Extracto
Gynura procumbens gratis (Lour.) Merr. Pertenece a la familia de las asteráceas. La planta es una hierba tradicional conocido en el sudeste de Asia y que es ampliamente utilizado para tratar la inflamación, molestias en los riñones, nivel alto de colesterol, la diabetes, el cáncer y la hipertensión arterial. Nuestro estudio anterior mostró la presencia de proteínas de defensa de las plantas valiosas, como la peroxidasa, taumatina como las proteínas y miraculin en la hoja de
G. procumbens
. Sin embargo, los efectos de estas proteínas de defensa en los cánceres no se han determinado previamente. En el presente estudio, se determinó la bioactividad de filtración en gel de proteínas
G fraccionado. procumbens
extracto de hoja. La fracción de proteína activa, se encontró SN-F11 /12, para inhibir el crecimiento de una línea celular de cáncer de mama, MDA-MB-231, en un valor de EC50 de 3,8 g /ml. Las expresiones de ARNm de marcadores de proliferación, Ki67 y PCNA, se redujeron significativamente en las células MDA-MB-23 tratadas con SN-F11 /12. La expresión de marcador de invasión, CCL2, también se encontró reducida en las células MDA-MB-231 tratadas. Todos estos resultados ponen de relieve la propiedad anticancerígena de SN-F11 /12, por lo tanto, las proteínas de esta fracción puede ser un agente quimioterapéutico potencial para el tratamiento del cáncer de mama
Visto:. Hew CS, Khoo POR, Gam LH (2013) La propiedad anti-cáncer de proteínas extraídas de
Gynura procumbens gratis (Lour.) Merr. PLoS ONE 8 (7): e68524. doi: 10.1371 /journal.pone.0068524
Editor: Natarajan Aravindan, Universidad de Oklahoma Health Sciences Center, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Marzo, 2013; Aceptado: 29-may de 2013; Publicado: 11 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Hew y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por RU beca de la Universidad Sains Malaysia (número de proyecto: 1001 /PFARMASI /815034). Los autores también agradecen El Instituto de Estudios de Posgrado de la Universidad Sains Malaysia para proporcionar becas que cortasen Chaw-Sen. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Muchos de los fármacos disponibles en la actualidad son de origen vegetal, y los péptidos y proteínas vegetales han resultado ser una fuente importante de compuestos biológicos que mostraron actividades biológicas que pueden ser explotadas en forma de fármaco. Entre las actividades que se descubrieron fueron la actividad antitumoral de los péptidos extraídos de
Hypericum perforatum, Chelidonium majus L
.,
Inula L
.,
Equiseteum arvense L
. y
Inonotus oblicuo
[1]; anti-VIH propiedad del péptido macrocíclico extraído de
Palicourea
condensado [2]; la actividad anti-microbiana de proteínas taumatina como extraídos de cebada cervecera [3] y en diferentes tipos de proteínas de plantas '[4]. Los productos a base de plantas que incluyen proteínas y compuestos moleculares pequeños se han sugerido como los fármacos favorables para el tratamiento del cáncer, en vista de los muchos efectos adversos ejercidas por los tratamientos actuales contra el cáncer, es decir, la quimioterapia y la radioterapia. Por otra parte, estos tratamientos son costosos, lo que puede ser una carga para los pacientes. Las plantas contienen diversos ingredientes activos que se pueden utilizar como medicina para el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer de mama [5]. El cáncer de mama es la principal causa de muerte por cáncer entre las mujeres en todo el mundo [6]. Aunque la radioterapia y la quimioterapia son los modos habituales de tratamiento que se da a los pacientes con cáncer, el tratamiento eficaz para el cáncer de mama siendo limitada. A la luz de esto, se debe tomar un esfuerzo significativo para luchar por agentes eficaces de la planta para identificar los agentes más novedosos para la prevención y el tratamiento de los cánceres humanos.
Gynura procumbens gratis (Lour.) Merr . es una hierba tradicional conocido en el sudeste asiático. La planta pertenece a la familia de las asteráceas. Esta planta es de unos 10-25 cm de alto y se presenta con hojas suculentas, elípticas y brillantes de color púrpura [7]. Las hojas de
G. procumbens
han servido como alimento desde hace décadas en Malasia, donde generalmente se consume cruda como ensalada. Además, la planta se utiliza ampliamente para tratar la inflamación, molestias en los riñones, nivel alto de colesterol, la diabetes, el cáncer y la hipertensión arterial [7], [8]. De hecho,
G. procumbens
se utiliza tradicionalmente en el sudeste de Asia por su valiosa propiedad medicinal. Los compuestos de bajo peso molecular extraídos de
G. procumbens
han sido reportados para visualizar contra el cáncer [9], anti-oxidante [10], anti-inflamatoria [11], las actividades anti-hiperglucémicos y anti-hiperlipidémicos [12]. Por otra parte, hemos detectado la presencia de proteínas de defensa de las plantas de valor, tales como peroxidasa, taumatina-como las proteínas y miraculin de la hoja de
G. procumbens
[13], [14]. Sin embargo, nunca se han determinado los efectos del extracto de proteína en cáncer. Por lo tanto, el objetivo fue analizar la actividad citotóxica de las proteínas extraídas de las hojas de
G. procumbens
utilizando deshidrogenasa (LDH) ensayo de citotoxicidad de lactato y a partir de entonces para determinar la ruta de mecanismo de citotoxicidad a través de la expresión de marcadores de proliferación y la invasión en las células MDA-MB-231 tratadas usando la reacción en cadena de la polimerasa semi-cuantitativa (PCR). Además, las proteínas activas se identificaron utilizando el análisis de espectrometría de masas. Esperamos que los datos obtenidos serán de utilidad para la futura intervención de fármacos basados en proteínas para la terapia del cáncer.
Materiales y Métodos
Materiales plantas
Las hojas de
GRAMO. procumbens
se obtuvieron de Penang, Malasia. No se necesitaron permisos específicos para la recogida de las hojas y la planta no es una especie de plantas protegidas. Un número de comprobante de la muestra (11209) fue depositado en el Herbario de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Sains Malaysia. Las hojas frescas se lavaron dos veces con agua del grifo y se enjuagan con agua destilada.
extracto de proteínas y purificación
La proteína se extrajo por el método de Kiba
et al.
(2003) [15] con una ligera modificación. Las hojas frescas de
G
.
procumbens
(1 kg) se conecta a tierra a una forma de polvo fino en nitrógeno líquido usando mezclador y se mezcla con 3 L de tampón de extracción [10 mM NaH
2 PO
4, mM Na 15
2HPO
4, 100 mM de cloruro de potasio, 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético, tiourea 2 mM, phenylmethanesulfonylfluoride 1 mM y 1,5% (w /v) de polivinilpolipirrolidona]. La mezcla se homogeneizó cada 20 min durante 2 horas y se incubaron a 4 ° C durante la noche. El homogeneizado se centrifugó a 15 000 rpm, 4 ° C durante 30 min. El extracto crudo se mantuvo a -20 ° C. Se utilizaron dos etapas de precipitación con sulfato de amonio, que se añadió sulfato de amonio sólido al extracto crudo de
G. procumbens
a 4 ° C hasta que se consiguió el 30% de saturación. El precipitado se eliminó por centrifugación durante 30 min a 13 000 rpm. Posteriormente, se añadió sulfato de amonio sólido de nuevo al sobrenadante restante para alcanzar 70% de saturación y la solución se centrifugó durante 30 min a 13 000 rpm y se recuperó el pellet. Después, el sedimento se volvió a suspender en agua desionizada hasta que esté completamente disuelto. El sulfato de amonio crudo proteínas precipitadas se cargó a una columna de filtración en gel, HiPrep ™ 16/60 Sephacryl ™ S-100 de alta resolución (GE Healthcare) usando ÄKTAprime plus sistema de purificación de proteínas. Las proteínas se eluyeron con fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2 a un caudal de 0,5 mL /min para un volumen total de 180 ml de tampón de elución, se recogió el eluido en las fracciones de 5 ml cada uno. La concentración de proteína se determinó utilizando RC /DC ™ Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories).
SDS-PAGE
sodio dodecil sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) se utilizó para separar las proteínas recogidas. Cada fracción se mezcla con la no reducir [(w /v) de SDS y 0,1% (w /v) azul de bromofenol 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8), 10% (v /v) de glicerol, 0,02%]. Tampón de muestra proceso de electroforesis se realizó a un voltaje constante de 200V. El gel se tiñó con azul de Coomassie.
LDH Ensayo de citotoxicidad
El MDA-MB-231 línea (HTB-26 ™) celular fue una especie de regalo Centro de Investigación John Hopkins, que fue comprada de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se cultivaron en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) (Gibco BRL) suplementado con 10% (v /v) de suero bovino fetal (FBS) (Gibco BRL), 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Gibco BRL ). Las células se incubaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que consistía en 5% (v /v) CO
2. La actividad citotóxica se realizó utilizando el kit de lactato deshidrogenasa (LDH) ensayo de citotoxicidad (Biovision, EE.UU.), LDH es una enzima citoplasmática presente en todas las células, por lo que se libera en el medio de cultivo cuando el daño de la membrana plasmática de la célula tiene lugar. la actividad de LDH se determinó mediante una reacción enzimática acoplada donde LDH lactato a piruvato oxida, el piruvato formado después se hace reaccionar con tetrazolio INT sal para formar farmazan. El aumento en la cantidad de formazan se correlaciona directamente con el aumento en el número de células lisadas. La intensidad del tinte de formazán se midió mediante un lector de ELISA. Un total de 1,0 x 10
5 células /ml de células MDA-MB-231 se sembró en placa de cultivo de 24 pocillos que se incubó a 37 ° C en una atmósfera humidificada que consiste en 5% (v /v) CO
2 hasta que el crecimiento de las células alcanzó aproximadamente 70% de confluencia. El medio de cada pocillo se desechó, las células se lavaron suavemente con PBS y 2% de medio de crecimiento (DMEM suplementado con 2% (v /v) FBS, 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina) se añadió. Las células se trataron con concentraciones crecientes del extracto (por triplicado). El cien por l de medio de cultivo se retiró y la LDH ensayo de citotoxicidad se realizó de acuerdo con el manual proporcionado. El cien por l de medio de cultivo se transfirieron a una placa de inmuno y la mezcla de reacción 100 l (mezcla de catalizador y solución de colorante) se añadió a cada pocillo. La placa se incubó durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. La absorbancia de todas las muestras se midió a 490 nm y la longitud de onda de referencia fue 680 nm. El porcentaje de citotoxicidad se calculó como [(muestra de prueba - bajo control) /(control alto - bajo control)] x 100, donde el bajo control es la absorbancia del medio de cultivo sin adición de cualquier extracto y alto control es la absorbancia del medio de cultivo, donde las células fueron tratadas con 1% (v /v) de Triton X-100 al 100% de liberación de LDH.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Análisis
ARN total fue extraído de las células utilizando el RNeasy Mini Kits (Qiagen, EE.UU.). El ARN total extraído se transcribe de forma inversa a cDNA utilizando la primera hebra de cDNA Kit de síntesis RevertAid (Thermo Scientific). Las expresiones de dos marcadores de proliferación, Ki-67 y PCNA, y dos marcadores de invasión, CCL2 y IL6, se examinaron en las células MDA-MB-231 tratadas y un-tratado utilizando PCR y densitometría gel. Los niveles de ARNm se expresan como la intensidad de la banda de los marcadores de los productos de PCR con respecto a la beta actina de control de producto de PCR. Los cebadores utilizados para las reacciones de PCR fueron las siguientes: antígeno Ki-67, hacia adelante: 5'-AACTATCCTCGTCTGTCCCAACAC-3 ', inversa: 5'-CGGCCATTGGAAAGACAGAT-3'; la proliferación de células antígeno nuclear (PCNA), Adelante: 5'-AGAAGGTGTTGGAGGCACTCA-3 ', inversa: 5'-GGTTTACACCGCTGGAGCTAA-3'; quimiocina (motivo C-C) ligando 2 (CCL2), Adelante: 5'-GCTGTGATCTTCAAGACCATTGTG-3 ', inversa: 5'-AGTGAGTGTTCAAGTCTTCGGAGTT-3'; interleucina 6 (IL-6), Adelante: 5'-CCAGTACCCCCAGGAGAAGATT-3 ', inversa: 5'-CCGTCGAGGATGTACCGAAT-3'; beta actina, Adelante: 5'-CATTGCCGACAGGATGCA-3 ', inversa: 5'-CCGATCCACACGGAGTACTTG-3'. Las reacciones de PCR consistían en 5 l de cDNA (5 ng), 12,5 l de Master Mix, 1 l de cada 20 pmol de avance y retroceso cebadores y DNasa agua /RNasa libre a un volumen final de 25 mL. Las reacciones se fijaron durante 30 ciclos con las siguientes condiciones; pre-amplificación: 94 ° C durante 10 min, la desnaturalización: 94 ° C durante 20 s, hibridación: 55 ° C durante 20 s, extensión: 72 ° C durante 30 s, la terminación: 72 ° C durante 10 min. Cada reacción de PCR se llevó a cabo por triplicado y los productos de PCR se sometieron a electroforesis en 2% (w /v) en gel de agarosa que contiene 0,1 mg /ml EtBr. Las bandas del producto de PCR en el gel fueron capturados utilizando el gen Genius Analizador de Imagen y la intensidad de las bandas se analizó utilizando un software Cantidad (Bio-Rad, EE.UU.).
En la digestión-gel
digestión -gel se realizó utilizando el método descrito por [16]. Las bandas de proteínas fueron extirpados de SDS-PAGE. Las piezas de gel se lavaron con bicarbonato de amonio 100 mM durante 10 min y después con acetonitrilo (ACN) durante 5 min. Esta etapa se repitió dos veces. piezas de gel se secaron en una centrífuga de velocidad al vacío. Se añadieron las piezas de gel secos con DTT 10 mM en bicarbonato de amonio 100 mM y se incubaron durante 1 hora a 56 ° C. Se retiró la solución en exceso. Las piezas de gel fueron incubadas con ácido yodoacético 55 mM en bicarbonato de amonio 100 mM en la oscuridad durante 45 min a temperatura ambiente. Las piezas de gel se lavaron con bicarbonato de amonio 100 mM durante 10 min y después con acetonitrilo (ACN) durante 5 minutos dos veces. Las piezas de gel se trataron con 15 ng /l de tripsina en tampón de digestión [bicarbonato de amonio 50 mM, CaCl 5 mM
2] y se incubaron a 37 ° C durante la noche. Se recogió el sobrenadante de la digestión tríptica y los péptidos restantes se extrajeron 3 veces en 5% (v /v) de ácido fórmico en 30:70 de ddH2O: ACN. Los sobrenadantes se reunieron y se secaron por soplado utilizando gas nitrógeno.
Fase Inversa capilar Cromatografía y Espectrometría de Masas
cromatografía capilar de fase inversa (Acquity Ultra Performance Liquid Chromatography [UPLC]) se acopló con el tiempo- cuadrupolo tándem de vuelo espectrometría de masas (Waters, Milford, MA, EE.UU.), conectado a un calibrador masa exacta LockSpary. fuente de ionización usada fue ESI (ionización por electrospray suave). La muestra se inyectó en el sistema a través de un muestreador automático. Las muestras se inyectaron en un Trizaic UPLC nanoTile (Waters, Milford, MA, EE.UU.) consistió en una columna de captura y una columna capilar. La proteína de digestión se pre-concentrado y se desaló en el cartucho de la columna de captura lleno de 1,8 micras de alta resistencia de sílice de partículas (HSS) a una velocidad de flujo de 8
μ
L /min de 99% de A durante 3 minutos. Los péptidos se eluyeron a continuación en una columna capilar de fase inversa (1,8 micras de partículas HSS, 85 m x 100 mm) a un modo de gradiente de 3% de B a 40% B en 30 min a un caudal de 0,45 l /min. El disolvente A consistía en agua con ácido fórmico al 0,1%, y el disolvente B consistía en acetonitrilo con 0,1% (v /v) de ácido fórmico. El eluato se somete al sistema de MS. Todos los espectros de masas se adquirieron usando el espectrómetro de masas Q-TOF. Los parámetros Q-TOF se establecieron de la siguiente manera: el modo positivo; capilar, 3,2 kV; cono de muestreo, 28,0; cono de extracción, 2,0; temperatura de la fuente, 70 ° C; temperatura de desolvatación, 200 ° C; flujo de gas del cono, 40,0 L /h; flujo de gas de desolvatación, 600,0 l /h; tiempo de exploración, 0,2 s. Los espectros se registraron a partir de
m /z página 2 de 1200. El ajuste externo se aplicó a todos los datos utilizando [Glu1] norma B -Fibrinopeptide (Waters). adquisición de exploración encuesta se realizó en línea con separación por cromatografía capilar; una TOF-MS de exploración inicial fue adquirida en el rango de masa de 2 a 1.200 m /z cada segundo, con criterios de conmutación para MS a MS /MS que incluye la intensidad de iones (100 cuentas /s) y el estado de carga (2). MS /MS de ión precursor seleccionado fue adquirida en todo el rango de masas de 50-1600 m /z. La energía de la colisión fue de 6 eV.
Identificación de proteínas
Búsqueda de base de datos se realizó en los datos de MS /MS generados usando todo el orden taxonomía
Viridiplantae
bajo la base de datos SwissProt. la tolerancia y la tolerancia péptido de masas de fragmentos se fijaron en 0,1 BDA y 2 Da, respectivamente, y sólo se permite una escisión perdida. cisteína carbamidometilada se estableció como la modificación fija, mientras que la metionina oxidada se fija como variable modificación.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± error estándar (SE) de tres experimentos indepent y el análisis estadístico se realizado mediante la prueba t de Student. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
tampón fosfato leve se utilizó para extraer proteínas de la hoja de
G.. procumbens
con el fin de evitar la desnaturalización de las proteínas.
in vitro
estudio bioactividad indicó que el extracto de hoja de crudo liofilizado de
G. procumbens
poseían actividad anti-proliferación contra la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231. Por lo tanto, el fraccionamiento del extracto de proteína se realizó con el fin de aislar la proteína (s) de interés. precipitación con sulfato de amonio se emplea como el primer paso en la purificación de las proteínas como el método es no desnaturalizante de proteínas, este método de precipitación con sal está dirigido a eliminar los compuestos de bajo peso molecular a partir del extracto [17]. Las proteínas sal precipitada se sometieron a filtración en gel, en donde la separación adicional de proteínas de acuerdo con el tamaño se llevó a cabo. El eluato de la cromatografía de filtración en gel se recogió en fracciones de 5 ml de volumen cada uno. Todas las fracciones se ensayaron para determinar la actividad anti-proliferación contra línea celular de cáncer de mama, MDA-MB-231
in vitro
. Se detectó actividad anti-proliferación fuerte en las fracciones 11 y 12, donde la fracción 11 se componía de la 51
st a 55
TH ml eluato mientras que la fracción 12 se recogió de la 56
º a 60
º eluato ml (Figura 1) de un total de 180 ml de tampón de elución utilizado. La Figura 2 muestra el análisis de SDS-PAGE de las fracciones 9 a 14.
La separación de filtración en gel se realizó con HiPrep 16/60 HR columna Sephacryl S-100. Las fracciones de proteínas se eluyeron con fosfato de sodio 50 mM, pH 7,2, y la velocidad de 0,5 ml /min de caudal. Las fracciones de proteínas activas 11 y 12 se eluyeron en el plazo de 50 ml a 60 ml de tampón de elución.
Nuestro análisis preliminar encontró que las fracciones 11 y 12 poseían actividad anti-proliferación de MDA-MB-231. Ambas fracciones 11 y 12 mostraron perfiles de proteínas idénticas.
Las fracciones 11 y 12 se reunieron y se denomina SN-F11 /12. ensayo de LDH citotoxicidad se realizó en la línea celular MDA-MB-231, donde la célula se trató con SN-F11 /12. La figura 3a muestra el porcentaje de LDH liberada en los medios de cultivo que fueron tratadas con diferentes concentraciones (5-25 mg /ml) de SN-F11 /12, los tratamientos se llevaron a cabo durante 24, 30, 36, 42 y 48 horas y después de cada período de tratamiento el porcentaje de LDH liberada a los medios se midió. La concentración efectiva (
50 CE) valor se define como la concentración expresada en mg /ml de proteínas en el extracto que inhibía el 50% del crecimiento celular. CE
50 valores para diferentes períodos de tratamiento se determinaron y se muestran en la figura 3b, de la que la constante de CE
50 valor de SN-F11 12 fue encontrado /estar en 3,8 mg /ml de proteínas.
Cada curva de la liberación de LDH% se representó frente respectivo punto de tiempo de tratamiento. El valor B. CE50 se representó frente respectivo punto de tiempo de tratamiento para la determinación del valor de EC50 constante. El valor CE50 constante de SN-F11 /12 sobre MDA-MB-231 fue de 3,8 mg /ml.
Una evaluación más profunda del mecanismo anti-proliferación exhibida por SN-F11 /12 sobre MDA-MB -231 se realizó mediante la técnica de PCR, donde se utilizó el valor CE50 constante determinada para el tratamiento de las células MDA-MB-231 y posteriormente la expresión de dos marcadores de proliferación, Ki67 y PCNA, fueron examinados. beta actina se utilizó como control de carga. La expresión de Ki-67 y PCNA se encontró el regulado en comparación con las células cultivadas sin tratamiento (Figura 4a). Ki-67 expresión se redujo significativamente en MDA-MB-23 de células después del tratamiento 36 y 48 horas con SN-F11 /12 en comparación con las células no tratada. La expresión de PCNA entre célula tratada-un tratado y no fue significativamente diferente aunque el SN-F11 /12 células tratadas expresa niveles más bajos de PCNA (Figura 4b).
Las figuras muestran la expresión de ARNm normalizada de (A) Ki67 y (B) PCNA en las células MDA-MB-231 tratadas. La expresión del ARNm del gen diana se normalizó a la expresión de ARNm de beta-actina. Cada dato representa la media ± SE de tres experimentos independientes. Se determinó el análisis estadístico utilizando
t
test de Student con *
p
. & lt; 0,05 como significación estadística, en comparación con las células no tratadas en cada punto temporal
además de los marcadores de proliferación, la expresión de dos marcadores de invasión, CCL-2 e IL-6 se examinado también utilizando la técnica de PCR. La expresión de CCL2 en células MDA-MB-231 se redujo reguladas después de SN-F11 /12 de tratamiento en comparación con la no tratada celular (Figura 5a). Por el contrario, la expresión de IL-6, que normalmente está implicado en la promoción de la invasión de células, fue encontrado hasta reguladas siguiente SN-F11 /12 tratamiento (Figura 5b).
Las figuras muestran la expresión de ARNm normalizado de (a) CCL2 y (B) IL6 sobre las células MDA-MB-231 tratadas. La expresión del ARNm del gen diana se normalizó a la expresión de ARNm de beta-actina. Cada dato representa la media ± SE de tres experimentos independientes. Se determinó el análisis estadístico utilizando
t
test de Student con *
p
. & lt; 0,05 como significación estadística, en comparación con las células no tratadas en cada punto temporal
SDS-PAGE de proteínas de perfiles en SN-F11 /12 mostró la presencia de 15 bandas de proteínas, cada banda se escindió por digestión en gel y los péptidos trípticos-digerido se analizaron mediante LC /Q-TOF. La figura 6 muestra el perfil de SDS-PAGE de la fracción activa SN-F11 /12 y la proteína identificada se enumeran en la Tabla 1, 13 bandas de proteínas se identificaron con éxito, mientras que 2 bandas de proteínas mostraron ningún golpe de proteínas.
La proteína identificada bandas fueron numerados como se indica a la derecha. El análisis identificó 15 bandas de proteínas en el gel.
Discusión
Antes, compuestos de bajo peso molecular a partir del extracto etanólico de hojas y extracto acuoso de hojas de
G. procumbens
fueron mostrados para inhibir el crecimiento de la línea celular de cáncer de mama T47D [9] y la proliferación celular mesangial humana [18], respectivamente. Hasta la fecha, no hay información sobre la bioactividad de extracto de proteína de la hoja de
G. procumbens
. Este es el primer informe que revela la propiedad citotóxica de las proteínas de las hojas de
G. procumbens
. En este estudio, los extractos de proteína de hoja de
G. procumbens
fueron sometidos a unos pasos de purificación antes de ser usado para la prueba. Los extractos se sometieron a precipitación de la sal primero para eliminar los compuestos de bajo peso molecular, mientras que las proteínas se salan como pellet. El sedimento se muestra para mostrar la actividad citotóxica sobre la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 como se observa bajo un microscopio invertido. Posteriormente, el sedimento se sometió a purificación por cromatografía de filtración en gel para la eliminación de la sal y también para una separación adicional de proteínas de acuerdo con el tamaño [17]. Después de esto, las fracciones de proteínas activas 11 y 12 mostraron tener perfiles de proteínas idénticas y que se agruparon como SN-F11 12 fracción /. Se encontró SN-F11 /12 para exponer una potente actividad citotóxica en células MDA-MB-23 línea celular de cáncer de mama como se evaluó mediante el ensayo de citotoxicidad LDH.
Los datos obtenidos a partir del ensayo de citotoxicidad LDH indican que SN-F11 /12 se muestra la propiedad inhibidora potente sobre el crecimiento de células MDA-MB-231 con un valor de EC50 constante de 3,8 mg /ml. El efecto anti-proliferativo de SN-F11 /12 fue revelado por la supresión de los ARNm de dos marcadores de proliferación, a saber, Ki67 y PCNA, que son esenciales para la replicación del ADN [20]. Tanto los marcadores del ciclo celular son los genes relacionados que comúnmente se utilizan en la evaluación de los
in vitro
anti-proliferativa de las drogas [19]. Ki67 es un antígeno nuclear expresada en G1, G2 y M fases [20] mientras PCNA se expresa en G1, G2 y las fases S [21] de ciclo celular. Nuestros resultados muestran la expresión diferencial de estos dos marcadores en SN-F11 /12-tratada y no tratada células MDA-MB-231, en donde la expresión de Ki67 mRNA fue significativamente (p & lt; 0,05) las reguladas en este último mientras que el no parecía reducción de la expresión de ARNm de PCNA diferir significativamente. Ki67 y PCNA tienen características distintas y la vida media [22]. En general, la expresión de Ki67 se indica únicamente la proliferación celular, mientras que la expresión de PCNA, además de la proliferación celular, también indica la reparación del ADN o la muerte celular. La observación de los diferentes niveles de Ki67 mRNA y mRNA PCNA podría atribuirse a la vida media de PCNA, que es 20 veces más que la de Ki67. Por otra parte, la proteína PCNA se encuentra ciclo celular poste y la muerte celular. La detección de PCNA después de la muerte celular puede ser la razón de la expresión de PCNA diferencial insignificante entre las células MDA-MB-231 SN-F11 /12 tratados con y un-tratado. Por lo tanto, el efecto antiproliferativo de SN-F11 /12 sobre células MDA-MB-231 es probablemente correlacionada con Ki67 y PCNA, los índices de proliferación de uso común para
in vitro
estudio.
CCL2 e IL6 están involucrados en la invasión de las células cancerosas. En el proceso de desarrollo del cáncer, CCL2 junto con el factor macrófago estimulante de colonias (M-CSF) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) juegan un papel activo para reclutar monocitos de la sangre circulante al sitio del tumor, en donde los monocitos reclutados se diferenciarán en macrófagos asociados a tumores (TAM) y establecen una relación simbiótica con las células tumorales. Posteriormente, el TAM se secretan factores de crecimiento tales como EGF, TGF, FGF, VEGF, IL1, TNF e IL6 que promueven la proliferación de células tumorales, invasión y metástasis [23]. Las expresiones de ARNm de los dos marcadores de invasión, CCL2 y IL6, fueron inversamente entre sí. La expresión de CCL2 ARNm se redujo reguladas, mientras que la expresión de ARNm de IL-6 fue hasta reguladas en las células F11 /SN-12 tratadas con MDA-MB-231. CCL2 es una de las quimiocinas esenciales para el desarrollo del cáncer de mama y la progresión [24]. La sobreexpresión de CCL2 promueve la metástasis del cáncer de mama [25]. Por el contrario, la inhibición de CCL2 y su vía de señalización del receptor reduce la metástasis
in vivo
y prolonga la supervivencia de ratones portadores de tumores [26]. IL6 es una interleucina que juega un papel clave en la fisiopatología de varios tipos de cáncer y diversos trastornos inflamatorios del sistema inmune [27]. IL6 sobre-expresión ha sido implicada en la génesis tumoral del mieloma múltiple, de ovario, de células renales, de próstata, cervical y de mama carcinomas [28], [29], [30], [31]. En un estudio anterior, se informó de CCL2 para contribuir al desarrollo de la fibrosis pulmonar mediante la reducción de los niveles de IL6 [32]. En este estudio, el tratamiento de MDA-MB-231 células con SN-F11 /12 disminuyó la expresión de CCL2 mRNA en las células. Por el contrario, la expresión de IL6 mRNA en las células MDA-MB-231 SN-F11 /12 tratados con fue hasta reguladas en comparación con las células de un-tratado. Como IL6 se ha demostrado que es una citoquina pleiotrópica tanto con la actividad inhibidora de tumores promoviendo y [33], la sobre regulación de la expresión de IL-6 ARNm en las células MDA-MB-231 SN-F11 /12 Teñidos puede causar una efecto inhibidor del crecimiento de la línea celular de cáncer de mama
.
Como SN-F11 /12 ha mostrado resultados prometedores de la lucha contra la proliferación y la lucha contra la invasión de las células MDA-MB-231, se evaluó adicionalmente la fracción proteica por SDS-PAGE y análisis de espectrometría de masas. Fuera de las doce proteínas identificadas en la clase SN-F11 /12, dos proteínas, es decir, superóxido zinc superóxido de cobre (Cu, Zn-SOD) y Toll interleucina 1 Receptor-Nucleotide Binding Site-Leu-Rich Repeat (TIR-NBS-LRR) proteína de resistencia a las enfermedades pertenecía a la categoría de proteínas de defensa de las plantas. Estas proteínas de defensa planta también se han detectado en
Corydalis cava
tubérculos extraer donde fueron encontrados para inhibir el crecimiento de la línea celular HeLa [34]. La superóxido dismutasa (SOD) es un antioxidante que cataliza la dismutación de radicales aniónicos de superóxido en peróxido de hidrógeno y oxígeno [35]. La proteína pertenece al grupo metaloenzima en la que la actividad se basa en ion metálico en forma de Cu, Zn-SOD, Mn-SOD y Fe-SOD [36]. Zhang
et al
. (2002) [37] informaron de que la sobreexpresión de Cu, Zn-SOD suprime el crecimiento de células tumorales humanas. Sin embargo, Cu, Zn-SOD extraído de ajo representada efecto antagonista a la doxorrubicina, uno de los fármacos anti-cáncer que se usan más comúnmente, alivia la citotoxicidad medicamento contra el cáncer en las líneas de células tumorales [38], [39]. En nuestro estudio, Cu, se detectó Zn-SOD en cuatro bandas de proteínas diferentes de SN-F11 /12. Sin embargo, si Cu, Zn-SOD es la proteína que contribuye a la propiedad anti-cáncer de la fracción de proteína activa SN-F11 /12 requiere una evaluación adicional.
La clase TIR-NBS-LRR de resistencia a las enfermedades ( R), las proteínas se ha informado a desempeñar un papel crucial en la muerte celular programada como parte del sistema inmune planta [40]. El NBS dominios de actividad ATPasa exhibición mientras que el dominio LRR se conoce para mediar proteína-proteína y las interacciones proteína-ligando. La clase TIR-NBS-LRR de las proteínas de resistencia a enfermedades (R) también está implicado en el reconocimiento específico de derivada del patógeno inductor [41]. En el reino vegetal, el dominio TIR que está presente en el extremo N-terminal de las proteínas R lleva la NBS y LRR, mientras que sea necesario para la muerte celular de señalización [42].
ascorbato peroxidasa (APX) es una planta proteínas de defensa que también se detectó en SN-F11 /12. APX, junto con la glutatión peroxidasa y catalasa, conforman las enzimas antioxidantes que están involucradas en la desintoxicación de peróxido de hidrógeno (H
2O
2). Después de la formación de peróxido de hidrógeno a través de la reacción enzimática de SOD, la desintoxicación de peróxido de hidrógeno se lleva a cabo por estas enzimas antioxidantes, que catalizan la conversión de peróxido de hidrógeno en agua [43]. Una relación de equilibrio de SOD a las enzimas antioxidante es un necesario para el correcto funcionamiento de la célula, donde los altos niveles de SOD con respecto a las enzimas antioxidantes dará lugar a una acumulación de radicales superóxido que son tóxicos para las macromoléculas, mientras que bajos niveles de SOD relativa a las enzimas antioxidantes se traducirá en un aumento de la concentración de peróxido de hidrógeno que se convierte posteriormente en hidróxido radical (-OH), una especie muy reactivo que es responsable del daño oxidativo de la célula [37].
Malate deshidrogenasa fue la proteína más abundante detectado en la fracción de proteína activa de SN-F11 /12, ya que se detectó en siete de las bandas de proteína de SDS-PAGE. Malato deshidrogenasa cataliza una NAD reversible
+ - reacción dependiente de la deshidrogenasa en el ciclo de Krebs [44]. Kim
et. al
(2008) [45] reveló que la actividad de la malato deshidrogenasa es antagonizado por la actividad de la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa en la dehidroepiandrosterona (DHEA) tratados ratas carcinoma hepatocelular.