Extracto
Un enlace funcional de los receptores HER2 no relacionados estructuralmente y CXCR4 se ha sugerido para el cáncer de mama, pero no ha sido evaluada para el carcinoma esofágico . La inhibición de HER2 conduce a una reducción del crecimiento y la metástasis del tumor primario en un modelo ortotópico de carcinoma de esófago. El receptor de quimiocinas CXCR4 se ha implicado en la diseminación metastásica de diversos tumores y se correlaciona con escasa supervivencia en carcinoma de esófago. El objetivo de este estudio fue investigar la correlación entre los niveles de expresión de HER2 y CXCR4 y para evaluar la involvemnent de CXCR4 expresión en el carcinoma de esófago HER2 positivo. Se evaluaron los efectos de la inhibición de HER2 con trastuzumab y de CXCR4-inhibición con AMD3100 sobre el crecimiento del tumor primario, homing metastásico, y la expresión del receptor
in vitro Opiniones y en un modelo ortotópico de carcinoma metastásico de esófago mediante resonancia magnética para obtener imágenes. La relevancia clínica de HER2 y CXCR4 expresión se examinó en pacientes con carcinoma de esófago. Existe una correlación significativa de HER2 y CXCR4 expresión en el tumor primario y la metástasis en el modelo ortotópico. Trastuzumab y el tratamiento AMD3100 condujo a una reducción significativa del tumor primario de crecimiento, metástasis y micrometástasis. HER2-expresión fue significativamente elevado en tratamiento AMD3100 en el tumor primario y en particular en las metástasis. La correlación positiva entre HER2 y CXCR4 expresión fue validado en pacientes con cáncer de esófago. La correlación de CXCR4- y HER2-expresión y la elevación de HER2-expresión y la reducción de las metástasis a través de CXCR4 de inhibición sugieren un posible enlace funcional y un papel en la diseminación tumoral en carcinoma de esófago HER2 positivo
Visto.: Gros SJ, Kurschat N, Drenckhan A, Dohrmann T, Forberich E, Effenberger K, et al. (2012) La participación de receptor de quimiocina CXCR4 en metastásico HER2-positivo cáncer de esófago. PLoS ONE 7 (10): e47287. doi: 10.1371 /journal.pone.0047287
Editor: Ming Tan, de la Universidad del Sur de Alabama, Estados Unidos de América
Recibido: 10 Agosto, 2012; Aceptado: September 14, 2012; Publicado: 17 de octubre 2012
Copyright: © Gros et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo ha sido apoyado por la subvención GR 3484 /1-1 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores tienen el siguiente interés: Robert M. Hoffman está asociado con el cáncer, Inc . Dr. Pantel es una de Honorarios con Roche y un testigo experto con Genentech. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores.
Introducción
La familia de receptores del factor de crecimiento epitelial humano ( HER, ErbB) de receptores quinasas juega un papel importante en el crecimiento del tumor y la progresión [1]. Entre estos receptores, HER2 es el oncogén más fuerte y se encuentra a amplificar y sobreexpresa en aproximadamente el 20% de los cánceres de mama [2] En el cáncer de mama HER2 se sabe que está asociada con mal pronóstico y metástasis [3], [4]. HER2 sobreexpresión y amplificación se informa en el cáncer de esófago, con una tendencia hacia mayores tasas de positividad en adenocarcinoma [5] - [10] en comparación con los carcinomas de células escamosas [6], [7], [11] - [13]
Una fuerte concordancia del estado de HER2 en el adenocarcinoma esofágico primario y metastásico con alto nivel de amplificación del gen HER2 ha observado, lo que sugiere pacientes con cáncer de esófago con tumores primarios HER2 positivos como candidatos para la terapia con trastuzumab [14]. HER2 se sabe que aumenta el potencial metastásico en murinos y las líneas celulares de cáncer humano [15] - [18]
Con trastuzumab (Herceptin®) existe una terapia basada en anticuerpos que se utiliza con éxito clínicamente para la orientación HER2 en. cáncer metastásico de mama HER2-positivo [3], [19] - [21]. Trastuzumab aplicación también tiene un efecto dramático en pacientes con cáncer de mama HER2-positivo como terapia adyuvante [22]. Incluso hay evidencia de una posible respuesta de los cánceres no mama HER2 positivo (por ejemplo, cáncer gástrico) al trastuzumab [23], [24].
Una reducción significativa del crecimiento del tumor primario y de diseminación metastásica tiene previamente ha informado en un modelo ortotópico de adenocarcinoma de esófago HER2 positivo en tratamiento con trastuzumab [25]. Se ha demostrado que la señalización HER2 en cáncer de mama aumenta la expresión de CXCR4, que se requiere para la invasión mediada por HER2 [26]. La quimioquina CXCR4 se ha sugerido que desempeñar un papel esencial en homing de las células tumorales a los ganglios linfáticos y la médula ósea en el carcinoma de esófago [27]. La expresión de CXCR4 se correlaciona significativamente con la supervivencia global y específica de tumor en el carcinoma de esófago y está asociada con mal pronóstico [27]. Una correlación de CXCR4 y HER2 y posible papel funcional en la interacción de sus vías, sin embargo, no se ha investigado para el adenocarcinoma de esófago.
Las quimiocinas son una superfamilia de péptidos pequeños de citoquinas similares a [28], [ ,,,0],29]. A través de la interacción con los receptores de quimiocinas, las quimiocinas inducen reordenamiento del citoesqueleto de las células hematopoyéticas, aumentan su adhesión y migración directa a los órganos en el hogar específico. Los receptores de quimioquinas son proteínas G-receptores acoplados y CXCR4 es uno de los receptores mejor caracterizados. CXCR4 y su ligando SDF-1α juegan un papel importante en la orientación de las metástasis del cáncer de mama [30], [31]. La quimiocina SDF-1α se libera en grandes cantidades por los órganos como los pulmones, los huesos y el hígado. La atracción de la SDF-1α y CXCR4 hace que las células de cáncer de mama que migran a estos órganos, en donde proliferan y forman metastastes [30], [31].
A medida que la metástasis sigue siendo la causa principal de muerte relacionada con el tumor y la morbilidad es esencial para comprender mejor las vías fisiopatológicas complejas y procesos que conducen a la diseminación metastásica. rutas de diseminación de la enfermedad de tumor maligno son complejos y todavía poco conocidos [32] - [36]
El objetivo de este estudio fue investigar los efectos de la inhibición individual y combinada de las vías de los receptores de HER2 y CXCR4, y para. examinar los niveles de HER2 y CXCR4 expresión bajo de inhibición con el fin de determinar una posible participación de CXCR4 expresión en carcinoma de esófago HER2 positivo. Por otra parte, el objetivo era investigar más a fondo el papel de CXCR4 y HER2 en el crecimiento del tumor primario y en el homing de las metástasis. Además de determinar la importancia de la presencia de HER2 y CXCR4 en un colectivo de pacientes representativo, se utilizó un modelo altamente metastásico del carcinoma de esófago para su evaluación.
Materiales y Métodos
línea celular, la proliferación celular, y la migración celular
in vitro
La línea celular humana OE19 (Colección Europea de cultivos celulares (ECACC), la Agencia de Protección de la Salud, Wiltshire, Reino Unido) se cultivó en medio RPMI1560 (Biochrome KG, Berlín , Alemania) como se describe anteriormente [25].
la proliferación celular se midió usando el kit de citotoxicidad LDH (PromoKine, Heidelberg, Alemania). 50000 células OE19 se sembraron en una placa de 24 pocillos y se cultivaron durante la noche. AMD3100 (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) se complementó a la vitalidad y el medio de cultivo celular se analizó después de 48 horas.
migración de las células del tumor a través de una membrana microporosa se evaluó basándose en el principio de cámara de Boyden. Las células se incubaron con medio de cultivo durante 90 min, y luego se sembraron en la cámara superior. se añadió a la cámara inferior; El medio de cultivo que contiene 500 ng /ml de SDF-1α humana recombinante (D Systems, Mineapolis, EE.UU. R & amp). La placa se incubó a 37 ° C, 5% de CO
2 durante 18 horas. Las células migraron fueron teñidas utilizando DAPI (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) y se contaron con un microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss, Jena, Alemania).
modelo de tumor y el tratamiento terapéutico
NMRI /nu (US Naval Medical Research Institute) los ratones se obtuvieron de Charles River Deutschland (Sulzfeld, Alemania) a las 10 semanas de edad. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Behörde für Wissenschaft und Gesundheit (Freie und Hansestadt Hamburgo, Alemania). Se obtuvo el modelo de carcinoma esofágico implante como se ha descrito anteriormente [25], [37], [38]. Los ratones se pesaron y se examinaron para el desarrollo de tumores cada dos días.
Después de crecimiento del tumor primario se estableció por de resonancia magnética de imagen (MRI) en el día 14, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en cuatro grupos de nueve ratones cada uno (diez ratones en el grupo de control). El grupo uno fue tratado dos veces por semana con una inyección intraperitoneal de 20 mg /kg de peso corporal trastuzumab (Roche, Penzberg, Alemania) en un volumen de 100 l. El grupo dos recibió 5 mg /kg de peso corporal AMD3100 (Sigma-Aldrich, Munich, Alemania) en 100 l por inyección intraperitoneal. Grupo tres recibieron ambas inyecciones AMD3100 diarias, así como trastuzumab cada dos semanas. Grupo era para dado inyecciones simuladas intraperitoneales diarias con 100 l de PBS y se utilizó como grupo de control.
Inmunohistoquímica
El HercepTest (DAKO, Glostrup, Dinamarca) se usó de acuerdo con el protocolo del fabricante , utilizando una dilución 1:300 del anticuerpo primario. CXCR4-La tinción se realizó usando el anticuerpo policlonal de conejo primario CXCR4 anticuerpo (Abcam, clon 2074, Cambridge, UK) a una dilución de 1:250 durante la noche a 4 ° C. La reacción de los anticuerpos fue desarrollado con el Kit Celular y del Tejido de tinción, utilizando el HRP-AEC-System, desde amp I +; D Systems (Minneapolis, MN, USA). Las secciones se contratiñeron con una solución de hematoxilina de Mayer (Merck). El tejido tumoral se identificó mediante hematoxilina eosina (HE). La inmunotinción fue marcado por un patólogo (UR) y un segundo examinador independiente (AD) .Tras una escala de cuatro pasos (0,1þ, 2Þ, 3a) de acuerdo con las instrucciones del fabricante
La hibridación fluorescente in situ (FISH )
HER2
FISH análisis se realizó utilizando el
HER2 FISH pharmDx
Kit ™ (Dako, Glostrup, Dinamarca) según el protocolo del fabricante.
la detección de micrometástasis
ARN total fue aislado de las muestras de hígado y de pulmón con un kit de aislamiento de ARN (Qiagen, Hilden, Alemania) y se transcribió inversamente con un kit de ADNc de alta capacidad de transcripción inversa (Applied Biosystems). Las micrometástasis se detectaron mediante la expresión del ARNm de la humana
GAPDH
gen por análisis de PCR en tiempo real. Los resultados se normalizaron utilizando
18S ARN
expresión de las muestras de tejido. Los cebadores de PCR (TaqMan Expresión Génica Ensayo Gapdh Hs99999905_m1 humano, Número de parte 4351370, TaqMan Expresión Génica de ensayo 18S Hs99999901_s1) y TaqMan PCR Universal Mastermix se obtuvieron (Applied Biosystems). datos micrometástasis se presentan como los valores de Ct--delta.
detección de células tumorales diseminadas en la médula ósea
La médula ósea se tomaron muestras de fémur de ratones en el momento de sarifice y aisladas por gradiente de densidad como se describe anteriormente [39]. Los portaobjetos con células de médula ósea se evaluaron immunocytochemically para las células tumorales diseminadas utilizando el anticuerpo monoclonal anticitoqueratinas antihumano AE1 /AE3 (Dako, Glostrup, Dinamarca) marcado con el anticuerpo monoclonal fluorocromo FITC y anti-HER2 NCL-CB11 (Novocastra Reactivos y anticuerpos, Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Después de la tinción, los portaobjetos se cubrieron con Vectashield medio de DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) de montaje.
La resonancia magnética
Todas las mediciones de resonancia magnética se realizaron en una clínica de todo el cuerpo escáner de RM 3T (Intera®, Philips, Holanda) utilizando una pequeña bobina de solenoide animales dedicada (PFL-HH, Hamburgo, Alemania). Los ratones fueron anestesiados como se ha descrito anteriormente [25], [37]. La MRI estaba equipado con un sistema de gradiente estándar con un máx. amplitud de 40 MTM
-1 y una velocidad de subida de 150 Tm
-1 s
-1. Después de un estudio corto, T1 y T2 coronal así como secuencias ponderadas en T2 sagital se utilizaron para la visualización de tumores. En primer lugar, se llevaron a cabo secuencias de eco coronal T1 y T2 turbo espín (TSE). parámetros de imagen para las secuencias coronales: T1 ponderado TSE: tiempo de repetición (TR) = 1275 ms, tiempo de eco (TE) = 33 ms, ángulo de rotación = 90 °, número de cortes = 14, grosor de corte = 1 mm, de matriz = 464 × 480 px, FOV = 100 mm, número de excitaciones (NEX) = 3, voxel reconstruida = 0,21 /0,21 /1 mm
3, longitud de los trenes de eco (ETL) = 4; coronal ponderada en T2 TSE con saturación de la grasa: TR = más corto; TE = 90 ms, ángulo de rotación = 90 °, número de rebanadas = 20, espesor de corte = 1 mm, de la matriz = 448 × 448 px, FOV = 100 mm, el número de excitaciones = 3 y voxel reconstruida = 0,22 /0,22 /1 mm
3. A partir de entonces, una secuencia de T2 TSE sagital mediante saturación de la grasa fue adquirida de acuerdo con los siguientes parámetros: TR = más corto; TE = 90 ms, ángulo de rotación = 90, el número de rebanadas = 22, espesor de corte = 1 mm, matriz = 448 × 448 px, FOV = 100 mm, NEX = 3 y reconstruida voxel = 0,22 /0,22 /1 mm
3. tiempo de examen fue ~ 17 min.
Análisis de imágenes y medición volumétrica
imágenes DICOM fueron procesados con el software libre disponible Osirix®. El diámetro del tumor más grande se midió en las secuencias que mejor se visualizan el tumor. Las mediciones se realizaron por separado por dos investigadores para cada ratón antes y después de la terapia. Además, el volumen del tumor se obtuvo mediante circular manual de la llanta de tumor en cada rebanada, seguido de la construcción automática de un mapa 3D tumor.
colectivo de pacientes, la inmunotinción de análisis de tejidos y los datos humano
Un colectivo de pacientes de 202 pacientes, que se sometieron a cirugía de intención curativa en el Departamento de cirugía en el Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, se examinó tanto para HER2 y CXCR4 expresión mediante inmunotinción. Este estudio fue aprobado por el comité de ética de la cámara de médicos en Hamburgo, Alemania y consentimiento por escrito se obtuvo de todos los pacientes a utilizar las muestras resecadas. Tras un examen histopatológico de los márgenes de resección estaban libres de tumor. estadio y grado tumoral se clasificaron según la clasificación de la metástasis tumoral-nodo de la Unión Internacional contra el Cáncer [40]. muestras de tejido tumoral que habían sido snap-congelado en nitrógeno líquido fueron incorporados en el Compuesto de corte temperatura óptima (Tissue-Tek) y se seccionaron a 5 mm. Para HER2 se utilizó tinción de la HercepTest (DAKO, Glostrup, Dinamarca) de acuerdo con el protocolo del fabricante, utilizando una dilución 1:300 del anticuerpo primario. La inmunotinción fue marcado por el patólogo (U.R.), siguiendo una escala de cuatro pasos (0,1þ, 2Þ, 3a) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones se tiñeron con anticuerpo monoclonal anti-CXCR4 humana (IgG2a, clone12G5; R & amp; D Systems, Minneapolis, MN) a una dilución de 1:100 durante la noche a 4 ° C. Un anticuerpo irrelevante murino IgG1 monoclonal (MOPC21; Sigma, Deisenhofen, Alemania) se utilizó como control negativo. La reacción anticuerpo fue desarrollado con la técnica de fosfatasa alcalina anti-fosfatasa alcalina (APAAP), incluyendo el anticuerpo policlonal anti-ratón de conejo secundario (clon Z0259; Dako, Hamburgo, Alemania) y APAAP tinción complejo (Dako) en combinación con una nueva mancha fucsina (Sena , Heidelberg, Alemania). Para la visualización, las secciones se contratiñeron con una solución de hematoxilina de Mayer (Merck). Las muestras se consideraron immunopositive para CXCR4 cuando más de 20% de todas las células tumorales dentro de una sección se inmunotiñó claramente. Los resultados no variaron cuando se probó otro punto de corte (e.g.5% de células tumorales positivas como un punto de corte). Las muestras de tumores fueron clasificados como teniendo ausente a menor tinción (CXCR4-negativas) si el 20% o menos células tumorales expresadas CXCR4, o de moderado a fuerte tinción (CXCR4-positiva) si más de 20% de las células tumorales expresan CXCR4. El análisis inmunohistoquímico y la puntuación se realizaron por dos investigadores independientes (U.R., S.G.) guía
El análisis estadístico se llevó a cabo en un ordenador personal estándar con el programa SPSS para Windows (versión 11.5.1, SPSS Inc., Chicago, IL).. Se calcularon correlaciones con tablas cruzadas y la significación estadística se determinó mediante la prueba de Fisher con un valor de p de dos caras pruebas de. & Lt; 0,05
Datos estadísticos de análisis
El análisis estadístico de los datos
in vivo
de datos se realizó a través de PASW Statistics 18 (SPSS Inc., Chicago, EE.UU.) en un ordenador personal estándar con un procesador quadcore. Para la determinación de importancia en relación con las diferencias en el crecimiento del tumor y la expresión del receptor, se utilizó el no paramétrico de Mann-Whitney-Wilcoxon-Test. Fisher-exacta de los ensayos para el conde-datos se utiliza para la determinación de la importancia de las metástasis. Para la correlación del volumen tumoral RM y el peso del tumor de Pearson coeficiente de correlación y de HER2 y CXCR4 expresión del rango de Spearman-correlación-coeficiente se utiliza.
Resultados
El objetivo de este estudio fue investigar una posible interacción de la HER2 y receptores CXCR4 y sus niveles de expresión en tratamiento con inhibidores de sus respectivos con el fin de determinar un impacto de CXCR4 expresión en carcinoma de esófago HER2 positivo.
in vitro
la proliferación y migración de células OE19 esofágicas
Para investigar los efectos de la CXCR4- y-receptores HER2 sobre la proliferación celular
in vitro
células OE19 fueron tratados con AMD3100 y trastuzumab , respectivamente. Si bien se espera que el tratamiento trastuzumab conduce a una reducción de crecimiento celular, no se había definido el efecto del tratamiento con AMD3100. La migración celular de las células CXCR4-positivas, sin embargo deberá estar influido por el quimioatrayente SDF-1α.
El
in vitro
ensayos de proliferación celular mostraron de manera reproducible una reducción significativa de la proliferación celular bajo HER2 y CXCR4 receptor de inhibición después del tratamiento con trastuzumab (p = 0,005), así como con AMD3100 (p = 0,02) (Figura 1A). Como era de esperar, el tratamiento con trastuzumab condujo a una reducción más fuerte de la proliferación que el tratamiento con AMD3100. En el ensayo de migración de un efecto dependiente de la dosis sobre la migración celular se observó después del tratamiento con SDF-1α (Figura 1B). La quimiotaxis de las células OE19 CXCR4-positivo de este modo podría ser inducida por SDF-1α (Figura 1C). Los resultados se reproducen con varias concentraciones (datos no mostrados).
A Efecto del tratamiento trastuzumab y ADM3100 sobre la proliferación (%) de células OE19 en comparación con el control en el ensayo de lactato-deshidrogenasa. la inhibición del receptor conduce a la reducción de la proliferación de las células. Se muestra una reducción significativa de la proliferación celular bajo HER2 y la inhibición CXCR4-receptor después del tratamiento con trastuzumab (p = 0,005), así como con AMD3100 (p = 0,02) en comparación con el control sin tratar. B La evaluación microscópica muestra el efecto dependiente de la dosis de la migración celular SDF-1α estimulada en células OE19. CA efecto relevante del SDF-1α sobre la migración celular se observó a 250 ng /ml en comparación con las células no (control).
En vivo
la proliferación del tumor primario en el modelo ortotópico
Para investigar más a fondo el comportamiento del crecimiento del tumor de esófago local y metastásica en
in vivo
células OE19 se implantaron de forma ortotópica en ratones NMRI /nu. Todos los ratones desarrollaron tumores primarios en el lugar de implantación, como se muestra por MRI dos semanas después de la implantación. El peso corporal de los ratones varió desde 18,5 hasta 26,3 g en el comienzo y desde 22,5 hasta 32,7 g a la terminación del experimento. Los medios de los pesos corporales de cada grupo terapéutico al principio y al final del experimento se resumen en la Tabla 1. No se observó ninguna variación significativa. Los ratones se asignaron al azar dos semanas después de la implantación en grupos terapéuticos. Hemos demostrado previamente que el tamaño del tumor dos semanas después de la implantación fueron comparables entre los grupos [37]. En el momento de la terminación del experimento, una resonancia magnética se realizó inmediatamente antes de la disección de los animales. Todos los animales alcanzaron el punto final del estudio sin pérdida severa de peso u otros signos de enfermedad tumoral. pesos de los tumores se registraron y dieron valores entre 0,01 a 3,9 g. volumetría tumoral se realizó y confirmó los resultados del peso del tumor (Tabla 1). Mientras que los valores de peso dentro del control, grupo tratado con AMD3100 grupo tratado con trastuzumab, y trastuzumab /eran más homogéneos, los valores variaron con más fuerza en el grupo tratado con AMD3100. pesos de los tumores en el grupo de control fueron significativamente más altos que en el trastuzumab tratados (p & lt; 0,0001) y trastuzumab /tratada AMD3100 (p & lt; 0,0001) grupos. pesos de los tumores en el grupo de AMD3100 tratados fueron significativamente mayores que en los grupos tratados con trastuzumab (p = 0,04) y trastuzumab /AMD3100 tratados (p = 0,02) (Figura 2A). Aunque el efecto de AMD3100 en el peso del tumor primario no era tan significativa como el efecto de trastuzumab, un potente efecto se logró por tratamiento AMD3100 solo comparado con el grupo no tratado. Los pesos de los tumores en el momento de la autopsia se correlacionaron significativamente con el volumen medido por MRI (coeficiente de correlación: 0,837, p & lt; 0,01). Los ejemplos representativos de imágenes de resonancia magnética para la evaluación de tumor con y sin tratamiento se muestran en la Figura 2B
A diferencias significativas en los pesos tumorales entre los grupos tratados con trastuzumab control y (p & lt; 0,00)., el control y la combinación de trastuzumab /AMD3100 grupos tratados con (p & lt; 0,00), trastuzumab y los grupos tratados con AMD3100 (p = 0,04), y AMD y grupos combinación de trastuzumab /AMD3100 tratados (p = 0,02). Aunque el efecto de AMD3100 en el peso del tumor primario no era tan relevante como el efecto de trastuzumab, un potente efecto se logró por tratamiento AMD3100 solo, en comparación con el grupo no tratado. volumetría tumoral basada en RM B confirmó los resultados del peso del tumor. Los pesos de los tumores en el momento de la autopsia se correlacionó significativamente con la medida volumétrica por MRI (coeficiente de correlación: 0,837, p & lt; 0,01). C micrometástasis en el hígado y el pulmón después del tratamiento con AMD3100 y trastuzumab, se analizaron mediante PCR en tiempo real de acuerdo con el nivel de humano
GAPDH
. AMD3100 y los ratones tratados con trastuzumab mostraron con una media de delta-ct-valor de las reducciones fuertes -2 y -3 en la metástasis pulmonar de 75 a casi el 100%. Además los ratones tratados con trastuzumab tenía una fuerte reducción en la metástasis de hígado representado por una media delta-ct-valor de -3. El grupo de combinación AMD3100 /trastuzumab tuvieron una tasa reducida de pulmón (-2 delta-ct), y el hígado (-3 delta-ct) metástasis. células tumorales D diseminada se detectaron por citoqueratina y HER2 tinción immunhistochemical. La Figura 3B muestra una muestra de médula ósea. Célula humana con una fuerte positividad para HER2 es detectable (rojo).
* Debido a las limitaciones de espacio, AMD3100 fue abreviado a AMD en
Figuras 2a y c
.
potencial metastásico de las células del tumor de esófago
in vivo
a la terminación de la
in vivo
experimento, los tejidos potencialmente metastásicos (pulmón, hígado y ganglios linfáticos) se tomaron muestras y se examinaron histológicamente para evaluar la propagación metastásica del tumor esofágico para cada grupo de tratamiento. Además, las micrometástasis en el hígado y el pulmón se detectaron mediante la expresión del ARNm de la humana
GAPDH
génica mediante análisis en tiempo real PCR a partir de ARN total.
En el grupo control se observó una amplia diseminación metastásica de pulmón , el hígado y los ganglios linfáticos. 20% de los animales tenía la diseminación metastásica agresiva para todos los compartimentos incluyendo pulmón, hígado y ganglios linfáticos múltiples. Por el contrario, el grupo tratado con AMD3100 mostró menos metástasis y sólo un animal expresó diseminación metastásica altamente agresivo para tres compartimentos (pulmón, hígado y ganglios linfáticos). Mientras que la diseminación metastásica en el grupo de tratamiento combinado no fue significativamente menor que en el grupo tratado con trastuzumab, metástasis presentó en solitario.
Al examinar la propagación metastásica en general H.E. y tinción inmunohistoquímico hubo significativamente menos diseminación metastásica encontrado en el grupo tratado con trastuzumab en comparación con el grupo control (p = 0,002). En particular, una reducción significativa de las metástasis pulmonares se pudo observar en comparación con el grupo de control después de AMD3100, trastuzumab y el tratamiento, así como en el hígado después de trastuzumab y el tratamiento combinado (Figura 2C) combinados. Los valores se presentan como micrometastásicas ct-valores delta del control y los grupos tratados.
células tumorales diseminadas en la médula ósea
Para determinar la presencia de células tumorales diseminadas en la médula ósea, las células tumorales diseminadas (DTC) fueron aisladas de médula ósea de ratones por gradiente de densidad y se visualizó mediante inmunotinción cromógeno. El hallazgo de DTC citoqueratina-positivas en la médula ósea indica la extensión de la enfermedad tumoral (Figura 2D).
CXCR4 y HER2 perfil de expresión de células OE19
in vivo
en primer lugar, se examinaron las células OE19 por su expresión de CXCR4 y HER2. No sólo la sobreexpresión de HER2-sino también la amplificación de su gen es de relevancia clínica, por lo que
Her2
estado -amplification se verificó. células OE19 mostraron una fuerte expresión de CXCR4- y receptores HER2 en inmunotinción (Figura 3A), así como una ampliación de la
Her2
-Gene en FISH (Figura 3B). análisis de ARNm Semiquantitive mostró expresión de
CXCR4
y
Her2
en comparación con MDA-MB-231 y RBSK-3 líneas celulares (Figura 3C).
A-expresión de CXCR4 células OE19 determinados por inmunotinción de fluorescencia (IgG1-control) B Confirmación de
Her2
-amplification determinado por hibridación in situ fluorescente (rojo:
Her2
loci -Gene, verde referencia
Cent 17
-loci) C
CXCR4
y
HER-2
análisis de mRNA expresión de la línea celular de cáncer de esófago en comparación con OE19 RBSK-3 líneas de células MDA-MB-231 y nula y control (nc). D CXCR4 y análisis de nivel de expresión de HER2 determinados mediante inmunotinción en el tumor primario, el hígado, los pulmones y ganglios linfáticos. Se muestran imágenes representativas de los tejidos de un animal no tratado (aumento x 100). E Intensidad de HER2 y CXCR4 expresión se anotó en el tumor primario y la metástasis. Positividad-resultados de tumor primario y metástasis respectivos fueron agrupados para evaluar la ocurrencia de y la correlación de la expresión de tumor primario y la de sus respectivos metástasis entre los grupos terapéuticos. el tratamiento con trastuzumab condujo a una ausencia de metástasis y por lo tanto no pudo ser incluido.
* Debido a las limitaciones de espacio, AMD3100 fue abreviado a AMD en
Figura 3e
.
Correlación de CXCR4- y HER2-expresión ortotópico en el
in vivo
modelo
en segundo lugar, los tejidos del tumor primario y metastásico del modelo ortotópico fueron examinados para CXCR4- y HER2-expresión. CXCR4- y HER2-expresión se observó en todos los cojinetes-tejidos tumorales, incluyendo tumor primario, hígado, pulmón y metástasis de ganglios linfáticos (Figura 3D). HER2 expresión correlaciona significativamente con la expresión de CXCR4 (correlación eficiente 0,490, p & lt; 0,01).
Mayor intensidad de HER2 expresión en comparación con metástasis del tumor primario
A fin de evaluar la pertinencia de HER2 - y CXCR4-correlación, un diagrama de punto por punto fue diseñado (Figura 3E), en la que cada caso metastásico fue marcada, lo que indica tanto la intensidad de la expresión de la metástasis (eje y) y la intensidad de la expresión de su respectivo tumor primario (eje x). De acuerdo con el grupo de tratamiento se utilizaron diferentes símbolos. El primer diagrama muestra el HER2-intensidad, el segundo, el CXCR4 intensidad.
Curiosamente, una mayor expresión de HER2 y CXCR4 podría ser visto en las metástasis de todos los grupos terapéuticos en comparación con sus respectivos tumores primarios. La intensidad de la expresión de HER2 (puntuación 1-3) de los tumores primarios y sus respectivos metástasis se aplicaron en el primer diagrama de la Figura 3E. El gráfico mostró que la intensidad de la positividad para HER2 por inmunotinción varía entre los tejidos de los grupos de tratamiento. Mientras que la positividad HER2 del tumor primario en el grupo de control se limita a intensidad más suave (puntuación 1), metástasis expresa HER2 en todas las intensidades. Bajo AMD3100 tratamiento, sin embargo, HER2 se expresa solamente a intensidades más fuertes (puntuaciones 2 + 3) en el tumor primario. Metástasis en el grupo tratado con AMD3100 expresan HER2 casi exclusivamente en la intensidad más alta (puntuación 3).
Al aplicar las puntuaciones de intensidad de CXCR4 positividad (puntuaciones 1-3) de los tumores primarios y metástasis en sus respectivos el segundo diagrama de la Figura 3E, las puntuaciones en el grupo control varió entre intensidades más ligeros y medianos (puntuaciones 1 + 2). A pesar de la intensidad de los niveles de CXCR4 expresión de los tumores primarios en el grupo tratado AMD3100 alcanzó mayores niveles de expresión (puntuación 3), la intensidad de la expresión de CXCR4 metastásico hizo única medida en los niveles medio (puntuación 2).
en ambos diagramas, el grupo tratado con trastuzumab no se pudo evaluar de esta manera ya que no había metástasis. Para el grupo de terapia combinada, sólo hubo dos casos metastásicos que hacen la evaluación estadística no es fiable.
La regulación positiva de la expresión de HER2 en tratamiento AMD3100
hypothesising que la expresión de CXCR4 y /o HER2, su vías respectivas y su interacción están involucrados en la mediación de la progresión tumoral y homing metastásico, cada grupo terapéutico se evaluó por separado como a la intensidad de HER2 y los niveles de CXCR4-expresión. Usando el mismo diagrama (Figura 3E) la intensidad de HER2 y CXCR4 expresión se comparó entre los grupos de tratamiento. En comparación con el grupo control, los HER2-intensidades de metástasis y tumores primarios del grupo AMD3100 tratados están representados por las puntuaciones más altas en todo.
Cuando estadísticamente la comparación de la expresión de HER2 del tumor primario y metástasis entre los grupos terapéuticos, se observó una significativamente mayor HER2-expresión en el grupo tratado con trastuzumab (p = 0,003) y el grupo AMD3100 tratados (p = 0,003) en comparación con el grupo control. Tras el examen de CXCR4-expresión, se observó una expresión significativamente mayor en el grupo tratado con trastuzumab (p = 0,003) y una expresión mayor en el grupo tratado con AMD3100 (p = 0,065) en comparación con el grupo control. El grupo de terapia combinada (trastuzumab /AMD3100) no mostró significativos de expresión de HER2-o CXCR4 expresión diferencias en comparación con el grupo control.
Validación de CXCR4- y HER2-co-expresión en el carcinoma de esófago humano