Extracto
El receptor transitorio canónica potenciales (TRPC) son canales de Ca
2 + canales catiónicos -permeable que controlan el Ca
2 + afluencia evocada por G activación del receptor acoplado a la proteína y /o Ca
2 + agotamiento tienda. Aquí se investiga la implicación de TRPCs en la diferenciación de células de cáncer de pulmón. La expresión de TRPCs y la correlación de grado de diferenciación del cáncer en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) se analizaron por PCR en tiempo real y inmunoticción utilizando microarrays de tejido de 28 pacientes muestras de cáncer de pulmón. La asociación de TRPCs con la diferenciación celular se investigó también en el cáncer de pulmón a células A549 mediante PCR y Western Blot. La actividad del canal se controló por Ca
2 + de imágenes y grabación de parche después del tratamiento con todo-
ácido retinoico trans gratis (ATRA). La expresión de TRPC1, 3, 4 y 6 se correlacionó con el grado de diferenciación de NSCLC en los pacientes, pero no había correlación con la edad, el sexo, la historia de tabaquismo y el tipo de células de cáncer de pulmón. ATRA regula positivamente TRPC3, TRPC4 y expresión TRPC6 y mejorado Ca
2 + afluencia en las células A549, sin embargo, ATRA no mostró ningún efecto directo sobre los canales TRPC. La inhibición de los canales de TRPC por anticuerpos de poros de bloqueo de disminución de la mitosis celular, que fue contrarrestado por el tratamiento crónico con ATRA. El bloqueo de los canales de TRPC inhibe la proliferación de células A549, mientras que la sobreexpresión de TRPCs aumentó la proliferación. Llegamos a la conclusión de que la expresión TRPC se correlaciona con la diferenciación de cáncer de pulmón. TRPCs median el efecto farmacológico de ATRA y juegan un papel importante en la regulación de la diferenciación celular y la proliferación del cáncer de pulmón, lo que da una nueva comprensión de la biología del cáncer de pulmón y terapia potencial contra el cáncer
Visto:. Jiang HN, Zeng B, Zhang Y, Daskoulidou N, Fan H, Qu JM, et al. (2013) La participación de Canales TRPC en cáncer de pulmón de la diferenciación celular y el análisis de correlación en el humano de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (6): e67637. doi: 10.1371 /journal.pone.0067637
Editor: Peiwen Fei, Universidad de Hawai Centro de Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 25 de Enero, 2013; Aceptado: 20-may de 2013; Publicado: 28 Junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Jiang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de los subsidios de Shanghai liderando proyectos de imagen (No. 036 de 2010) y Proyecto Shuguang Seguimiento del Comité de Educación de Shanghai (01SG06) (a JMQ); Premio Fundación Leverhulme Fellowship (a S.Z.X.); Fundación de Ciencias Naturales de Shanghai (núm 09ZR1406100) y Shanghai Leading Proyecto disciplina académica (Nº B115) (a H.N.J.). B.Z. fue apoyado por el Consejo de Becas de China y la beca de la universidad. N. D. recibió 80º aniversario beca de doctorado de la Universidad de Hull. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a pesar de que la tasa de supervivencia ha mejorado desde la introducción de agentes antineoplásicos de tercera generación y el receptor del factor de crecimiento epidérmico inhibidores (EGFR) tirosina quinasa, el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en el mundo [ ,,,0],1], [2], [3], [4], [5]. Por lo tanto, la comprensión de la patogénesis de desarrollo de cáncer de pulmón y la identificación de nuevas dianas potenciales son importantes para el desarrollo de la estrategia terapéutica.
Ca
2 + es importante en las cascadas de señalización de la tumorigénesis. El potencial receptor transitorio (TRP) de la familia de canales de iones ha sido implicado en la regulación del crecimiento y progresión del cáncer a través de la modulación de Ca
2 + afluencia y las señales de aguas abajo, incluyendo la transcripción de genes [6], [7], [8] . Entre los seis subfamilias (TRPC, TRPM, TRPV, trpp, TRPML y TRPA) de los canales TRP, los TRP canónicas (TRPCs) se han sugerido como proteína tirosina quinasa o acoplados a la proteína G operados por receptores de Ca
2 + canales ( ROC) o Ca
2 + canales tienda que funciona internos (SOC), que median la relación Ca
2 + entrada evocada por muchas hormonas y factores de crecimiento. Por lo tanto, la inhibición de la actividad del canal de estos o expresión conduce a cambios funcionales en la proliferación de células de cáncer, la migración, la formación de colonias y el crecimiento del tumor [6], [9]. Recientemente, varios estudios han demostrado la existencia de TRPC en diferentes tipos de células cancerosas o tejidos de cáncer, tales como TRPC1, 3, 6 en las células MCF7 de cáncer de mama [10], [11] y las células HepG2 cáncer de hígado [12], TRPC1, 3, 4 en las células LNCaP de cáncer de próstata [13], [14], TRPC1, 4, 6, 7 en el carcinoma de células renales [15], TRPC1, 3, 5, 6 en los gliomas malignos humanos [16], TRPC1, 3- 7 en neuroblastoma IMR-32 células [17], TRPC3 en astrocitoma humano 1321N1 células [18], TRPC6 en esofágico y cáncer gástrico [19], TRPC1, 3, 4, 6 y sus variantes de corte y empalme en el cáncer de ovario [9], [ ,,,0],20], y TRPC1, 4 en el carcinoma de células basales [21]. Por otra parte, las evidencias de
in vitro
experimentos han demostrado que la sobreexpresión de canales TRPC o silencio de la expresión génica con siRNA puede regular la proliferación celular o la supervivencia celular, lo que sugiere que estos genes son importantes en la biología del cáncer [6], [9] , [20].
la expresión de TRPC1, 3, 4, 6 en el cáncer de pulmón se ha detectado [22], [23] y la asociación de la expresión TRPC3 con el pronóstico del adenocarcinoma de pulmón se ha descrito [ ,,,0],23]. Sin embargo, son en gran parte desconocida la correlación de expresión TRPC con el grado de diferenciación de cáncer de pulmón y el mecanismo subyacente. Aquí se intentó identificar la expresión de TRPCs en el cáncer de pulmón humano y determinar las funciones de los TRPCs en la regulación de la diferenciación de células de cáncer y la proliferación usando anticuerpos de bloqueo de canal TRPC específico. También se examinó la posible correlación de expresión TRPC con el grado de diferenciación del cáncer, tipo de célula y de fumar mediante PCR en tiempo real e inmunohistoquímica en los microarrays de tejido de cáncer de pulmón. Para examinar más a fondo la relación de expresión TRPC con la diferenciación celular, ATRA, un inductor de la diferenciación celular potente para muchos tipos de células, se utilizó en un
in vitro
de pulmón de células cancerosas en el modelo.
Materiales y Métodos
pacientes y muestras de tejido pulmonar
Veintiocho pacientes (17 varones y 11 mujeres) con edades comprendidas en 61,1 ± 1,7 años, con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) fueron reclutados entre noviembre de 2008 y de diciembre de 2009. Todos los pacientes con CPNM fueron diagnosticados clínicamente por etapas I o II del cáncer de pulmón y recibió operación en el hospital de Cirugía Torácica de Zhongshan. Los pacientes elegibles tenían sin tratamiento previo, histológicamente o citológicamente demostrado NSCLC. Los pacientes recibieron quimioterapia o radioterapia preoperatoria fueron excluidos de este estudio. El tejido de cáncer de pulmón y el tejido pulmonar normal que rodea el tumor más allá de 2 cm de distancia se obtuvieron de un mismo paciente. Los tejidos se congelaron se utilizaron para el análisis de ARNm y de los tejidos fijados con formalina para el estudio immuocytochemistry. El proyecto fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Zhongshan de la Universidad de Fudan, y los pacientes dieron su consentimiento por escrito de conformidad con la Declaración de Helsinki.
microarrays de tejidos del cáncer de pulmón
microarrays de tejidos de cáncer pulmonar, hechas con tejidos de cáncer fijados en formalina [24]. núcleos de tejido con 2 mm de diámetro fueron recogidos basan en la alineación visual con la hematoxilina correspondiente y eosina (HE) tinción. Un núcleo de tejido pulmonar normal y dos núcleos de tejido tumoral se tomaron de cada paciente y se colocaron en bloques de parafina receptor. Las secciones de tejido con un espesor de 5-m se utilizaron para la inmunotinción. Todas las muestras en los microarrays de tejidos fueron examinadas por un patólogo con la clasificación histológica y el grado de diferenciación de acuerdo con la clasificación de la OMS [25].
Las células cultura y transfección génica
línea celular A549, una de uso general modelo de células de cáncer de pulmón derivada de células basales alveolares humanos adenocarcinomic epiteliales, se cultivó en medio DMEM /F12 (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina, y mantenido a 37 ° C por debajo del 95% de aire y 5% de CO
2. TRPC1 humano, TRPC3 y TRPC6 se amplificó a partir del cDNA de las células cancerosas y TRPC4 humano de ovario humano se amplificaron a partir del ADNc de células endoteliales aórticas humanas con 100% de identidad con las secuencias en el GenBank (números de acceso: X89066 (TRPC1); U47050 ( TRPC3), NM_016179 (TRPC4α) y BC093660 (TRPC6). El TRPC ADNc se subclonaron en vectores pcDNA3.1 o pEGFP-C1 y su expresión funcional se ha confirmado como se informó [9]. Las células A549 se transfectaron con TRPC1, 3, 4, 6 y ADNc de plásmidos en el vector pcDNA3 utilizando Lipofectamine2000 (Invitrogen). Las células transfectadas se sembraron en placas de 48 pocillos para el experimento.
tinción de Giemsa, la mitosis y la proliferación celular Los ensayos
células A549 se sembraron en placas de 3,5 cm con una densidad final de 4 x 10
4 células por placa. Las células se trataron con 1 M ATRA o vehículo. El medio de cultivo se repone todos los 24 h. Las células se fijaron con metanol durante 10 min y se tiñeron con una solución diluida 1:09 Giemsa (Sigma) que trabajan en PBS a pH 6,5 durante 45 minutos, y se lavó con agua y se seca al aire. El número de células mitóticas y células totales se contaron en las imágenes fotografiadas por debajo de 200 × magnificación. La proliferación celular también se determinó usando WST-1 de ensayo (Roche, Reino Unido) [9].
RT-PCR y PCR en tiempo real
ARN total se extrajo de pulmón humano y los tejidos de cáncer de pulmón o las células A549 utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Reino Unido). El ARN se cuantificó con un nanofotómetro (Implen, alemán). El ARNm (1 g) fue inverso-transcrito a cDNA utilizando Multiscribe la transcriptasa reversa (Applied Biosystems, EE.UU.) y cebadores aleatorios (Promega, UK). RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando StepOne ™ System PCR en tiempo real o el sistema de detección ABI PRISM 7900 HT de secuencia (Applied Biosystems, UK). El conjunto de cebadores se diseñó a través de intrón y las secuencias se da en la Tabla S1. Cada reacción contenía 1 × SYBR Universal Master Mix (Applied Biosystems) 10 l, cDNA 1 l, y cebadores directos e inversos 1,5 l cada uno. El gen de mantenimiento GAPDH gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa humana se utilizó como estándar interno. No plantilla o no RT se fijó como control negativo. El ciclo de PCR consistió en un ciclo inicial de 50 ° C durante 2 min seguido de 95 ° C durante 10 minutos, luego 50 ciclos repetidos de 95 ° C durante 15 s, 54 ° C la temperatura de recocido durante 30 s, y la extensión del cebador a 72 ° C durante 30 s.
los anticuerpos, Western Blot e inmunohistoquímica
policlonal de conejo anti-anticuerpos TRPC (T1E3, T5E3, T367E3 y T45E3) se generaron contra el tercer bucle extracelular (E3) región cerca del poro del canal [26]. La especificidad de los anticuerpos dirigidos E3-se puso a prueba mediante ELISA, Western Blot y ensayos funcionales, y la fluorescencia de células activadas (FACS) [9], [26]. El procedimiento para la transferencia Western se ha descrito anteriormente [26]. Brevemente, las células se lisaron en tampón RIPA (Sigma-Aldrich, Poole, UK) y las proteínas se separaron sobre 10% de gel de SDS-PAGE antes de transferir a una membrana de nitrocelulosa. La transferencia se incubó con anticuerpos de conejo anti-TRPC (1:200) la noche a 4 ° C, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se incubó con anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo-HRP en 1:2000 dilución (Sigma). El anti-β-actina de conejo (Santa Cruz Biotech, EE.UU.) a una dilución 1:400 fue utilizado como un estándar interno para la cuantificación de proteínas. La visualización se lleva a cabo utilizando reactivos de detección ECLplus (GE Healthcare, Reino Unido) y la exposición a películas de rayos X. La cuantificación se analizó usando el software Image J (NIH, EE.UU.). El procedimiento de inmunotinción fue similar a nuestros informes [9], [27] y el sistema VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories, Peterborough, Reino Unido) se utilizó. El anti-TRPC1 conejo, 3, 4 y 6 anticuerpos adquirido de Abcam (Cambridge, Reino Unido) se utilizaron para el tejido pulmonar humano y la sección tinción cáncer de pulmón. La cuantificación de la tinción fue evaluada por la puntuación de células positivas teñidas y la intensidad de tinción clasificados como 0 (negativo), 1 (débil), 2 (intermedio) y 3 (fuerte) [28].
Plenario de células Patch Clamp
Las corrientes de células enteras se registraron utilizando Axoclamp 2B o Axopatch B200 amplificador de patch clamp y se controlan con el software de ordenador pClamp 10. Los procedimientos para el registro de las corrientes TRPC fueron similares a nuestros informes anteriores [29], [30]. Un protocolo de voltaje 1-s rampa desde -100 mV a 100 mV se aplica a una frecuencia de 0,2 Hz a partir de un potencial de mantenimiento de 0 mV. Las señales fueron muestreados a 3 kHz y se filtraron a 1 kHz. Se utilizó el microelectrodo de vidrio con una resistencia de 3-5 mO. El 200 nM Ca
2 + solución de la pipeta (115 CsCl, 10 EGTA, 2 MgCl
2, 10 HEPES, y 5,7 CaCl
2 en mM, pH se ajustó a 7,2 con CsOH y la osmolaridad se ajustó a ~290 mOsm con manitol). El calculada libre de Ca
2 + fue de 200 nm utilizando EQCAL (Biosoft, Cambridge, Reino Unido). La solución estándar de baño contenía (mM): NaCl 130, KCl 5, 8 D-glucosa, 10 HEPES, 1,2 MgCl
2 y 1,5 CaCl
2. El pH se ajustó a 7,4 con NaOH. El experimento se llevó a cabo a temperatura ambiente (23-25 ° C).
Ca
2 + de imágenes
A549 células se cargaron con Fura 2 M-PE3 AM a 37 ° C durante 30 min en Ca
solución 2 + exento de baño, seguido de un lavado de 20 min en baño de solución estándar a temperatura ambiente. fluorescencia Fura-PE3 se monitorizó con un microscopio de epifluorescencia invertido (Nikon Ti-E, Japón). Una lámpara de arco de xenón luz provista de excitación, la longitud de onda de los cuales fue seleccionado por un sistema de imagen de Nikon controlado por el software de NIS Elements 3.0. longitud de onda dual excitado a 340 nm y 380 nm se utilizó para la fluorescencia Fura-PE3, y se recogió la emisión a través de un filtro de 510 nm y fotografiado por la cámara Orca-R2 CCD (Hamamatsu, Japón). La relación de Ca
2 + fluorescencia del colorante en F
340 /F se midió la longitud de onda
380 [30]. Todos los experimentos se realizaron a temperatura ambiente.
Reactivos y productos químicos
Todas las sales generales se adquirieron de Sigma-Aldrich (Poole, UK). cloruro de gadolinio (Gd
3+), 2-aminoethoxydiphenyl borato (2-APB), tripsina, todo-
trans ácido retinoico
(ATRA), y cebadores de PCR se adquirieron de Sigma-Aldrich, y Fura -PE3 AM fue de Invitrogen (Paisley, Reino Unido).
Estadísticas
Los datos se expresan como media ± SEM La significación estadística se analizaron mediante ANOVA y la diferencia entre los grupos se evaluó con Dunnett de
t-test
en el software SPSS. Se aplicó
t
de Student para la comparación de dos grupos. Se utilizó el análisis de Ridit para los datos semicuantitativos de inmunotinción experimento. El
P
valor. & Lt; 0,05 se consideró significación
Resultados
Expresión de TRPCs en el cáncer de pulmón
La expresión de TRPCs en el pulmón humano normal y tejidos de cáncer de pulmón se examinó mediante inmunotinción (Fig. 1A). En las secciones normales de tejido de pulmón, las células epiteliales alveolares se tiñeron con anticuerpos anti-anti-TRPC6 TRPC1 y, pero la tinción para TRPC3 y TRPC4 fueron negativos o muy débil. En las secciones de carcinoma de células escamosas de pulmón, las células escamosas fueron fuertemente teñidas con anti-TRPC1, anti-TRPC3, anti-TRPC4 y anticuerpos anti-TRPC6. Del mismo modo, la tinción positiva para TRPC1, TRPC3, TRPC4 y TRPC6 también fue visto en las secciones adenocardionoma pulmón. El uso de PCR en tiempo real, se cuantificó la expresión de TRPCs en los tejidos de cáncer de pulmón y normales. El ARNm de TRPC1, 3, 4 y 6 se detectaron en ambos tejidos de pulmón y cáncer de pulmón normales. El nivel de expresión de TRPC1 y TRPC6 fue mucho mayor que la de TRPC3 y TRPC4. Los ARNm para TRPC5 y TRPC7 fueron indetectables en tejidos normales y de cáncer de pulmón (Fig. 1B-C). Estos datos sugieren la existencia de TRPC1, 3, 4, 6 isoformas en NSCLC.
A, Ejemplos de pulmón humano normal (
n
= 20) y tejidos de cáncer de pulmón secciones (
n
= 28), incluyendo el adenocarcinoma (AC) y el carcinoma de células escamosas (SCC) fueron teñidas con anti-TRPC1, anti-TRPC3, los anticuerpos anti-TRPC6 usando el sistema VECTASTAIN ABC anti-TRPC4 y. La tinción positiva se muestra como el color marrón. Los núcleos fueron contra el teñidas por hematoxilina. B, el ARNm se detectó por PCR en tiempo real en los tejidos pulmonares normales utilizando los cebadores de la Tabla S1. El GAPDH se utilizó como control de genes casa de mantenimiento interno para la cuantificación (
n = 25 pacientes
para TRPC1, 4, 5 y 6 grupos;
n = 24 para
TRPC3; y
n = página 9 para TRPC7). C, Los niveles de mRNA en tejidos de cáncer de pulmón (AC:
n
= 9-15; SCC:
n
= 8-11) guía empresas
Correlación de. TRPC Expresión de cáncer Diferenciación Grado
La diferencia en los niveles de ARNm entre los grados de diferenciación del cáncer, tipos de células, fumadora y no fumadora fue detectado por PCR en tiempo real. La expresión de TRPC1, 3, 4 y 6 canales fue significativamente menor en el cáncer de pulmón poco diferenciado que en el grupo bien moderadamente diferenciado (Fig. 2A, véase también el cuadro S2). Sin embargo, no hubo diferencia significativa entre los fumadores y no fumadores grupos (Fig. 2B). El análisis de regresión multivariante lineal también mostró una correlación negativa de la expresión de ARNm de TRPC1, TRPC3, TRPC4 y TRPC6 de pulmón grado de diferenciación del cáncer con la secuencia estandarizada coeficiente β de TRPC1 (-0.563) & gt; TRPC4 (-0.360) & gt; TRPC6 (0,271 ) y TRPC3 (-0,057), respectivamente. etapas de regresión mostró que TRPC1 fue una variable significativa (P & lt; 0,01)., pero la correlación del grado de diferenciación del cáncer con el sexo, la edad, el tabaquismo, y el tipo de células de cáncer no fue significativa
A, La expresión de mRNA TRPCs en tejidos de cáncer de pulmón y de salud, moderada (grado II (
n
= 17) y de grado III (
n
= 6)) o mala (grado IV,
n
= 5) el grado de diferenciación fue detectado por PCR en tiempo real. GAPDH se utilizó como control limpieza de genes. B, La expresión de mRNA TRPCs en los tejidos de cáncer de pulmón obtenidas de fumador (20 cigarrillos por día durante más de 10 años,
n
= 11) y no fumadora (
n = 17
). C, ejemplo de dos microarrays de tejidos con cáncer de pulmón normal (N) y el cáncer de pulmón (C) etiquetas se tiñeron con anticuerpo anti-TRPC1. El grado de tipo celular y la diferenciación de cada sección se caracteriza por HE-tinción. Los dos ejemplos (11C y 9C) con adenocarcinoma bien diferenciado se muestran en las inserciones. La correlación de intensidad de la tinción con otros factores se muestra en la tabla y el significado se evaluó por análisis de Ridit. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,001
También investigado la correlación de grado de diferenciación del cáncer de pulmón a los TRPC niveles de expresión de proteínas utilizando la inmunotinción semicuantitativa. Dos microarrays de tejidos con 20 tejidos pulmonares normales y 28 muestras de NSCLC que incluyen 15 casos de adenocarcinoma, 11 casos de carcinoma de células escamosas, y 2 casos con tipos de células mixtas de carcinoma adenoescamosa se construyeron (Fig. 2C). El tipo de células de cáncer de pulmón fue confirmada por HE-manchas. El TRPC1, TRPC3, y TRPC6 en las secciones de tejido de microarrays adyacentes estaban fuertemente teñidas con anti-TRPC1, 3, y 6 anticuerpos con un porcentaje de secciones de cáncer positivamente teñidas de 71,4%, 75,0% y 71,4%, respectivamente, mientras que la tinción leve se visto por TRPC4 con un porcentaje de tinción positiva de 32,1%. Para secciones de pulmón normales en los microarrays, el porcentaje de tinción positiva para TRPC1, 3, 4 y 6 fueron 70%, 70%, 45% y 85%, respectivamente. El análisis Ridit mostró que la intensidad de la tinción de TRPC1 se asoció con el grado de diferenciación (Fig. 2C). Sin embargo, el análisis de regresión multivariante lineal no mostró correlación significativa de las puntuaciones de tinción de proteínas de TRPC al grado de diferenciación del cáncer de pulmón, tipo de célula, el tabaquismo, la edad y el sexo.
Upregulation de TRPC Expresión por el tratamiento crónico con ATRA
TRPC1, 3, 4 y 6 se detectaron en las células A549, pero TRPC5 y TRPC7 fueron indetectables a pesar de los conjuntos de cebadores para TRPC5 y TRPC7 pueden amplificar el ARNm aislado de las células del cerebro o HepG2 (Fig. 3A). Las dos bandas en el gel TRPC1 eran isoformas alfa y beta, y las bandas para TRPC4 eran α, β, γ y isoformas delta, respectivamente, como se describió en las células de cáncer de ovario [9]. Los niveles de ARNm y proteínas para TRPC3, TRPC4 y TRPC6 se incrementaron significativamente por el tratamiento crónico con 1 M ATRA durante 96 horas (Fig. 3B-C), sin embargo, la regulación de la expresión TRPC1 no fue significativa. Estos datos sugieren además que la expresión de algunas isoformas TRPC está asociada con la diferenciación de células
.
A, los ARNm de TRPC1, 3, 4 y 6 se detectaron en las células A549 mediante RT-PCR usando el conjunto de cebadores en la Tabla S1. Las bandas de PCR para TRPC5 y TRPC7 fueron negativos en las células A549, pero positivo en el cerebro humano o HepG2. B, el ARNm se detectó por PCR en tiempo real en las células A549 tratadas con todo-
trans
ácido retinoico (ATRA, 1 M) durante 96 horas. El β-actina se utilizó como gen de mantenimiento para la cuantificación relativa. El 2
(- ΔΔCt) método fue utilizado para el cálculo. C, las proteínas TRPC se cuantificaron mediante transferencia Western utilizando anti-TRPC1 (T1E3), anti-TRPC3, anti-TRPC4 (T45E3) y anticuerpos anti-TRPC6. anticuerpo anti-β-actina se utilizó para la cuantificación relativa de proteínas (
n
= 3 experimentos independientes y cada experimento con muestras por triplicado).
Efecto del ATRA sobre el Ca
2 + Emisiones y Afluencia en células A549 y A549 células TRPC Canal Actividad
fueron tratados crónicamente con ATRA (1 M) durante 4 días con cada refresco de 24 horas de medio de cultivo celular. La dinámica de Ca intracelular
2 + fue supervisado por Fura-PE3 /AM. Tripsina a 0,2 nM indujo una robusta Ca
2 + liberación de Ca
2 + solución libre, que fue seguido por un segundo Ca
2 + pico en células A549. La perfusión con Ca 1,5 mM
2 + después de la tienda-agotamiento con tripsina aumentó el Ca
2 + afluencia en las células tratadas con ATRA (Fig. 4A-B), lo que sugiere el tratamiento crónico con ATRA mejoró la Ca
2 + afluencia, pero no tuvo efecto sobre el Ca
2 + señal de liberación. Uso de grabación parche de células enteras, la corriente de las células A549 no se cambió por perfusión aguda con ATRA (Fig. 4C-E). Para investigar el potencial efecto directo de ATRA en los canales TRPC, se utilizaron las células HEK-293 que expresan de manera inducible TRPCs para toda grabación parche celular. Las corrientes de TRPC3, 6 y corrientes TRPC4 fueron activados por la tripsina o Gd
3+ (100 M), respectivamente. La actual relación de tensión (
IV
) curvas de estas corrientes fueron similares a nuestro informe anterior [29]. ATRA a 1 micras y 10 micras no tenía efecto estimulante o de bloqueo en estos canales, pero todas estas corrientes fueron bloqueados por el bloqueador de TRPC 2-APB, lo que sugiere que ATRA no tuvo efecto directo aguda en Ca
2 + actual o Ca
2 + afluencia a través de canales TRPC (Fig. 4F-I). El aumento de crónica de Ca
2 + afluencia en el ATRA trataron células A549 podría ser el único aportado por TRPC la regulación positiva de genes.
A, las células A549 fueron cargados con 2 M Fura-PE3 /hy el Ca
2 + fue medida como la relación (F
340 /F
380) de Ca
2 + fluorescencia del colorante. Ca
2 + liberación fue evocado por la tripsina (0,2 nM) y Ca
2 + afluencia se introdujo por 1,5 mM Ca
2 + en la solución de perfusión. Las células se incubaron con 1 M ATRA durante 96 horas y las células de control se incubaron con mismo volumen de vehículo. B, Media ± s.e.m. datos para el Ca
2 + entrada después de la depleción de la tienda por la tripsina como se muestra en (A).
n = 21-32
para cada grupo, ***
P Hotel & lt; 0,001. C, las corrientes de células enteras en la muestra a la tensión de mando de ± 80 mV en las células A549 antes y después de la perfusión con ATRA (1 M), la tripsina (0,2 nM) y 2-APB (100 M). D,
IV
curvas para (C). E, media de los datos para el efecto de ATRA. F-H, Efecto del ATRA sobre las corrientes de células enteras de TRPC3, TRPC4 y TRPC6 en las células HEK293 que sobreexpresan isoformas TRPC individuales. Yo, media ± s.e.m. Los datos medidos a -80 mV, y
n =
4-6 para cada grupo.
Diferenciación Celular Regulado por TRPC Canal Actividad
La diferenciación de pulmón A549 las células cancerosas se evaluó mediante tinción de Giemsa que puede visualizar los cromosomas. Con la mitosis celular nuclear está representada núcleo azul oscuro o manchas núcleos doble (Fig. 5). ATRA (1 M) mitosis celular inhibió significativamente a las 24 horas y 48 horas de cultivo celular. El porcentaje de células mitóticas se hizo menos a las 72 horas y el cultivo de células de 96 horas y la diferencia entre los dos grupos no mostró significación (Fig. 5B). La pérdida de la diferencia estadística después de cultivo de células de 72 horas podría ser debido a la inhibición por contacto de células que se produjo en las células confluentes después de cultivo de células de 3 a 4 días. Por lo tanto, se evaluó el efecto de los bloqueadores de los canales TRPC en la mitosis dentro de cultivo de 48 horas. La especificidad y la función del poro TRPC bloqueo de los anticuerpos se han demostrado en los estudios anteriores [9], [31], [32], [33]. La inhibición de la TRPC1, TRPC3 y TRPC6 canales por anticuerpos T1E3 y T367E3 inhibió significativamente la mitosis, mientras que los efectos de T1E3 y T367E3 mostraron menos eficaz después del tratamiento con ATRA en comparación con los grupos tratados con el anticuerpo hervida o el grupo sin adición de anticuerpo.
a, Ejemplo de tinción Giemsa de las células A549 y el tratamiento con o sin ATRA durante 0-96 horas. Las células mitóticas se indica por la flecha. B, el porcentaje de células mitóticas en el control y los grupos tratados con ATRA (
n = 32-40
campos microscópicos para cada grupo contiene 6 placas de cultivo, ***
P Hotel & lt; 0,001). C, Efecto del canal TRPC anticuerpos de bloqueo en la mitosis celular. El medio sin anticuerpo (No-Ab) y el anticuerpo hervida (hervido-Ab) como controles (
n
= 18 campos microscópicos de 6 pocillos de cultivo de cada grupo, NS: no significativo, *
P Hotel & lt; 0,05 y **
P Hotel & lt; 0,01). Las delta (Δ) los cambios de la inhibición inducida por ATRA también se compararon entre los hervida-Ab (Control) y los grupos tratados con anticuerpos bloqueantes.
TRPC Channel y proliferación celular A549
Cell diferenciación y proliferación son dos procesos celulares estrechamente relacionados, por lo tanto, también se observó efecto de la actividad del canal TRPC sobre la proliferación de células A549. El número de células se incrementó en ~ 8 pliegues después del cultivo de células de 96 horas. ATRA (1 mM) inhibió significativamente la proliferación de las células después de 72 horas y el cultivo de células de 96 horas (Fig. 6A), lo que sugiere el efecto de ATRA sobre la proliferación celular es un proceso de desarrollo lento. Sin embargo, el efecto anti-proliferativo mediante el bloqueo de la actividad del canal TRPC era mucho más rápido y se logró la diferencia significativa dentro de las 24 horas después de la incubación con 2-APB, un no selectivo bloqueante de los canales TRPC. La CE
50 para 2-APB fue 87,9 M (Fig. 6B). Uso de los anticuerpos de bloqueo T1E3 y T367E3 para bloquear específicamente TRPC1 y TRPC3 /6 en las células A549 también inhibió la proliferación de las células sin tratamiento ATRA, pero el efecto inhibidor fue más pronunciado cuando las células se trataron con 1 M ATRA durante 48 horas (Fig . 6C), lo que sugiere la actividad del canal TRPC puede ser aumentada por ATRA. Para demostrar aún más la participación de canales TRPC en la proliferación de células de cáncer de pulmón, las células A549 se transfectaron con TRPC1, 3, 4, y 6 ADNc de plásmido. La proliferación celular se incrementó en las células A549 que sobreexpresan TRPC1 y TRPC6, pero no significativa para las células que sobreexpresan TRPC3 y TRPC4 (Fig. 6D). Estos resultados indican que la proliferación de células de cáncer de pulmón está regulada por la actividad de los canales TRPC.
A, el curso de tiempo para el efecto de ATRA sobre la proliferación de células A549. B, las células A549 se incubaron con 2-APB a diferentes concentraciones durante 24 horas (
n
= 8 pocillos para cada uno) y los grupos de la proliferación celular se ensayó por WST-1 kit de ensayo de proliferación celular. C, las células A549 tratadas con específica E3-orientación TRPC anticuerpos bloqueantes o combinación con ATRA durante 48 horas (
n
= 6-7 para cada grupo; comparación con el control
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P Hotel & lt; 0,01). D, la proliferación de células A549 se evaluó mediante WST-1 después de la transfección con TRPC1, 3, 4, y 6 ADNc de plásmido por 48 horas (
n
= 8 para cada grupo, **
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Discusión
en este estudio, hemos demostrado que TRPC1, TRPC3, TRPC4 y TRPC6 existe en el cáncer de pulmón humano, incluido el adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y el adenocarcinoma derivado de la línea celular A549. El nivel de expresión de canales de TRPC está correlacionado con el grado de diferenciación de cáncer de pulmón. ATRA regula al alza la expresión de genes TRPC en células A549. La inhibición de la actividad de los canales TRPC muestra efecto antiproliferativo. Estos hallazgos son importantes para la comprensión de las funciones de los canales TRPC en la diferenciación celular y la proliferación del cáncer de pulmón.
canales TRPC se han detectado en muchos tejidos [32], [34], [35], [36] incluyendo cáncer tejidos, tales como el cáncer de mama [37], cáncer de ovario [9], [20], hepatoma [12], cáncer de próstata [13], carcinoma de células basales [21], carcinoma de células renales [15], los gliomas malignos [16] , glioblastoma [8], y los tumores gástricos [19]. El nivel de expresión de cada isoforma TRPC en diferentes tipos de células o tejidos cancerosos son variables, lo que sugiere la contribución o la importancia biológica de cada isoforma TRPC en diferentes tipos de cáncer podría ser diferente. Por ejemplo, la expresión de TRPC7 es negativo en A549 y SKOV-3, pero positivo en las células HepG2 en este estudio y en las células de neuroblastoma diferenciadas [17]. Además, las variantes alternativas empalmado también pueden contribuir a la funcionalidad de los canales de TRPC, tales como isoformas TRPC1 y TRPC4 empalmado en células de cáncer de ovario SKOV3 [9]. Además, el nivel de expresión de canales de TRPC puede depender del estado de diferenciación de las células cancerosas, porque hemos encontrado la expresión de mRNA de TRPC1, TRPC3, TRPC4 y TRPC6 en el bajo diferenciación de cáncer de pulmón de grado fue menor que en el cáncer bien diferenciado , lo cual es consistente con nuestra observación en el cáncer de ovario [9] y el bajo nivel de expresión de TRPC4 y TRPC6 en células madre inmaduras [38]. Aunque nuestros datos muestran que los niveles de mRNA de TRPCs en pulmón normal fueron más altos que en el cáncer de pulmón, es difícil de hacer tal comparación debido a la variación de los tipos de células, debido a que las muestras de pulmón normal contiene células mucho más no epiteliales que en las muestras de tumores sólidos, tales como las células vasculares, macrófagos alveolares, fibroblastos y células de la sangre. La inmunotinción de los microarrays de tejidos de cáncer de pulmón mostró menos significativa, lo que podría deberse a la baja sensibilidad de la metodología de comparación a la alta sensibilidad de la PCR en tiempo real.