Extracto
El cáncer de próstata células madre similares (PCSCs) están siendo investigados intensamente debido en gran parte a sus contribuciones a la tumorigénesis de próstata Sin embargo, nuestra comprensión de la biología PCSC, incluyendo sus rutas críticas, se conoce por completo. Si bien el factor de crecimiento epidérmico (EGF) se utiliza ampliamente en el mantenimiento de las células PCSC en vitro, la importancia de la señalización dependiente de EGF y sus vías aguas abajo en PCSC auto-renovación no están bien caracterizadas. Por la investigación de las células DU145 esfera, una población de células de cáncer de próstata con propiedades similares a madre, Presentamos aquí que el receptor del factor de crecimiento epidérmico de señalización (EGFR) desempeña un papel fundamental en la propagación de DU145 PCSCs. La activación de la señalización de EGFR mediante la adición de EGF y la expresión ectópica de un mutante de EGFR constitutivamente activo (EGFRvIII) aumento de la formación esfera. Por el contrario, la inhibición de la señalización de EGFR mediante el uso de inhibidores de EGFR (AG1478 y PD168393) y desmontables de EGFR inhibe significativamente PCSC auto-renovación. De acuerdo con la vía MEK-ERK ser un objetivo importante de la señalización de EGFR, activación de la vía MEK-ERK contribuyó a EGFR-facilitado propagación PCSC. La modulación de la señalización de EGFR afectada activación extracelular relacionado señal-quinasa (ERK). La inhibición de la activación de ERK a través de múltiples enfoques, incluyendo el tratamiento con el inhibidor de MEK U0126, la expresión ectópica de MEK1 dominante negativo (K97M), y la caída de cualquiera de ERK1 o ERK2 dio lugar a una reducción en la propagación robusta PCSC. En conjunto, el presente estudio proporciona evidencia de que la señalización del EGFR promueve PCSC auto-renovación, en parte, mediante la activación de la vía MEK-ERK
Visto:. Rybak AP, Ingram AJ, Tang D (2013) Propagación de próstata humana Las células de vástago como el cáncer ocurre a través de la activación de ERK mediada por EGFR. PLoS ONE 8 (4): e61716. doi: 10.1371 /journal.pone.0061716
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Noviembre 2012; Aceptado: March 17, 2013; Publicado: 19 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Rybak y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por una beca (RMS 79-71) de los Institutos canadienses de Investigaciones Sanitarias de la DT y por el apoyo financiero de la asistencia sanitaria de San José a Hamilton, ON, Canadá, al Centro de Hamilton para la Investigación renal (HCKR). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es la neoplasia maligna más común masculina y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres en los países occidentales [1], [2]. Durante el proceso de la tumorigénesis de próstata, vías de señalización oncogénicas promover la progresión de los carcinomas dependientes de hormonas de la hormona del cáncer de próstata refractario (CPRH), el factor importante que contribuye en las muertes de cáncer de próstata [3], [4]. Aunque los mecanismos exactos responsables de la iniciación y progresión del cáncer de próstata siguen siendo en gran parte desconocido, células madre, como el cáncer de próstata (PCSCs) son ampliamente considerados como críticos en la tumorigénesis de próstata y su evolución hacia la enfermedad CaPHR [5] - [7].
a pesar de la creciente evidencia que sugiere la existencia de PCSCs, la identificación de PCSCs humanos in vivo ha resultado ser una tarea difícil. Este reto se debe en gran parte a la naturaleza heterogénea de cáncer de próstata y las muestras limitadas disponibles a partir de fuentes clínicas. Nuestra comprensión limitada de PCSCs también ha contribuido a la incapacidad para aislar y propagar PCSCs de carcinomas primarios humanos. Para avanzar en el conocimiento de PCSCs, varios grupos de investigación, incluyendo el nuestro, han enriquecido para PCSCs de líneas celulares de cáncer de próstata humano. Esto se debe en gran parte a la demostración de que las células madre del cáncer (CSC) se pueden estudiar usando el ensayo de cultivo esfera en condiciones libres de suero (SF) los medios de comunicación. Este ensayo se ha utilizado para obtener y propagar células madre cancerosas de cerebro [8], de mama [9], colon [10] y las células de cáncer de próstata [11] - [16] in vitro. Más importante aún, el enfoque de la cultura esfera ha permitido la propagación de las células madre, como el cáncer de próstata que muestran propiedades CSC de auto-renovación y la capacidad de iniciar la formación de tumores in vivo [11], [12], [15], [17] . Francia culture
Esfera comúnmente implica la propagación de las células madre como en medios suplementados con SF factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) [8] - [13]. Aunque la presencia de tanto EGF y bFGF permite la generación de esferas a partir de células DU145 [11], [12], [17], si esta es la condición ideal para la generación de esfera y mantenimiento PCSC por un período prolongado de tiempo sigue siendo poco clara. En nuestra reciente investigación, hemos demostrado que EGF desempeña un papel fundamental en la propagación a largo plazo de DU145 PCSCs, y que estas células madre como eran capaces de iniciar los tumores con una capacidad mejorada de manera significativa en no obesos, inmunodeficiente diabética /severa combinada (NOD /SCID) los ratones [11]. Sin embargo, el papel de la señalización del EGFR, junto con sus vías descendentes que se requieren para la propagación DU145 PCSC aún no se han caracterizado.
En nuestro esfuerzo para avanzar en este conocimiento, demostramos aquí que la conexión EGFR-ERK juega un papel importante en la propagación de DU145 PCSCs. Aunque estos PCSCs son capaces de propagarse en ausencia de EGF exógeno, la activación de la señalización de EGFR es crítica para el mantenimiento de DU145 PCSCs como la manipulación experimental de la señalización afectada propagación DU145 PCSC EGFR. Además, la modulación de la señalización de EGFR en PCSCs DU145 afectó profundamente a la activación de ERK. Además, la inhibición de la activación de ERK mediante el uso de un inhibidor de MEK, la expresión ectópica de MEK1 dominante negativo (K97M), y desmontables de ERK1 o ERK2 endógeno, reduce colectivamente la propagación de DU145 PCSCs. Tomados en conjunto, estos resultados ponen de manifiesto una contribución de la señalización de MEK-ERK para PCSCs EGFR mediada por auto-renovación.
Materiales y Métodos
Cultivo celular y propagación de DU145 PCSCs
células de cáncer de próstata humano DU145 y células de riñón embrionario humano 293T se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.), y se cultivaron de acuerdo con las instrucciones de la ATCC.
células madre, como el cáncer de próstata humano
DU145 fueron aislados y propagada tal como se publicó anteriormente [11]. Brevemente, las células en monocapa DU145 fueron enzimáticamente disociarse en células individuales utilizando solución de rojo fenol libre de TrypLE expreso (Life Technologies, Calsbad, CA, USA) y 40 micras coladores celulares (BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE.UU.), y posteriormente se volvieron a suspender a una densidad sub-clonal (5 células /l) en medio libre de suero (SF) (DMEM /F12 en una mezcla 03:01) (Life Technologies) que contiene 0,4% de albúmina de suero bovino (BSA) (Bioshop Canadá Inc., Burlington, ON, Canadá) y 0,2 x B27 carece de vitamina a (Life Technologies) en matraces T75 (15 ml de volumen total) designado para el cultivo de células en suspensión (Sarstedt Inc., Newton, NC, EE.UU.). Al examinar el efecto del tratamiento EGF en la formación de esfera, se añadió EGF recombinante (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) a una concentración de 10 o 20 ng /ml. típicas esferas formadas en 10 a 12 días. Esfera células se subcultivaron mediante disociación enzimática, tensas, y luego se volvieron a suspender en el medio anterior a una densidad de sub-clonal.
Esfera ensayos de formación de
Para evaluar la formación de esferas primarias, células DU145 de sub-confluente (~ 80%) cultivos monocapa se resuspendieron en el anterior medio SF a una densidad de 2,5 × 10
3 células en pocillos individuales de una placa de cultivo de 24 pocillos (3 pocillos por tratamiento) (Corning, Corning , Nueva York, EE.UU.). Las células se sembraron en un volumen de 0,5 ml /pocillo, a diferencia de 1 ml /pocillo tal como se publicó anteriormente [11]. Se contaron las esferas que se formaron después de 12 días de cultivo. Para medir la capacidad de formación de esferas de esferas secundarias o establecidos, esferas células fueron individualizados por disociación enzimática, se cuela, y luego en placas a una densidad de 5 × 10
2 o 1 × 10
3 células /pocillo en 24 -Bueno placas (3 pozos por tratamiento), a menos que se especifique lo contrario. Las esferas que se formaron fueron contadas después de 12 días de cultivo.
Los plásmidos y virus
Producción
EGFRvIII /pLNCX fue proporcionado amablemente por el Dr. Khalid Al-Nedawi (Hamilton Centro de Investigación del riñón, Hamilton, ON, Canadá). EGFR (K721A) /pLHCX fue proporcionado amablemente por el Dr. Joan Krepinsky (Hamilton Centro de Investigación del riñón). Construcción de MEK1 (K97M) /pLHCX se ha descrito anteriormente [18]. ERK1 corto horquilla y ERK2 de orientación (shERK1 y shErk2, respectivamente) vectores se construyeron mediante el recocido y subclonación de las secuencias previamente publicadas de orientación (ERK1: GCCATGAGAGATGTCTACA; ERK2: GAGGATTGAAGTAGAACAG) [19] como una horquilla en el vector retroviral Prih, de acuerdo con nuestra condiciones publicadas [18]. El vector de control-horquilla corta (shLacZ) contiene una secuencia de dirección
Escherichia coli
β-galactosidasa (shLacZ secuencia diana: GCAGTTATCTGGAAGATCA). Altos títulos de vector vacío (EV) /pLNCX, EGFRvIII /pLNCX, EV /pLHCX, EGFR (K721A) /pLHCX, MEK1 (K97M) /pLHCX, shLacZ /Prih, shERK1 /Prih y shErk2 /Prih retrovirus fueron producidos utilizando células 293T , como se describe anteriormente [18]. células DU145 se infectaron a continuación con el retrovirus específico, y se seleccionaron las células infectadas en higromicina (0,5 mg /ml; Life Technologies) para pLHCX y las infecciones basados en Prih, o G418 (1 mg /ml; Sigma-Aldrich) basados en pLNCX para infecciones. Ectópico EGFRvIII y MEK1 (K97M) la expresión, o desmontables de ERK1 o ERK2 endógeno, se verificaron mediante análisis de transferencia Western.
Short-horquilla EGFR orientación vectores lentivirales se adquirieron de Sigma-Aldrich, con las secuencias de direccionamiento (shEGFR1 : GCTGCTCTGAAATCTCCTTTA; shEGFR2: GCCACAAAGCAGTGAATTTAT) clonado como una horquilla en el vector pLKO.1, mientras que un shRNA no específica (plásmido 1864; Addgene, Cambridge, MA, EE.UU.) se utilizó como control (shCTRL). Producción de shEGFR y shCTRL lentivirus se llevó a cabo por co-transfección de cada plásmido shRNA (10 g) con plásmidos (10 g cada uno) necesarios para la producción lentiviral tercera generación (pRSV-Rev, pCMV-VSV-G, pMDLg /pRRE) [ ,,,0],20], proporcionado amablemente por el Dr. Bryan E. Strauss (Universidad de Sao Paulo Facultad de Medicina, Sao Paulo, Brasil), en células 293T utilizando el método de fosfato de calcio. Sesenta horas (h) después de la transfección, los sobrenadantes que contienen VSV-G pseudotyped, se recogieron partículas de lentivirus de replicación incompetente, se filtró a través de un filtro de 0,45 micras y se centrifugó durante 2 horas a 48.000 g. gránulos virales se resuspendieron en 1 ml de medio que contiene 10 mg /ml de polibreno (Sigma-Aldrich) y se añaden a monocapa de células durante 2 h en un humidificado 37 ° C incubadora, con mezcla periódica a intervalos de 20 min, para permitir la infección de la célula. La infección se selecciona con puromicina. (1 mg /ml; Sigma-Aldrich)
Para la infección de las células de la esfera, las pastillas de lentivirus shEGFR2 y shCTRL se resuspendieron en 2 ml de medio libre de suero que contiene 0,4% de BSA, 0,2 × B27 (que carece de vitamina a) y 10 mg /ml de polibreno y se añadió a individualizado (3 × 10
5) las células durante 2 h en un humidificado 37 ° C incubadora, con mezcla periódica a intervalos de 20 min, para permitir la célula infección. células de Esfera se sembraron posteriormente a una densidad de 10
4 células /ml en matraces T75 designados para el cultivo celular de suspensión (Sarstedt Inc.). Se añadió puromicina (1 mg /ml) a los cultivos esfera a las 48 horas después de la infección.
independiente de anclaje ensayo de crecimiento
cultivos de células DU145 esfera se sembraron en pocillos individuales de seis pocillos placas a una densidad de 10
4 células /pocillo como se ha descrito previamente [11]. Después de 8 semanas, se tomaron imágenes de contraste de fase en 5 campos al azar por pocillo usando el microscopio Zeiss Axiovert 200 M (software AxioVision 3.1) con 25 aumentos, y se contaron las colonias que constan de células ≥50. imágenes de contraste de fase se procesaron posteriormente utilizando el software de CorelDRAW Graphics Suite X4 (Corel, Ottawa, ON, Canadá).
EGFR y MEK Estudios de inhibición
Los inhibidores de EGFR AG1478 y PD168393 (Calbiochem, Darmstadt, Hesse, Alemania) y el inhibidor de MEK U0126 (Promega, Madison, WI, EE.UU.) se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO; Sigma-Aldrich) y se utilizaron a las concentraciones indicadas. DMSO se administró en un volumen idéntico como control (tratamiento simulado). inhibidor de EGFR (AG1478 o PD168393), MEK (U0126) o DMSO tratamiento (mock) se administró en el momento de la siembra de células esfera. formación de esferas se cuantificó como se indica anteriormente. La inhibición de la actividad de la quinasa EGFR y MEK1 (determinado por EGFR y ERK1 /2 estado de fosforilación, respectivamente) se verificó por análisis de transferencia Western.
basados en anticuerpos función EGFR experimentos de bloqueo en las células de la esfera se llevaron a cabo como se describió previamente [21]. En pocas palabras, sin azida EGFR bloqueando monoclonal de ratón (Ab-1, el clon 528) anticuerpo (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) o el ratón IgG2a anticuerpo de control de isotipo (amp I +; D Systems, Minneapolis, MN, EE.UU.) se añadieron a células esfera (en el momento de la siembra) a una concentración de 4 mg /ml en presencia o ausencia de EGF recombinante (10 ng /ml). Esferas se les permite formar y se cuantificaron como se ha indicado anteriormente.
Análisis Western Blot
enteras lisados celulares se prepararon en un tampón de lisis que contenía Tris 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, 1 EDTA mM, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100, pirofosfato sódico 25 mM, NaF 1, 1 mM β-glicerofosfato, ortovanadato 0,1 mM de sodio, PMSF 1 mM, 2 mg /ml de leupeptina y 10 mg /ml de aprotinina. Para cada muestra, se utilizó un total de 50 g de lisado de células enteras a menos que se especifique lo contrario. Los lisados se resolvieron (10% geles de poliacrilamida-SDS) se transfirieron a membranas de Amersham Hybond-ECL (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Reino Unido). Las membranas se bloquearon con 5% de solución salina w /v de leche no grasa seca desnatada a temperatura ambiente durante 1 h, y después se incubaron con los anticuerpos primarios indicados en 10 ml de tampón de dilución de anticuerpo (1 × Tris tamponada que contiene 0,1% Tween- 20 (TBST), y 5% de BSA) con agitación suave a 4 ° C durante la noche. Los anticuerpos primarios utilizados para el sondeo fueron los siguientes: conejo fosfo-EGFR (Tyr1068) (Sigma-Aldrich, E6154, 1:1000), anti-humano de conejo anti-EGFR humano (# 4267, 1:1000), conejo fosfo anti-humana -AKT (Ser473) (# 4058, 1:1000), de conejo anti-humano fosfo-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (# 9101, 1:1000), de conejo anti-humano ERK1 /2 (# 9102, 1: 1000), conejo fosfo-STAT3 anti-humano (Tyr705) (# 9145, 1:2000), ratón anti-humano STAT3 (# 9139, 1:1000) de Señalización celular Tecnología (Danvers, MA, EE.UU.), anti-cabra AKT humana (C-20, 1:1000), ratón MEK1 anti-humano (H-8, 1:1000) y el ratón α-tubulina anti-humana (TU-02, 1:500) de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz , CA, EE.UU.). Las membranas se lavaron posteriormente con 1 x solución TBST y se incubaron (1 h a temperatura ambiente), ya sea con burro anti-cabra-IgG-peroxidasa de rábano picante (HRP) (Santa Cruz Biotechnology, sc-2033, 1:3000), burro anti- ratón-IgG-HRP (GE Healthcare, NA931V, 1:3000) o burro anti-conejo-IgG-HRP (GE Healthcare, NA934V, 1:3000) anticuerpos secundarios conjugados. señales de inmunotransferencia se detectaron utilizando Amersham ECL Western Blot detección reactivos (GE Healthcare) y luego se expusieron a una película de rayos X (Thermo Fisher Scientific). La cuantificación de la banda densidades de inmunoblot se determinó utilizando el software ImageJ. (Versión 1.43u; W. Rasband, Instituto Nacional de Salud)
Análisis estadístico
Todos los datos cuantitativos se presentan como media ± S.E.M. y las comparaciones se hicieron usando-Student de dos colas independientes
t-pruebas
. Un
p-valor
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
DU145 Esferas propagados en ausencia de exógenos mitógenos Pantalla EGFR señal de activación
Hemos informado anteriormente de que mientras que la suplementación EGF promovió significativamente la generación y propagación de las esferas DU145, la formación de las esferas no se requiere la adición de EGF exógeno [11] lo que sugiere que la señalización de EGFR puede ser activado en ausencia de EGF exógeno. Para investigar esta posibilidad, se han generado las esferas de células DU145 en ausencia (-EGF) y presencia de EGF (10 o 20 ng /ml EGF; 10EGF o 20EGF, respectivamente) y posteriormente propagado estas esferas establecidos para tres pasajes, bajo la condiciones idénticas en el que se generaron esferas primarias, antes de la evaluación de su capacidad de formación de esferas. Esferas generados en la condición de los medios de comunicación -EGF se pueden mantener de manera coherente durante al menos tres pasajes. Además, la capacidad para generar y mantener las esferas en la condición -EGF (Figura 1A) sugiere que la propagación en condiciones de medios de comunicación-EGF libre (también sin la adición de otros factores de crecimiento externo) es una propiedad intrínseca de DU145 PCSCs. Esta posibilidad está apoyada por el hecho de que el número de esferas mantiene después de la siembra de 5 × 10
2 células /pocillo fue de aproximadamente la mitad de ese propagado después de la siembra 1 × 10
3 células /pocillo (Figura 1A). Por otra parte, esta posibilidad también está en consonancia con nuestra reciente observación de que -EGF esferas se han propagado en los medios de comunicación -EGF durante más de 15 pases consecutivos, en la forma consistente como se indica en la figura 1A, en el momento de elaboración de este manuscrito (datos no mostrado). Aunque EGF mejorada propagación esfera comparación con las células cultivadas en medios esfera -EGF (10EGF y 20EGF comparación con -EGF), 20EGF no estimuló aún más la esfera número en comparación con el tratamiento 10EGF. Esto sugiere que un umbral de EGF inducida existe (Figura 1A).
A) EGF aumenta la esfera formación independiente de la densidad de la siembra de células. esferas DU145 se generaron y se mantuvieron en medios libres de suero que contienen 0,4% de BSA y 0,2 × B27 (SF), y suplementado con o sin EGF (10 o 20 ng /ml; 10EGF o 20EGF, respectivamente) para tres pasajes para establecer EGF- cultivos libres (-EGF) y EGF-estimulado esfera antes de la experimentación. células esfera se sembraron a una densidad de 5 × 10
2 y 1 × 10
3 células /pocillo (1 × 10
3 y 2 × 10
3 células /ml, respectivamente) en 24 -Bueno placas (tres repeticiones por tratamiento). Se realizaron seis experimentos. Esferas que se mantienen en los números de la esfera EGF-complementado medio SF de visualización mejorada en comparación con cultivos esfera -EGF. Esferas mantuvieron en medios que contienen SF & gt; 10 ng /ml de EGF no muestran aumentos adicionales en la capacidad de formación de esferas. B) Tratamiento de -EGF esferas con concentraciones crecientes de EGF (+ 10EGF o + 20EGF, respectivamente) aumento de la formación esfera, y C) una mayor activación de la señalización de EGFR (EGFR fosforilación en Tyr1068; EGFR-P). los números de la esfera se muestran como media ± S.E.M. de cuatro experimentos independientes. (*
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el estado del soporte -EGF respectiva; dos colas de Student independiente
t-test
) guía empresas
para examinar si las esferas generados y mantenidos en el estado del soporte de -EGF responden a la activación de la señal de EGFR, hemos establecido cultivadas, esferas EGF-libres en presencia de EGF exógeno. No sólo estas células esfera sin EGF responden al tratamiento EGF exógeno cuando se sembraron a densidades sub-clonales de 5 × 10
2 y 1 × 10
3 células /pocillo (1 × 10
3 y 2 x 10
3 células /ml, respectivamente) (Figura 1B), pero también responden a EGF al mismo nivel que las esferas generados y mantenidos en medios que contienen EGF-(comparar la Figura 1B con la Figura 1A). Estas observaciones indican que en ausencia de EGF exógeno, esferas pueden ser capaces de activar la señalización EGFR. En apoyo de esta posibilidad, la fosforilación de EGFR en tirosina (Y) 1068 (EGFR-P), un marcador sustituto de uso común de la activación de la señal de EGFR [22], se detectó fácilmente en -EGF y + EGF (10EGF y 20EGF) células esfera (Figura 1C). En su conjunto, estas observaciones apoyan la idea de que la señalización de EGFR desempeña un papel importante en la propagación de DU145 PCSCs.
forzadas EGFR señal de activación Renders DU145 PCSCs no responden al tratamiento EGF
Para más determinar el papel de la activación de la señal EGFR en DU145 PCSCs, el mutante de EGFR constitutivamente activo, variante EGFR III (EGFRvIII) [23], se sobreexpresa en las células en monocapa DU145 (Figura 2A). células EGFRvIII que expresan muestran niveles elevados de fosforilación Tyr1068 (EGFR-P) y la activación de ERK (fosforilación Thr202 /Tyr204 en ERK1 /2; ERK1 /2-P) en SF medios de comunicación (figura 2A), lo que demuestra que la expresión de EGFRvIII ectópico resultó en constitutiva la señalización de EGFR. En comparación con el vector vacío (EV) células DU145 transducidas, las células DU145 EGFRvIII que expresan generan esferas más primarios en medios -EGF (Figura 2B). Además, la suplementación con EGF promovió la generación de esferas primarias de células EV DU145 pero no células EGFRvIII que expresan (Figura 2B). Sin embargo, las células que expresan EGFRvIII-esfera puede formar esferas primarias en medios -EGF a un nivel similar como células DU145 esfera EV propagan en presencia de EGF exógeno (Figura 2B). Por lo tanto, las células DU145 EGFRvIII que expresan poseen una capacidad comparable para la generación de esfera primaria como células EV DU145 estimuladas con EGF recombinante (Figura 2B). Observaciones similares se obtuvieron también en la propagación de la esfera (es decir la producción de esferas secundarias a la siembra de 10
3 células /pocillo) (Figura 2C). En conjunto, estos resultados apoyan nuestra hipótesis de que la señalización del EGFR contribuye a la propagación de DU145 PCSCs
A) Análisis de transferencia Western de la expresión EGFRvIII y la activación (fosforilación Tyr1068;. EGFR-P) en DU145 padre (monocapa de células cultivadas) en medio de suero suplementado (10% de FBS) y libres de suero (SF). expresión EGFRvIII en las células DU145 se activa la señalización de ERK. la activación de ERK se determinó mediante el examen de la fosforilación de las proteínas ERK1 y ERK2 en Thr202 y Tyr204 residuos, respectivamente (ERK1 /2-P). B) primaria (1 °) y C) secundaria formación de esferas (2 °) siguiente expresión EGFRvIII en las células DU145 comparación con las células de control de vector vacío (EV). Las células se sembraron en medio libre de suero que contiene 0,4% de BSA, 0,2 × B27 y carente de factores de crecimiento exógenos (-EGF), o con EGF suplementado (10 ng /ml; 10EGF), a una densidad de 2,5 × 10
3 (1 ° formación esfera) o 1 × 10
3 células /pocillo (2 ° formación de esferas) en placas de 24 pocillos (0,5 ml /pocillo; tres réplicas por tratamiento). Los experimentos se realizaron por triplicado. los números de la esfera se muestran como media ± S.E.M. (
Los valores p para las comparaciones
indicados fueron obtenidos por
t-test
-Student de dos colas independientes).
El bloqueo del EGFR reduce la capacidad de auto-renovación de DU145 PCSCs
Para investigar más el requisito de la señalización de EGFR en la propagación (auto-renovación) de DU145 PCSCs, hemos examinado el efecto de la inhibición de señales de EGFR en el mantenimiento de la esfera. células de Esfera se trataron con concentraciones crecientes de AG1478 (tirfostina), un inhibidor selectivo de la actividad quinasa de EGFR (ErbB1) que funciona mediante el secuestro en su forma inactiva [24]. AG1478 tratamiento fue examinado a las 24 h post-tratamiento, como tratamiento EGF alcanzó los niveles más altos de EGFR-P en las células de la esfera en este punto del tiempo (Figura S1). tratamiento AG1478 reduce la activación del EGFR en una manera dependiente de la dosis en células de esfera, con y sin la adición de EGF exógeno (Figura 3A). Además, dependiendo de la dosis AG1478 reduce la propagación de esfera, como el número de esferas generados a partir de cultivos celulares establecidos esfera se redujo mediante el tratamiento AG1478, independientemente de si exógeno EGF estaba presente (Figura 3B). Observaciones similares también se obtuvieron usando la PD168393 inhibidor de EGFR [25] (Figura 3C). Esto demuestra que la inhibición de señalización de bloques de la capacidad de auto-renovación de DU145 PCSCs EGFR.
A) análisis de transferencia de Western de lisados de células enteras después del tratamiento 24 horas de esferas DU145 con DMSO (D) o concentraciones crecientes de AG1478 ( 0,1 a 20 mM intervalo de concentración), en presencia o ausencia de EGF exógeno (10 ng /ml; 10EGF). formación de la esfera de las células de la esfera sin EGF se inhibió tras el tratamiento con inhibidores de EGFR B) AG1478 o C) PD168393 a diversas dosis en presencia (10EGF) o ausencia (-EGF) de EGF exógeno (10 ng /ml). células de Esfera se sembraron a una densidad de 2 × 10
3 células /pocillo (0,5 ml /pocillo; tres réplicas por tratamiento). inhibidor de EGFR (AG1478 o PD168393) o tratamiento DMSO (mock) se administró en el momento de la siembra. Esferas que se formaron se contaron 12 días después de la siembra. los números de la esfera se muestran como media ± S.E.M. (
Los valores p para las comparaciones
indicados se obtuvieron de dos colas de Student independiente
t-test
).
Para hacer frente, además, si la pérdida de la señalización del EGFR afecta a la capacidad de DU145 PCSCs para mantener a sí mismos, monocapa de células DU145 se infectaron con shRNA construcciones diana EGFR. Estas construcciones derribado eficiente EGFR, con ligeramente variaciones en los niveles de EGFR desmontables dentro de las líneas celulares estables respectivos (Figura 4A). El shEGFR constructo#2 (shEGFR2) alcanzó una caída mayor que shEGFR1 (95% vs 70%, respectivamente) (Figura 4A). líneas celulares estables EGFR desmontables pueden ser mantenidos en medio completo. Sin embargo, la expresión ectópica de EGFR (K721A), un mutante de EGFR que carecen de la proteína actividad tirosina quinasa [26], dio como resultado la muerte celular y evita la generación de una línea celular estable (datos no mostrados). Mediante el uso de estas líneas celulares estables EGFR desmontables, hemos sido capaces de demostrar que desmontables de EGFR en las células DU145 reducido su capacidad de generar esferas primarias en comparación con las células shCTRL (Figura 4B). También se examinó la capacidad de EGFR desmontables para afectar el mantenimiento esfera. Estable desmontables EGFR en células de esfera (Figura 4C) redujo el número de esferas posteriores formadas en la condición de los medios de comunicación -EGF (Figura 4D).
A) monocapa de células DU145 se infectaron con EGFR shRNA construcciones lentivirales y seleccionaron con puromicina con el fin de generar líneas celulares estables. El análisis de transferencia Western de diversas células desmontables EGFR (shEGFR) se llevó a cabo para evaluar la eficiencia EGFR desmontables respecto a la línea de células de control no específica shRNA (shCTRL). B) EGFR Estable desmontables células forman menos primaria (1 °) esferas en comparación con las células shCTRL. Las células se sembraron a una densidad de 2,5 x 10
3 células /pocillo (0,5 ml /pocillo; tres réplicas por tratamiento). los números de la esfera se muestran como media ± S.E.M. de tres experimentos independientes (*
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el estado del soporte -EGF respectiva para cada línea celular;-Student de dos colas independientes
t-test
). C) Efficient knockdown EGFR en esferas DU145 establecidos también se puede lograr. Las células de las esferas sin EGF (-EGF) se infectaron con shCTRL y shEGFR2 lentivirus. La pérdida de expresión de la proteína EGFR reduce significativamente el número D) de esferas DU145 cultivadas en condiciones de medios de comunicación sin EGF. knockdown EGFR (shEGFR2) y las células esfera shCTRL se sembraron a una densidad de 1 × 10
3 células /pocillo (tres repeticiones por línea celular). El número de esferas que se formó se contó 12 días después de la siembra. la esfera número se muestra como media ± S.E.M. de tres experimentos independientes (**
p Hotel & lt; 0,01; dos colas de Student independiente
t-test
). E) desmontables de EGFR en las células DU145 esfera redujo significativamente su vitro crecimiento independiente de anclaje en. El número total de colonias en 5 campos aleatorios (con 25 aumentos) se cuentan y se representan como media ± S.E.M. de tres experimentos independientes (**
p Hotel & lt; 0,01; dos colas de Student independiente
t-test
). imágenes de contraste de fase representativas de las colonias se presentan a 50X (recuadro). La barra de escala es igual a 100 micras
Una característica importante de la transformación celular in vitro, que se correlaciona estrechamente con la tumorigenicidad in vivo en ratones inmunocomprometidos [27] - [29]., es la capacidad de las células tumorigénicas para propagar en condiciones independientes de anclaje. Para determinar si la pérdida de la expresión de EGFR afecta el crecimiento independiente de anclaje de DU145 PCSCs, las células esfera EGFR desmontables establecidos se sembraron en, suave medios que contienen agar-suplementado con suero. desmontables de EGFR en células esfera resultó en un menor número de colonias en agar blando en comparación con las células shCTRL esfera bajo condiciones de diferenciación (es decir. complementado con suero) (Figura 4E). Tomados en conjunto, hemos demostrado que la señalización del EGFR es fundamental para mantener la propagación DU145 PCSC, lo cual es consistente con la reducción observada en el número de colonias en agar blando tras caída de EGFR.
MEK-ERK regula la señalización de las propiedades de auto-renovación de DU145 PCSCs
Después de la demostración de que la señalización del EGFR es fundamental en la generación y mantenimiento de PCSCs, hemos examinado aún más los mecanismos intermedios responsables de la actividad del EGFR observado. la señalización de EGFR es bien conocido para iniciar los eventos de señalización que implican la activación de la PI3K-AKT y Raf-MEK-ERK (activadas por mitógenos proteína quinasas; MAPK) vías [30]. Además, la señalización de EGFR se ha demostrado para activar el transductor de señal y activador de las proteínas de transcripción (STAT) [31], en particular STAT3 mediada por la señalización [32]. La activación de STAT3 implica la fosforilación en Tyr705 [33], y STAT3 se ha demostrado para ser activado en los cánceres de próstata [34], [35]. Nuestro trabajo previo ha sugerido que, en nuestro sistema, otras proteínas de señalización corriente abajo, en lugar de AKT, deben ser crítico para la formación DU145 esfera mejorada-EGF [11]. Si bien AKT puede contribuir a la propagación DU145 esfera, hemos ampliado aún más en nuestro informe anterior para examinar las contribuciones de la vía ERK hacia la propagación del EGFR que dependen de DU145 PCSCs.
En este esfuerzo, hemos sido capaces de demostrar que EGF estimulación de las células DU145 esfera sin EGF resultó en la activación de ERK, pero no la activación de STAT3, de una manera dependiente del tiempo (Figura S1). Además, el inhibidor MEK, U0126 [36], dependiente de la dosis redujo la capacidad de auto-renovación de DU145 PCSCs (Figura 5A). Como era de esperar, U0126 inhibe la activación de ERK en DU145 PCSCs (Figura S2). Para consolidar los resultados que implican la señalización de MEK-ERK en la propagación DU145 PCSC, hemos expresado la MEK1 dominante negativo (K97M) [37] en las células DU145 (Figura 5B). MEK1 (K97M) las células muestran la activación de ERK reducido en comparación con las células de control de vector (EV) vacíos siguientes FBS-estimulación (10%) de las células privadas de suero (Figura 5B). En comparación con células EV, las células MEK1 (K97M) muestran una reducción significativa en la generación de esferas primarias (Figura 5C). En apoyo de la señalización de MEK-ERK siendo fundamental para la generación de EGFR mediada por DU145 PCSCs, EGF exógeno era incapaz de seguir mejorando la formación de ámbito primario de células MEK1 (K97M) (Figura 5C).
A) La inhibición de ERK