses de edad N /K páncreas: (a-B) del páncreas no tratada presentan lesiones de bajo grado raras (*), (B) la inserción de (a) muestra una lesión única PanIN-1A; lesiones (C-F) ceruleına-tratada páncreas muestran displasia extensa con una mezcla de baja (*) y de alto grado (punta de flecha) (D, inserción de C) y (E), así como focos ADM (marcados por la línea de puntos )(F). (G) El análisis morfométrico mostrar un aumento espectacular en el número de animales que presenten lesiones y áreas de microinvasión PanIN de alto grado en los páncreas ceruleına tratados. (H) Los aumentos significativos en la proliferación se observan en tratados caerulein páncreas (* P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01). Barra de escala: 50 micras
Hemos demostrado previamente que dos episodios de pancreatitis aguda (PA) inducida por ceruleına aceleran la progresión PanIN de baja a alta calidad y aumento de la frecuencia en el PDAC P /K. modelo de ratón [14]. Para poner a prueba la posibilidad de que la activación de Kras mutado en el linaje nestina podría conducir a PDAC, una cohorte de ratones N /K 17 2 meses de edad fueron sometidas a tratamiento ceruleína. Caerulein es un análogo de la colecistoquinina (CCK) que se une a y activa el receptor CCK [19], [20]. Mientras que la dosis del fármaco que utilizamos es bajo en comparación con los utilizados por otros grupos [21], [22], se observó una gran pérdida de células acinares en ratones de tipo salvaje a las 24 y 48 horas después de la AP, concomitante con una infiltración inflamatoria dramática y la expansión intersticial (Fig.S1) como se ha descrito por otros [21], [22], [23]. Una semana después de AP, se observó la regeneración casi completa del páncreas a nivel histológico, con infiltrados inflamatorios residuales raras mientras que los niveles de proliferación se mantuvo alta, como se muestra por la expresión de Ki67 en las células acinares (Fig.S1A-D). Estos resultados son consistentes con otro informe publicado [15]. Para evaluar la posibilidad de que después de una lesión pancreática, la expresión de nestina puede ser detectada en diferentes tipos de células pancreáticas, se realizaron experimentos de rastreo de linaje corto plazo. LacZ tinción en nestina Cre /R26R páncreas, 1 semana de post caerulein tratamiento, se observó sólo en estructuras acinares y no se detectó tinción en endocrino, centroacinar o células ductales (no mostrado).
Todo 17 caerulein tratada ratones N /K comenzado enfermarse cuando eran alrededor de 4 meses de edad, 2 meses después del tratamiento, y tuvo que ser sacrificado. Seis animales se perdieron sin necropsia. Por el contrario, sólo 3 de 9 ratones sin tratar N /K murieron y ninguno de los otros fueron sacrificados debido a la enfermedad durante este período. /K ratones P cuando se somete a AP no tenía más corta la esperanza de vida de los ratones no tratados al menos durante un período de 8 meses (no se muestra). Estas observaciones sugirieron que la disminución en la supervivencia global de los ratones N /K de 6 a 4 meses no estaba directamente relacionada con la insuficiencia pancreática. Cuatro meses de edad, páncreas N /K exhibió pocos PanIN-1A y 1B y focos raros ADM (menos de 5% de la sección) (Fig. 2A, B y G). Dos meses después de la ceruleına-AP inducidos se observó displasia pancreática extensa en N /K páncreas caracterizada por una mezcla de bajo y alto grado PanIN y grandes focos ADM (Fig. 2C-F). El aumento en el grado de la lesión y la amplia ADM fueron documentados por análisis morfométricos que en comparación la presencia y el grado de las lesiones entre las secciones de los ratones N /K tratados y no tratados. Aunque la mayoría de las secciones de no tratada N /páncreas K mostraron lesiones de bajo grado y sólo menos del 5% de la sección presentada ADM, la mayoría páncreas caerulein-tratado mostró aumentos significativos en PanIN-2 y -3 (P & lt; 0,0002), así como extensa ADM que cubre 15 a 95% del páncreas (Fig. 2G). Estos hallazgos son similares a los que hemos observado en una cohorte paralela de P /K sometido a 2 meses de edad, inducida por ceruleína a AP (Fig.S2); ratones P /K se sacrificaron 6 meses post-tratamiento (a la edad de 8 meses) que explica las tasas más altas de lesiones de alto grado y PDAC /microinvasión tanto en los ratones tratados y no tratados. Como se observa en los ratones N /K, todos los P ceruleına tratados /ratones K muestran extensa ADM que cubre 25-95% de las secciones (P & lt; 0,001) y la progresión dramática de lesiones de alto grado y PDAC (Fig.S2). Por el contrario, en todos los animales de control (de tipo salvaje o llevar una sola mutación, nestina Cre, Pdx1-Cre o LSL-Kras
G12D solamente) tratados con caerulein, el páncreas parecía ser normal con trazas de vez en cuando residuales de la inflamación ( no presentados).
Las lesiones de bajo grado en N /K páncreas mostraron un índice de proliferación del 13% ± 3% similar a lo que se observa en los ratones P /K [4]. Las lesiones de alto grado observados después ceruleína tratamiento que se muestra como se espera un alto índice de proliferación (55% ± 3%), pero curiosamente las lesiones de bajo grado también mostraron un índice de proliferación superior al 31% ± 4% (Fig. 2H, S3 A). Por lo tanto, el aumento general de la proliferación observada en el páncreas inmediatamente siguientes episodios AP [21] se mantuvo 2 meses después de la lesión, pero sólo en las lesiones neoplásicas en la presencia de un alelo Kras activado.
Como se observa en PDAC humana muestras, PanINs expresaron alto nivel de CK19, lo que subraya su naturaleza epitelial, muestran la acumulación de moco como se muestra por la expresión Muc5a (Fig.S3B-C), y fueron rodeados por estroma rico en colágeno (Fig. S3F). Las lesiones mostraron una reactivación de la temprana progenitora pancreática Pdx1 marcador, así como el marcador de señalización Notch Hes1, ambos conocidos por ser reactivado en las primeras etapas de la PDAC (Fig.S3D-E). ADM fue demostrado por la co-expresión de marcadores acinares y ductales en las mismas células (Fig.S3G-I) como se ha observado por otros [24]. Estos datos confirman que ceruleına inducida por AP no afecta a la naturaleza de las lesiones a nivel molecular, pero acelera su progresión a alto grado.
Se ha demostrado recientemente que el mediador inflamatorio Stat3 y la interleuquina IL-6 fueron colaboradores esenciales a la progresión y el desarrollo PanIN PDAC al menos en las primeras etapas de la enfermedad y fueron componentes esenciales para la respuesta aguda a caerulein inducida por AP [16], [25]. El análisis inmunohistoquímico en N /K páncreas mostró que fosfo-Stat3 todavía estaba altamente expresado 2 meses después de la AP (Fig. 3), mientras que no se detectó IL6 (no mostrado). Fosfo-STAT3 se había demostrado ser altamente activado en PanINs inmediatamente después de episodios de AP [16], [25]. Sin embargo, dos meses más tarde fosfo-Stat3 no parece que se expresa en las propias lesiones pero se detectó en abundancia en las células inflamatorias, en focos ADM y en grupos de células acinares de apariencia normal (Fig. 3A-D). De manera similar, en los ratones N /K no tratados, fosfo-Stat3 rara vez se detecta y sólo en las células que rodean las PanINs (no mostrado).
(A-D) IHC para fosfo-Stat3 en N /K páncreas 2 meses publicar ceruleına tratamiento. (A) Imagen de baja magnificación de un área representativa. Fosfo-Stat3 rara vez se expresa en el desarrollo de lesiones PanIN pero no se observa en las células que muestran una morfología ductal normal (B, flechas); (Que se expresa principalmente en las células inflamatorias (C), en células sometidas a ADM (C, D, flechas), así como en las células acinares morfológicamente normales (D, puntas de flecha) Barra de escala:.. 20 micras
activación oncogénica Kras en el linaje de células nestina conduce a PDAC desarrollo
en medio de los ratones sometidos a AP, áreas de microinvasión se pueden observar en el páncreas como se muestra por la pérdida de la membrana basal en algunas PanIN- 3 (Fig. 4A-B) y la expresión de CK19 en las células en el estroma adyacente (Fig. 4C). a partir de un pequeño grupo de 4 animales N /K tratado con caerulein en etapas posteriores (4 meses de edad), 3 sobrevivió hasta la edad 6 meses y de estos, 2 muestran tumores (diámetro ~ 5 mm) visible en el nivel anatómico bruto. Sólo un tumor estaba disponible para el análisis histológico, se presentan la característica morfológica de PDAC, y revelando la invasión local de los tejidos grasos y fibrosos (Fig . 4D). a pesar de que los núcleos eran ampliada y lleno de gente, una morfología glandular y se mantuvo bajo a PanINs de alto grado, también se observaron (Fig. 4E-F). Grandes áreas de páncreas muestran extensa ADM (no se muestra). Como se observa en PDAC humano, los tumores fueron altamente proliferativa como se muestra por la expresión de Ki67 (Fig. 4G) y rodeado por estroma visiblemente reactiva caracterizado por la expresión actina de músculo liso (SMA) (Fig. 4H). Si bien se observó también niveles elevados de Cox2 en PanINs, su expresión fue baja en las células cancerosas, que es sorprendente, ya que se sabe que está aumentada en PDAC humana (Fig. 4E).
Las lesiones de alto grado muestran microinvasión (a, puntas de flecha) y (B) como se muestra por la expresión de CK19 (sección adyacente) en las células en el estroma adyacente (C); (D) bajo aumento muestra la invasión local de grasa y tejido fibroso (flechas). (E) Los núcleos se agrandan, se mantiene la morfología lleno de gente y glandular. (F) PanINs de bajo grado (estrellas) se observan en la proximidad con adenocarcinoma (flechas). células (G) Adenocarcinoma son altamente proliferativa como se muestra por la expresión de Ki67. Están rodeados por estroma reactivo caracterizado por la expresión de SMA (H). COX2 expresión mientras lo alto de las PanINs (flechas) es ausente de la adenocarcinoma per se (puntas de flecha) (I). Barra de escala: 20 micras
nestina se expresa en humanos y ratón PanIN
Después de AP, el páncreas sufre intensa proliferación y regeneración, y el aumento de la expresión de nestina haber sido observado por diferentes. grupos [26], [27]. No está claro si este incremento se produce a través de una expansión de una población ya existente de adultos células nestina que expresan o se debe a una expresión transitoria de nestina en dedifferentiating y la proliferación de células acinares. Vamos a demostrar que por inmunohistoquímica nestina se expresa constantemente en el ratón PanIN de bajo a alto grado, así como en PanINs humanos y PDAC (Fig. 5)
(A-D) PanIN humano.; PanIN ratón en NK (E-G) y PK (I-K). Superposiciones de CK19 (verde), nestina (rojo) y Hoechst (azul) muestran clara co-expresión de nestina con CK19 en las lesiones (A, E, I). Por el contrario, en los conductos normales, solamente CK19 se expresa (flechas) (H, L). (D) En el tejido humano, el anticuerpo secundario solo genera alto fondo en el estroma, pero ninguna expresión en PanIN (flecha). Barra de escala:. 20 micras
Discusión
Hemos demostrado previamente que N /K y el P /K modelos de ratones desarrollan PanINs de bajo grado con calendario similar y eficiencia entre los 2 y 4 meses de la edad [6]. Estos datos sugirieron que la iniciación PDAC se produjo principalmente en el linaje de células nestina, que consiste en el páncreas de las células acinares y células que expresan nestina pancreáticas rara adultos. Sin embargo, la supervivencia limitado de los ratones N /K pasado 6 meses nos impidió la búsqueda de la comparación a la etapa PDAC. En el presente estudio, mostramos que dos episodios cerca de AP ceruleına inducida en ratones NK2 meses de edad, no sólo causan una rápida progresión PanIN de baja a alta calidad, sino también con una baja frecuencia conduce a PDAC. La eficiencia de la progresión de nuevo parece similar a la observada en P /ratones K siguiente caerulein inducida por AP [14]. Estos datos demuestran que los ratones N /K son un modelo de buena fe de PDAC, y más apoyo que el linaje nestina de páncreas es el linaje celular que es sobre todo sensible a la mutación KRAS en el páncreas.
La focalización de Kras oncogénicos al compartimiento acinar, el uso de diferentes promotores-acinares específica también conduce al desarrollo en ratón adulto de PanINs [8], [9] y poco frecuentes PDAC invasiva [7]. En los ratones N /K, Kras
G12D se activa en las células acinares, así como en adultos células nestina que expresan. Estas células posteriores representan menos del 0,1% del páncreas totales, aparecen integrado en la estructura acinar pero no se muestran marcadores de diferenciación (manuscrito en preparación, CC y MK). En esta etapa, su función sigue siendo desconocida. Es importante señalar que los elementos reguladores Nestin utilizados para estos experimentos se dirigen a todas las células que expresan nestina en el animal [17]. Cre expresión se puede remontar de vez en cuando en las células endoteliales y mesenquimales, pero no hay datos en la literatura que sugiere que el cáncer de páncreas podría iniciar en las células no parenquimatosas. Por lo tanto se toman juntos, estos datos proporcionan una fuerte evidencia de un origen de células no ductal de PDAC al menos en el ratón.
Progresión de PanIN al cáncer se acelera drásticamente cuando los ratones son sometidos a agresiones ambientales, tales como la pancreatitis crónica [7], [10]. Estos datos se correlacionan con los estudios epidemiológicos humanos que muestran que la pancreatitis crónica aumenta el riesgo de desarrollar PDAC [13]. Nuestros datos y otros muestran que caerulein inducida por AP actúa como promotor de cáncer en modelos de ratón PDAC [14], [15], [16], lo que sugiere que AP, cuando se producen en un individuo cuyo páncreas alberga una mutación Kras, podría aumentar potencialmente PDAC riesgo.
Por qué mecanismos afecta AP progresión del cáncer? La recuperación de AP en los seres humanos no necesariamente conduce a un daño irreversible y puede estar asociada con la regeneración de páncreas [28] como se observa en el ratón. Durante los 3 primeros días después del tratamiento ceruleına, el páncreas de ratones desarrollan estructuras tubulares en lugar de acinos [23], y el linaje rastreo de experimentos utilizando el promotor de la elastasa sugieren que parte de estas estructuras tubulares se derivan de las células acinares que parecen dedifferentiate, yendo a través de un estado intermedio de metaplasia ductal-como antes de entrar en la proliferación [23], [29]. Las nuevas células acinares se originan entonces esencialmente a partir de células preexistentes acinares [22], [23], [29] y tienen que someterse a una ductal metaplasia secundaria a acinares (DAM), un paso esencial para la regeneración del páncreas [15]. Curiosamente, a raíz de AP, las células acinares que expresaban Kras oncogénicos murieron o ADM fueron sometidos. Entre las estructuras acinares sometidos a ADM, algunos apareció para dar lugar a PanIN, al menos durante el corto periodo en el que se analizaron los ratones [15]. la regeneración del páncreas también parecía estar estancado lo que sugiere que las células Kras
G12D-expresando que se sometieron a ADM no fueron capaces de someterse al proceso inverso DAM para generar nuevas células acinares [15]. Se observó la formación de PanIN ADM /de bajo grado extensa tanto en K y N /K páncreas /P en los 2-6 meses después de AP a discutir de nuevo que gran número de células pancreáticas responder a oncogén de activación. Sin embargo, solamente pocas lesiones de grado superior pueden ser detectados. Se sugiere que mientras la mayoría de las células acinares responden en cierta medida a la oncogénico Kras siguiente AP ceruleına inducida por sometidos a ADM, que no son competentes para progresar a lesiones de grado superior y PDAC.
nestin expresión está regulada positivamente en diferentes modelos de regeneración páncreas y nestina se ha propuesto como un marcador de transitorios de desdiferenciación acinar [26], [29]. También se conoce como un marcador de células madre, tanto durante la embriogénesis y la edad adulta en diferentes órganos. Entonces se podría especular que los adultos de páncreas células nestina que expresan están en progenitores acinares hecho de adultos y que la regeneración páncreas siguiente AP se produce en parte a través de la expansión de estos progenitores. Como tal, las células adultas nestina expresar serían potencialmente ser más competentes para la iniciación y progresión del cáncer después de la proliferación inducida por AP, como se sugiere por la expresión de nestina en todas las lesiones de grado tanto en humanos y en ratones. Serán necesarios más experimentos para evaluar estas posibilidades.
Un trabajo reciente mostró que el mediador inflamatorio STAT3 se activa en todas las etapas de cáncer de páncreas de bajo grado PanIN a PDAC y es necesario para la progresión del cáncer [25], [ ,,,0],30]. AP causa la activación de Stat3 transitoria en páncreas normal. En P /K ratones, inducida ceruleına-AP conduce a una mayor regulación por incremento de fosfo-STAT3 tanto en las lesiones neoplásicas y el microambiente que rodea a las 2-3 semanas después de su inducción. De hecho, fosfo-STAT3 ha demostrado ser directamente responsable de la progresión neoplásica acelerada en ratones P /K siguiente AP [16]. En nuestro modelo de dos meses después de la AP, fosfo-STAT3 se detectó sólo en raras ocasiones en PanINs. En contraste, se expresa principalmente en las células inflamatorias de los alrededores, y en focos ADM, así como en pequeños grupos de células acinares histológicamente normal. Estas observaciones sugieren que la activación de Stat3 podrían estar involucrados en los procesos de metaplasia como los pasos de iniciación en la transformación neoplásica. El hecho de que extensas áreas de ADM todavía se observan después de 2 meses también sugiere que se requieren otros eventos para el ADM para el progreso de PanIN. Los niveles elevados de Kras
actividad G12D podrían ser un componente esencial de esta progresión [31], [32].
Estudios recientes mostraron que PDAC crece lentamente durante varias décadas y metástasis sólo en las etapas finales de los años "" [ ,,,0],33], [34]. Esto sugiere que la detección temprana y la prevención podrían ser los enfoques más valiosas para hacer frente a este tipo de cáncer altamente letal. Definición de los tipos de células en las que el cáncer puede iniciar, así como la comprensión de los mecanismos por los que las lesiones ambientales pueden afectar a la progresión del cáncer son ambas esenciales para estos enfoques.
Materiales y Métodos
Se aprobaron todos los experimentos con animales por el Cuidado y uso de Animales institucional en el Dartmouth College, número de protocolo:. 07/09/07
ratón generación colonia
la LSL-Kras
G12D (01XJ6-B6; 129 -Kras2) ratones
tm4Tyj fueron generados por DA Tuveson y T. Jacks [35] y obtenido a partir de MMHCC, el NCI. Los ratones nestina Cre (B6.Cg-TG (Nes-cre) 1
Kln /J) generado por R. Klein [17] fueron adquiridos de The Jackson Laboratory. ratones Pdx1-Cre fueron un regalo de G. Gu [35]. Todos los genotipos se realizaron por PCR siguiendo las condiciones de los proveedores. Dos episodios de pancreatitis aguda fueron inducidos por una serie de siete inyecciones intraperitoneales por hora de caerulein dado en 2 días consecutivos, como se describe [14]. Caerulein (Sigma, St. Louis MO) se diluyó en PBS y se inyecta en una dosis de 50 mg /kg de peso corporal. Un segundo grupo de mutantes y de control de los animales compuestos recibió inyecciones de solamente PBS. Todos los animales se mantuvieron en ayunas durante 12 horas antes del experimento.
Histología e inmunohistoquímica
Los ratones fueron perfundidos con PBS luego 10% de formalina /PBS y los páncreas diseccionado. Para la tinción βGalactosidase, los tejidos se transfieren directamente después de la perfusión en 30% de sacarosa a 4 ° C, y 24 horas más tarde cryoembedded en el compuesto octubre Para la histología y la mayoría inmunotinción, páncreas se fijaron durante la noche y se procesaron para la inclusión en parafina. Rutina de hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción se realizó usando procedimientos estándar. Para la inmunotinción, las secciones se deparaffinized, rehidratada y se recuperaron los antígenos si se requiere el uso de un 2100-Retriever y solución de antígeno desenmascarar (Vector Laboratories). Para citoqueratina inmunotinción 19 (CK19), se utilizó la proteinasa K procedimiento de recuperación de antígeno. procedimientos de inmunotinción fueron como se describe anteriormente [5]. Los anticuerpos y la dilución utilizados fueron: TromaIII (anticuerpo CK19 desarrollado por Rolf Kemler y obtuvo de Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma, 1:10), anti-βGalactosidase (conejo, Cappel, 1:200), anti-Muc5a (Novocastra, 01:30 ), anti-Ki67 (ratón, Novocastra, 1:200), anti-Hes1 (un regalo del doctor T. Sudo, Toray Inc., Kamakura, Japón; 1:400), anti-Cox2 y anti-fosfo-STAT3 (Tyr705) (ambos señalización celular 1:50), anti-Pdx1 (Upstate1:5000), anti-αSMA (Abcam, 1:100), anti-nestina (Chemicon, AB5922 para humano, MAB353 para el ratón, 1:100) , y anti-amilasa (Calbiochem, 1:500).
Imágenes fueron capturadas con una cámara QImaging EXI azul y analizados con ImagePro Plus 7.0. Fluorescencia imágenes fueron capturadas utilizando la configuración en blanco y negro y coloreados artificialmente para el análisis, a excepción de la figura 5 en la que se tomaron las fotografías usando los ajustes de color; H & amp; E y de inmunoquímica imágenes fueron capturadas utilizando los valores de Color. Photoshop fue utilizado para procesar las imágenes.
Información de Apoyo
figura S1. tratamiento
caerulein conduce a una pancreatitis aguda. H & amp; E tinción de páncreas sin tratar (A) y se trató con caerulein (B, C). (B) 48 horas después del tratamiento caerulein (48 h después de la C), el páncreas muestra extensa ADM, atrofia exocrina y la infiltración inflamatoria. (C) a 1 semana después de la C, el páncreas ha recuperado su morfología normal pero los altos niveles de proliferación siguen observando como se muestra por la expresión de Ki67 (D)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0027725.s001
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figura S2.
El análisis morfométrico de los ratones P /K, 6 meses después de la AP-inducida ceruleına. Se observaron incrementos dramáticos en el número de animales que presenten extensa ADM, lesiones de alto grado y las áreas /microinvasión PDAC, en comparación con los animales no tratados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0027725.s002 gratis (TIF)
Figura S3. Caracterización
PanIN en ratones NK. (A) tinción Ki67 muestra un claro aumento en la proliferación de las lesiones de bajo y alto grado. PanINs de alto grado expresan CK19 (B), Muc5a (C). marcadores progenitoras embrionarias se reactivan (D, E). tricrómico de tinción con azul de (F) de Masson muestra la presencia de colágeno alrededor de las lesiones PanIN. (G) Amplia ADM se observa como se muestra por la coexpresión de CK19 (verde, H) y amilasa (rojo, I) en las mismas células (puntas de flecha blanca). Barra de escala: 20 micras
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